ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Mangel på standardisering for murine væv behandling mindsker kvaliteten af murine histopatologiske analyse i forhold til humant prøvemateriale. Vi præsenterer her, en protokol for at udføre histopatologisk undersøgelse af murine betændte og uninflamed Colon væv vise gennemførligheden af robotsystemer rutinemæssigt anvendes til forarbejdning og indlejring menneskelige prøver.
Abstract
Forståelse for menneskelige sygdomme er blevet stærkt udvidet takket være studiet af dyremodeller. Ikke desto mindre skal histopatologisk vurdering af eksperimentelle modeller være så strenge som der er ansøgt om menneskelige prøver. Faktisk, pålidelige og præcise konklusioner er kritisk påvirket af kvaliteten af væv afsnittet forberedelse. Her, beskriver vi en protokol for histopatologiske analyse af murine væv, der implementerer flere automatiserede trin under proceduren, fra den indledende forberedelse til paraffin indlejring af murine prøverne. Reduktion af metodologiske variabler gennem streng protokol standardisering fra automatiserede procedurer bidrager til øget samlede pålidelighed af murine patologiske analyse. Specifikt, denne protokol beskriver udnyttelse af edb-behandling og indlejring robotsystemer, rutinemæssigt anvendes til forarbejdning af væv og paraffin indlejring af menneskelige prøver for at behandle murine modeller af tarmbetændelse. Vi konkludere, at pålideligheden af histopatologisk undersøgelse af murine væv er steget betydeligt efter indførelsen af standardiserede og automatiserede teknikker.
Introduction
I de sidste årtier, er blevet udviklet flere eksperimentelle modeller for at dissekere de patogene mekanismer, der fører til menneskelige sygdomme1,2. For at vurdere sværhedsgraden af en sygdom, forskere vurderer effekten af en behandling og studere de cytologiske og histologiske arkitektoniske variationer eller mængden af betændelse3. Hvis du vil udføre på disse eksperimentelle modeller, er detaljerede histopatologiske analyser nødvendige, ofte sammenligne murine og menneskelige prøver4,5.
Derudover menneskelige prøver er almindeligt behandles og scoret af histopatologi core faciliteter og erfarne menneskelige patologer gennem standardiseret histopatologiske kriterier og metoder. Omvendt, murine væv er normalt fast, integreret og analyseres af forskere med begrænset erfaring med histopatologiske protokoller. Kvaliteten og pålideligheden af histopatologiske undersøgelse begynder med forberedelsen af høj kvalitet væv sektioner. Flere faktorer bidrage kritisk til at øge eller mindske kvaliteten af den endelige analyse, herunder fiksering, makroskopiske skæring, behandling, paraffin indlejring, og indlejring af prøver6,7.
Alle disse passager, der involverer manipulation af prøven er udsat til manuel fejl, herunder manuelle indlejring af prøverne og i mindre grad, manuel mikrotomen skæring og farvning. På nuværende tidspunkt bygger hele processen med murine væv forberedelse til histologisk vurdering på protokoller, der varierer fra laboratorium til laboratorium og manuel protokoller. Målet med denne undersøgelse er at gennemføre standardiseret automatiseret protokoller for at reducere fejl og variabilitet i murine histopatologiske undersøgelse.
Til vores viden beskriver vi her de første protokoller for fuldautomatisk væv forarbejdning og indlejring til histologisk vurdering af murine væv; disse bruges rutinemæssigt i patologi enheder til analyser af humant prøvemateriale. Som et praktisk eksempel på mulighederne for metoden, en murine model af tarmbetændelse er blevet analyseret, dvs, modellens kronisk colitis forårsaget af gentagen indgift af dextran natriumsulfat (DSS) i drikkevand8 ,9. Denne eksperimentelle indstilling nøje ligner menneskelige inflammatoriske tarm sygdomme (IBD)10 da DSS-behandlede dyr udviser tegn på tarmbetændelse, fx vægttab, løs afføring eller diarré, og afkortning af colon samt fibrose 8,9,11. Som observeret for menneskelige IBD patienter, genererer DSS behandling en kompleks sygdomsforløb. I forbindelse skal udarbejde histologiske evalueringer forstå den dybtgående ændring af væv arkitektur. Således implementeringen af de beskrevne protokoller for at øge prøve præparationskvalitet kan gavne forskere bygger på fortolkning af histologiske og immunhistokemisk analyse for murine eksperimentelle indstillinger. Murine eksperimentelle modeller af menneskelige sygdomme der involverer ændringer af væv arkitektur, tilstedeværelsen af cellevæv infiltrere eller betændelse i forskellige væv og organer (tarmen, hjerne, lever, hud) kunne bruge øget kvaliteten af den prøveforberedelse til histopatologisk undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Animalske procedurer blev godkendt af det italienske sundhedsministerium (Auth. 127/15, 27/13) og fulgt dyrs pleje retningslinjer for det Europæiske Institut for onkologi IACUC (institutionelle dyrs pleje og brug Udvalget)
1. kronisk Colitis induktion af gentagne DSS Administration
- Separat alder og køn matchede mus i 2 grupper (behandling DSS vs kontrol H2O, mindst 5 mus littermates pr. eksperimentelle gruppe).
- Administrere 2,5% DSS (40 kDa) i drikkevand i 7 dage til gruppen behandling og vand til kontrolgruppen.
Bemærk: Denne model inducerer en kronisk transmural tarmbetændelse9. - Efter 7 dage, stoppe DSS behandling og give vand til begge grupper for 14 dage. Gentag denne proces 3 gange.
Bemærk: Gentagen administration af DSS inducerer ændringer i Colon slimhinden der ligner den menneskelige IBD, dvs, fibrose9. - Ofre mus efter de procedurer, der er godkendt af den institutionelle IACUC, dvs., af CO2 indånding.
- Åbne musen maven og bughinde med en skalpel.
Bemærk: Sterilitet er anbefalede men ikke strengt påkrævet. - Adskille tyktarmen fra tyndtarmen med pincet og pincetter. Punktafgifter tyktarmen med pincet og pincet.
Bemærk: Kolon længde måling (figur 1A) er en metode til at bestemme, hvis colitis opstod i DSS-behandlede mus. - Skylle tyktarmen i en petriskål med 10 mL koldt 1 x fosfat buffer saltvand (PBS), og tryk forsigtigt fjerne fækal materiale.
2. murine væv fiksation
- Fordyb hver murine kolon modellen i 10 mL 10% Neutral Buffered Formalin (NBF) på RT (stuetemperatur).
Bemærk: Sterilitet er anbefalede men ikke strengt påkrævet. - Fix væv i 18 – 24 timer på RT.
3. kolon afsnitsinddeling og væv forberedelse
- Fjerne faste væv fra NBF beholder med en lille pincet og læg dem i en petriskål. Sætte tyktarmen på en skæring arbejde tallerken med en lille pincet.
- Skære koloner i fragmenter (0,2 cm til 0,3 cm længder) med en steril skalpel. Dette fragment længde er optimal for ikke at overstige tykkelsen af kassetten.
- Afhente en kolon segment med en lille pincet (figur 2A). Indsæt et kolon segment i en plastik fremspringende tips af orienteret paraffin indlejring kassette med en lille pincet (figur 2B).
- Gentag handlingen (3.2-3.3) med en yderligere 3 kolon segmenter per kassette. Undgå at indsætte segmenterne i tilstødende fremspringende tips, til at minimere overlapning af væv
- Stramt lukke kassetten ved forsigtigt at skubbe de fire kanter (figur 2 c). Undgå at klemme væv for at forhindre vævsskade.
- Indsætte gitteret i en plastik stativet. Label stativet for at identificere prøven. Gentag for hver biologisk prøve.
4. væv behandling
- Slå den automatiserede processor ved at skubbe afbryderknappen (figur 3A, 3B).
- Varm op til 1 time at sikre paraffinvoks smelter. Vent, indtil instrumentet bekræfter paraffin er helt smeltet, ved at observere tilstedeværelsen af dedikerede ikonet (figur 3 c).
- Indsætte hver orienteret kassette (som indeholder væv prøver) manuelt i metal kurven leveres af den automatiserede processor (figur 3D). Placer kassetter lodret ved foring dem tæt på ene til den anden til at optimere kurv belægning.
- Luk metalkurv (figur 3).
- Åbn låget af retorten (figur 3F). Svar på tiltale er det sted, hvor kurven er indsat i maskinen. Indsæt kurven i den dedikerede boliger af processor (figur 3 g). Luk låget af retorten (figur 3 H).
- Brug touchscreen på computeren, instrument til at definere arbejde protokollen (figur 3I). Vælg sekvensen af løsninger, timing og temperatur skal gennemføres ifølge den ordning, der er omhandlet i tabel 1.
- Tildele protokol til at køre på retorten indeholdende kurven ved at klikke på ikonet dedikeret computer (figur 3J). Start protokollen ved at klikke på Knappen Start (figur 3 L).
- Vent, indtil instrumentet bekræfter slutningen af protokollen, ved at observere tilstedeværelsen af ikonet dedikeret og ved at høre alarmtonen kommer fra maskinen.
- Åbn retorten låget. Fjerne kurven fra processor (figur 3 M).
5. Vævscentre indlejring
- Slå den automatiserede embedder ved at skubbe afbryderknappen (figur 4A).
- Varm op til 1 time at sikre paraffinvoks smelter. Vent, indtil instrumentet bekræfter paraffin er helt smeltet ved at observere temperatur af paraffin bad angivet med det indre termometeret af instrumentet.
- Manuelt overføre alle de forarbejdede kassetter fra processor kurv til embedder rack. Hver rack kan indeholde op til 32 kassetter. (Figur 4B, 4 C).
- Åbn den vigtigste embedder låg (figur 4 c, 4 D, 4E).
- Brug touchscreen på instrument computer for at signalere at de robotic system, som et rack bliver indsat (figur 4F).
- Åbn inlet boliger låg (figur 4 g). Indsæt rack i inlet boliger. Hver embedder kan indeholde op til 4 stativer samtidigt (figur 4 H, 4I). Luk inlet boliger låg (figur 4J).
- Brug touchscreen på instrument computer for at starte proceduren indlejring ifølge tabel 2 (fig. 4 K).
Bemærk: Hver rack af 32 kassetter tager 45 min integreres. - Vent, indtil instrumentet bekræfter slutningen af protokollen, ved at observere tilstedeværelsen af dedikerede ikonet (figur 4 L).
- Fjerne outlet rack (figur 4 M). Slutning den vigtigste embedder låg.
- Fjerne de indlejrede blokke (som indeholder orientering gitre) fra rack. Overføre de indlejrede blokke i en pap opbevaringsboks.
6. mikrometer skæring
- Tænd den afkøling plade af mikrotomen. Indstil temperaturen mellem -8 og -10 ° C.
- Tænde et Termostatstyret vandbad mikrotomen, der indeholder 2 L destilleret vand. Indstille temperaturen i vandbad mellem 42-45 ° C.
- Sted paraffin indlejret blokke på køling pladen. Vent mindst 5 min til at tillade blokke til at afkøle.
- Tage en blok fra den afkøling plade og Anbring det i mikrotomen blok indehaveren.
- Indstille mikrotomen skære tykkelse til 10 µm. Trim blokken ved at skære det 6 gange på 10 µm tykkelse.
- Ændre indstillingen tykkelse af mikrotomen fra 10 µm til 3 µm. Cut én 3 µm sektion for hæmatoxylin og Eosin (H & E) farvning.
-
Indsamle afsnittet 3 µm med en lille børste. Sætte afsnittet 3 µm i vandbad, om det omhyggeligt på vandoverfladen at reducere væv rynker. Indsamle afsnittet væv fra et Termostatstyret vandbad på et enkelt glas dias.
- Du kan eventuelt skære yderligere sektioner.
- Label glas dias ved at skrive prøve identifikation.
- Sæt dias i et 37 ° C ovn i mindst 10 min.
- Sætte glas dias ind i stativer for øjeblikkelig analyser eller i opbevaringskasser.
7. hæmatoxylin og Eosin (H & E) farvning
- Tænd den automatiserede stainer ved at skubbe afbryderknappen. Tillad initialisering af robotarmen, ved at observere ændringen af loading bar på instrument skærm.
- Indsæt glas dias i stainer rack, lodret indsætte op til 30 dias.
- Label rack med passende radio frekvens identifikation (RFID) plastik tag. RFID-tagging er et system, der identificerer de korrekte farvning protokol påfyldt stainer computer.
- Indsæt rack i stainer. Muligt for computeren at indlæse og starte farvning protokollen efter anerkendelse af RFID-tag automatisk.
Bemærk: Protokol for H & E farvning er beskrevet i tabel 3.
8. immunhistokemisk farvning
- Udføre immunhistokemiske og Mallory trichrome farvning som tidligere beskrevet7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eksperimentelle kronisk colitis forårsaget af gentagen indgift af DSS i drikkevandet er en murine model af tarmbetændelse, der ligner den menneskelige IBD8,9. Figur 1 beskriver virkningerne af DSS behandling, herunder colon afkortning (figur 1A), et almindeligt anvendt parameter til score forekomsten på DSS-induceret inflammation, og Colon udtryk af pro-inflammatoriske gener herunder CXCL10 , tnf og mcp-1 (figur 1B). Infiltration af inflammatoriske celler blev styrket af DSS behandling, viser en rekruttering af immunresponset i tarm lamina propria, som analyseret af cytofluorimetry (figur 1 c).
Figur 2 viser hvordan Colon væv er i snit og indsat i de orienteret kassetter. Disse kassetter er designet til at indeholde et gitter med ekstruderet tips, tillade indsættelse af vævet lodret og med den rigtige retning, dvs., med lumen i den inderste del og væggen exteriorly (figur 2A, 2B, 2 C ). Når kassetter er lukket, bevaret væv orientering af gitre, i modsætning til, hvad der sker med konventionelle histologiske kassetter (figur 2B).
Væv behandlingen udføres med en automatiseret processor (figur 3A-3 M og tabel 1), mens den indlejring procedure er udført med en automatiseret embedder (figur 4A-4 M og tabel 2). I den sidstnævnte instrument, en robot indsamler kassetter og doserer den korrekte mængde af paraffin. Endelig, ved hjælp af en mikrotom, sektioner er skåret fra hver paraffin blok. Diasene er derefter klar til yderligere analyse.
Figur 5 beskriver de vigtigste passager af automatiserede H & E farvning (figur 5A-5E og tabel 3), og hvordan diasene vises efter H & E farvning (figur 5F). Figur 6 og 7 viser, hvordan gennemførelsen af edb-behandling og indlejring protokoller stærkt øge kvaliteten af de histopatologiske analyser af murine Colon enheder. H & E stainings af prøver forberedt med protokollerne automatiseret afledt af ubehandlede mus (figur 6A) blev sammenlignet med dem af DSS behandlede mus (figur 6B). Histopatologisk scoringer blev vurderet ved at vurdere ændringerne af forskellige parametre forekommer i tarmslimhinden, herunder inflammatoriske celler infiltration, epithelial ombygninger og ændringer af slimhinde arkitektur som beskrevet i Tabel 4. Figur 6 c skildrer en repræsentant H & E farvning af en Colon væv behandles manuelt og inkluderet i traditionelle kassetter. I figur 7, kvaliteten af murine væv forberedelse og indlejring udføres gennem automatiske instrumenter blev desuden bekræftet af IHC farvning af CD20 og Mallory trichrome farvning8,9 i Colon dele af ubehandlet (figur 7A, 7 C) og DSS-behandlede (figur 7B, 7 D) mus.
Figur 8 beskriver den praktiske relevans af denne metode. Samme kolon prøverne blev behandlet og indkapslet enten manuelt eller via automatiske metoder. Hver prøve (enten kontrolelementet eller DSS-behandlet) blev skåret i 2 lige store dele og behandles sideløbende med manuelt eller automatiske metoder. H & E farvning blev derefter udført og en komplet mikroskopiske evaluering vedrørende alle de patologiske parametre adressering ændringer i slimhinden arkitektur, granulering, immun celle infiltrere, slimhinde tykkelse, glandulær rarefaction normalt observeret under tarmbetændelse, blev vurderet til hver prøve, både til manuel og automatiseret protokol (figur 8A og tabel 4). Forberedelse af prøver med den automatiserede protokol tilladt konsekvent evalueringen af en højere andel af histologiske parametre end den manuelle metode. Derudover en separat analyse af forskellige histologiske parametre blev udført (fig. 8B). Arkitekturen og basal infiltrere evaluering blev positivt påvirket, især i ubehandlede mus, af prøveforberedelse med den automatiserede metode.
Den automatiserede metode til prøve behandling og integrering i øjeblikket anvendes til menneskelige histopatologiske analyser kan være anvendt med succes til analyse af murine prøver. Høj kvalitet prøver er genereret med den automatiserede metode, der viser overlegenhed over den manuelle metode i vurderingen af arkitekturen og de basale immun infiltrere af murine Colon væv.
Figur 1: kronisk tarmbetændelse evaluering. (A) kolon længde måling. (B) Colon udtryk af pro-inflammatoriske gener (cxcl10, tnf, mcp-1) i DSS-behandlede (Sortstål, stænger, n = 12) og ubehandlet mus (hvid barer, n = 6). (C) Immunofænotypning af Colon lamina propria celler i DSS-behandlede (lukket symboler, n = 12) og ubehandlet mus (åbne symboler, n = 6). CD11b + Ly6G + neutrofiler, CD11b + F4 / 80 + makrofager (venstre panel), CD4 + og CD8 + T celler (højre panel) infiltration i kontrolelementer (åbne symboler, n = 10) og DSS-behandlede mus (lukket symboler, n = 10). Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af Wilcoxon matchede par underskrevet rang t test. p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01. Betyde værdi ± SEM er rapporteret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Beskrivelse af prøveforberedelse. (A) instrumenter kræves for væv forberedelse og billede af den orienteret kassette, komponeret af en eksterne kassette (hvid) og interne gitter med ekstruderet orientering tips. (B, C) Indsættelse af murine koloner i de interne net af kassette før (B) og efter (C) lukning af nettene. I panelet B er afbildet den orienteret kassette (venstre) eller i en traditionel kassette (til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Beskrivelse af automatiseret behandling. (A, B) automatiseret processor. (C) ikon der beskriver den korrekte paraffinvoks smeltende temperatur. (D, E) Indsætning af kassette i metalkurv (D) og dens lukning (E). (F, G, H) Indsættelse af metalkurv i retorten. (I, J, K) Valg af behandling protokol. (L) kører i protokollen. (M) fjernelse af kurven form retorten. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Beskrivelse af automatiserede indkapslet . (A) billede af den automatiserede embedder. (B, C) Indsættelse af kassetter i rack. (D, E) Åbning (D) og lukning (E) af låget. (F) signal til maskinen af tilstedeværelsen af et rack. (G, H) Indsættelse af rack ind i fjorden huset. (I, J) lukning af låget. (K) Start indlejring protokollen. (L) åbningen af outlet boliger låg. (M) fjernelse af formen rack outlet boliger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Beskrivelse af automatiserede H & E stainer. (A) billede af lysbilledholderen. (B, C) Indsættelse af diasholderen i maskinen. (D) lukning af maskinen. (E) Start farvnings-protokollen. (F) eksemplificerende billede af et dias efter mikrotomen opskæring og H & E farvning. Højre panel, H & E farvning skildrer prøve orientering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: H & E stainings af Colon prøver danne ubehandlet og DSS-behandlede mus. H & E farvning af ubehandlet (A) og DSS-behandlede (B) prøver forberedt (forarbejdet, indlejret, bejdset) med automatiseret (A, B) eller manuel (C) metoder. Skalalinjen = 100 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Mallory trichrome (A, B) og IHC stainings af infiltrerer CD20 + celler (C, D) af ubehandlet (A-C) og DSS behandlet (B, D) mus. Mallory farvning: blå, kollagen, mørk pink, kerner, mørk rød, cytoplasmaet. Skalalinjen = 100 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: sammenligning mellem histopatologisk analyser med manuel og automatiseret protokoller. (A) samlede histopatologiske parametre vurderbare i alle afsnittene fremstillet enten med manual (hvid barer) eller med den automatiserede metode (lilla barer). (B) andel af de angivne parametre i de prøver, der er fremstillet med manual (hvid barer) eller med den automatiserede metode (lilla barer) i ubehandlet (almindelig barer) eller DSS-behandlede mus (stiplede barer). Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af Wilcoxon matchede par underskrevet rang t test. p < 0,05; p < 0,005. Betyde værdi ± SEM er rapporteret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | tid (min) | temperaturen (° C) | pres |
| NBF | 1 | RT | omgivende |
| Ethanol 95% | 1 | RT | omgivende |
| Ethanol 95% | 1 | RT | omgivende |
| Ethanol 95% | 1 | RT | omgivende |
| Absolut Ethanol | 1 | 45 | omgivende |
| Absolut Ethanol | 11 | 45 | omgivende |
| Absolut Ethanol | 30 | RT | omgivende |
| Xylen | 1 | RT | omgivende |
| Xylen | 1 | 45 | omgivende |
| Xylen | 28 | 45 | omgivende |
| Paraffinvoks | 5 | 65 | vakuum |
Tabel 1: Automatiseret væv behandling protokol.
| Handling perfomed af robot for hver kassette |
| Fjerne en kassette fra rack |
| Identificere kassetten |
| Før varme formen |
| Placer kassetten på formen forvarmet |
| Se bort fra mængden af paraffin for kassetten |
| Køle ned skimmel |
| Tillad paraffin størkne |
| Fjern det størknede paraffin blok fra formen |
| Præsentere blok til kvaliteten sensorer |
| Sted paraffin blokere i udskriftspanel |
Tabel 2: Automatiseret indlejring protokol.
| Kategori | Kriterium | Definition | Score værdi |
| Inflammatorisk celle infiltrere | Sværhedsgraden (leukocyt tæthed af lamina propria område infiltreret i evalueret hpf) | Ingen infiltrere | 0 |
| Minimal akut (< 10%) | 0,25 | ||
| Milde kroniske (10-25%, spredte neutrofiler) | 0,5 | ||
| Moderat kronisk (26-50%) | 0,75 | ||
| Markant (> 51%, tætte infiltrere) | 1 | ||
| Omfang (udvidelse af leukocyt infiltration) | Slimhinde | 0,5 | |
| Slimhinde og submukøse | 0,75 | ||
| Epitelial ændringer | Hyperplasi (stigning i epitelcelle numre i længderetningen Krypter, synlig som krypt brudforlængelse) | Ingen hyperplasi | 0 |
| Minimal (< 25%) | 0,25 | ||
| Mild (26-35%) | 0,5 | ||
| Moderat (36-50%, mitoses i den øverste tredjedel af crypt epitel) | 0,75 | ||
| Markant (> 51%, mitoses i krypten epitel fjernt fra krypten base) | 1 | ||
| Bæger celle tab (reduktion af Flammernes celle numre i forhold til baseline bæger celle numre pr. krypten) | Uden tab | 0 | |
| Minimal (< 25%) | 0,25 | ||
| Mild (26-35%) | 0,5 | ||
| Moderat (36-50%) | 0,75 | ||
| Markant (> 51%) | 1 | ||
| Slimhinde arkitektur | Ulceration (epitelial defekt rækker ud over muscolaris mucosae) | Ingen sår | 0 |
| Mavesår | 0,25 | ||
| Granulationsvæv (bindevæv reparation med nye kapillærer, omgivet af infiltrerer celler, hypertrofisk områder) | Ingen granulationsvæv | 0 | |
| Granulationsvæv | 0,25 | ||
| Slimhinde tykkelse og krypten dybde | Ingen fortykkelse | 0 | |
| Fortykkelse | 0,5 | ||
| Glandulær rarefaction | Ingen rarefaction | 0 | |
| Rarefaction | 0,5 | ||
| Dysplasi | Ingen dysplasi | 0 | |
| Dysplasi | 0,5 | ||
| MAX SCORE | 6 |
Tabel 3: Automatiseret farvning protokol.
| Handling perfomed af stainer for hvert dias | Reagens | tid (s) | temperaturen (° C) |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Deparaffinize | Xylen | 120 | RT |
| Deparaffinize | Xylen | 120 | RT |
| Hydrat | Ethanol 96% | 120 | RT |
| Hydrat | Ethanol 96% | 120 | RT |
| Vask | Destilleret wtaer | 240 | RT |
| Pletten hæmatoxylin | Carazzis hæmatoxylin | 540 | RT |
| Skyl | Vand fra hanen | 360 | RT |
| Pletten Eosin | Eosin Y 1% aqueos løsning | 60 | RT |
| Skyl | Vand fra hanen | 120 | RT |
| Dehydrere | Ethanol 96% | 20 | RT |
| Dehydrere | Ethanol 96% | 20 | RT |
| Dehydrere | Absolut Ethanol | 15 | RT |
| Dehydrere | Absolut Ethanol | 15 | RT |
| Klart | Xylen | 30 | RT |
| Klart | Xylen | 30 | RT |
Tabel 4: Scoring ordning for evaluering af tarmbetændelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi anvender forskellige automatiserede trin under forberedelse af murine væv til histopatologisk analyse. Denne protokol sigter mod at levere teknisk hints til at øge reproducerbarhed og standardisering af hele processen, hvilket vil øge den overordnede kvalitet af de histopatologiske slutevaluering. Vi implementeret automatiske instrumenter og metoder til udarbejdelse og indlejring af væv, rutinemæssigt anvendes i patologi core faciliteter for studiet af humant prøvemateriale.
For at vise potentielle anvendeligheden af denne metode, valgte vi en kronisk murine eksperimentelle indstilling af tarmbetændelse, kaldet DSS-induceret kronisk colitis model. Denne indstilling ligner den komplekse sygdomsforløb observeret i IBD patienter, der kræver omfattende histologisk vurdering at undersøge de dybtgående ændringer af væv arkitektur opstår efter kronisk tarmbetændelse. Histologisk vurdering af disse processer kan helt, stor gavn af øget prøve præparationskvalitet. For at bemærke, kan denne protokol anvendes til andre murine væv (dvs., milt, lymfeknuder, leveren, hjerne), med den eneste forskel er, at den orienterede kassette ikke er nødvendig for væv uden en lumen.
De vigtigste observation var der faldet af manuelle fejl, (dvs., orientering af prøven) givet brug af kassetter med gitre og afskaffelse af kassette genåbning for integrering (et skridt almindeligvis udføres under vejledning protokoller), forbedret stærkt den overordnede reproducerbarhed af analysen. Med protokollen beskrevet her, er prøven manipuleret kun i begyndelsen af forberedelse, når eksperimentatoren indsætter væv i de orienteret kassetter. Når lukket, er kassetter aldrig genåbnes, således at sikre opretholdelsen af den korrekte orientering og reducere manuel fejl3,11. Standardisering af disse to kritiske trin forbedret hele kvaliteten af de efterfølgende analyser og faldt antallet af tabt eller ikke vurderbare prøver, problemer både forbundet med genåbning af kassetten eller den forkerte orientering af prøven3 ,11.
Det lykkedes også at evaluere en komplekse biologiske begivenhed såsom fibrose (figur 7), der er meget ofte undervurderet i murine modeller af eksperimentelle tarmbetændelse, af gennemførelsen af den automatiserede protokol. Under Opsætning af protokollen standardiseret vi strengt tekniske detaljer såsom fiksering tid, som vi indså ikke må overstige 24 timer for at undgå væv ændringer. Dermed kunne vi bevare kvaliteten af efterfølgende immunhistokemiske analyser.
Den automatiserede metode forbedret vurdering af de parametre, der er knyttet til ændring af væv arkitektur, især i ubehandlede mus. Faktisk er en korrekt sammenligning af en patologisk væv med sunde modstykke af afgørende betydning for den endelige vurdering af den eksperimentelle model3.
Hvad angår væv behandling testede vi forskellige protokoller til at køre i den automatiserede processor i laboratoriet. Protokollen beskrevet her gav lyd og meget konsekvente resultater. Vi har også implementeret en tidslængde for protokollen. Da murine prøver var sammenlignelige med menneskers små biopsic modellerne i størrelse, en kortere protokol var tilstrækkelig til at behandle murine (tarm, i dette tilfælde) væv. Endelig, den hele automatiseret procedure reduceret den samlede eksperimentelle tid. Fra begyndelsen af behandlingen mikrotomen opskæring og skiver forberedelse beregnet vi at den totaltid krævede er 5 h. Tværtimod, afhængigt af den tekniske mulighed for operatøren, kan færdiggørelsen af de samme protokoller manuelt kræve mere end fordoble mængden af tid, især under behandlingen og integrering. En begrænsning af teknik er, at det kræver automatiseret processorer og embedder skal udføres for at være i laboratoriet.
Afslutningsvis mener vi, at gennemførelsen af disse automatiserede protokoller stærkt kunne rette op på arbejdet i translationel forskere beskæftiger sig med murine eksperimentelle modeller af sygdomme hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Institut for patologi af IRCCS Policlinico Hospital, Milano for teknisk support og IEO dyr facilitet for bistand i husdyrhold.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10x | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1x | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. A Practical Guide to Frozen Section Technique. , New York, N.S.N.Y. (2010).
- Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , Elsevier. (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
Tags
Immunologi og infektion spørgsmålet 143 histopatologiske analyse murine modeller automation integrering af systemet standardisering murine tarm eksemplarerErratum
Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. An author affiliation was updated.
The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:
Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology
to:
Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS
