ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Gebrek aan standaardisatie voor lymfkliertest bewerking vermindert de kwaliteit van lymfkliertest histopathologisch analyse ten opzichte van menselijke specimens. Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van histopathologisch onderzoek van lymfkliertest ontstoken en uninflamed Colon weefsels te tonen van de haalbaarheid van robotic systemen routinematig gebruikt voor het verwerken en menselijke specimens te embedding.
Abstract
Het begrip van ziekten bij de mens is zeer uitgebreid dankzij de studie van diermodellen. Histopathologisch evaluatie van experimentele modellen moet echter zo streng zijn als die toegepast voor menselijke specimens. Inderdaad, betrouwbare en nauwkeurige conclusies te trekken is kritisch beïnvloed door de kwaliteit van het weefsel sectie voorbereiding. Hier beschrijven we een protocol voor histopathologisch analyse van lymfkliertest weefsels die verschillende geautomatiseerde stappen tijdens de procedure, vanaf de eerste voorbereiding implementeert tot de paraffine inbedding van de lymfkliertest monsters. De vermindering van de methodologische variabelen door middel van strenge protocol standaardisatie van geautomatiseerde procedures draagt bij tot meer algemene betrouwbaarheid van lymfkliertest pathologische analyse. In het bijzonder dit protocol beschrijft het gebruik van geautomatiseerde verwerking en insluiten Robotsystemen, routinematig gebruikt voor de verwerking van het weefsel en paraffine inbedding van menselijke specimens, voor het verwerken van lymfkliertest specimens van darmontstekingen. We concluderen dat de betrouwbaarheid van het histopathologisch onderzoek van lymfkliertest weefsels aanzienlijk is verhoogd bij invoering van gestandaardiseerde en geautomatiseerde technieken.
Introduction
In de afgelopen decennia zijn verschillende experimentele modellen ontwikkeld om te ontleden de pathogene mechanismen die leiden tot ziekten bij de mens1,2. Om te beoordelen van de ernst van een ziekte, moeten onderzoekers evalueren het effect van een behandeling en bestuderen de cytologische en histologische architecturale variaties of het bedrag van ontsteking3. Wilt uitvoeren op deze experimentele modellen, zijn gedetailleerde histopathologische analyses nodig, vaak vergelijken lymfkliertest en menselijke monsters4,5.
Bovendien, menselijke specimens worden meestal verwerkt en scoorde door histopathologie kern faciliteiten en ervaren menselijke pathologen via gestandaardiseerd histopathologisch criteria en methoden. Omgekeerd, lymfkliertest weefsels zijn meestal vaste, ingesloten en geanalyseerd door onderzoekers met weinig ervaring van histopathologische protocollen. De kwaliteit en betrouwbaarheid van histopathologisch onderzoek begint met de voorbereiding van hoogwaardige weefselsecties. Verschillende factoren bijdragen kritisch tot de verhoging of verlaging van de kwaliteit van de uiteindelijke analyse, met inbegrip van fixatie, macroscopische afdelen, verwerking, paraffine insluiten, en inbedding van de monsters6,7.
Alle deze passages met betrekking tot manipulatie van het monster zijn onderworpen aan handmatige fouten, met inbegrip van handmatige inbedding van de monsters en, in mindere mate, handmatige microtoom segmenteren en kleuring. Op dit moment berust het hele proces van lymfkliertest weefsel voorbereiding voor histologisch evaluatie op protocollen die van laboratorium tot laboratorium variëren en handmatige protocollen. Het doel van deze studie is om gestandaardiseerde geautomatiseerde protocollen om fouten en variabiliteit in lymfkliertest histopathologisch onderzoek te verminderen.
Om onze kennis beschrijven we hier de eerste protocollen voor volledig geautomatiseerde weefsel verwerking en insluiten voor de histologische evaluatie van lymfkliertest weefsels; deze worden routinematig gebruikt in pathologie eenheden voor de analyses van menselijke specimens. Een praktisch voorbeeld van de haalbaarheid van de methode, een lymfkliertest model van darmontstekingen heeft zijn geanalyseerd, dat wil zeggen, de chronische colitis model veroorzaakt door herhaalde toediening van dextran natriumsulfaat (DSS) in het drinkwater8 ,9. Deze experimentele instelling nauw lijkt op menselijke ontstoken darm ziekten (IBD)10 aangezien DSS-behandelde dieren tekenen van darmontstekingen, bijvoorbeeld gewichtsverlies, losse ontlasting of diarree en verkorting van de dikke darm, alsmede fibrose vertonen 8,9,11. Zoals opgemerkt voor menselijke IBD patiënten, DSS behandeling genereert een complexe ziekte-cursus. In dit verband, uitgebreide histologische evaluaties dienen te begrijpen van de ingrijpende wijziging van de architectuur van het weefsel. Dus, de uitvoering van de beschreven protocollen voor het verhogen van de sample voorbereiding kwaliteit zouden kunnen profiteren van onderzoekers afhankelijk van de interpretatie van histologische en immunohistochemische analyseert voor lymfkliertest experimentele instellingen. Lymfkliertest experimentele modellen van ziekten bij de mens met betrekking tot wijzigingen van de architectuur van weefsel, de aanwezigheid van cellulaire weefsel infiltreren of ontsteking in verschillende weefsels en organen (darm, lever, hersenen, huid) kon gebruiken de betere kwaliteit van de bereiding van de monsters voor histopathologisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierlijke procedures werden goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van gezondheid (Auth. 127/15, 27/13) en volgde de dierenverzorgers richtsnoeren van het Europees Instituut voor oncologie IACUC (gebruik Comité en institutionele dier zorg)
1. chronische Colitis inductie door repetitieve DSS administratie
- Aparte leeftijd en geslacht gematched muizen in 2 groepen (behandeling DSS vs. controle H2O, ten minste 5 muizen nestgenoten per experimentele groep).
- Beheren van 2,5% DSS (40 kDa) in het drinkwater voor 7 dagen voor de behandelde groep en de controlegroep water.
Opmerking: Dit model induceert een chronische Transmurale darmontstekingen9. - Na 7 dagen, stop DSS behandeling en water geven in beide groepen voor 14 dagen. Herhaal dit proces 3 keer.
Opmerking: Herhaalde toediening van DSS induceert wijzigingen van het Colon mucosa vertonen met menselijke IBD, dat wil zeggen, fibrose9. - Offeren muizen volgens de procedures die zijn geautoriseerd door de institutionele IACUC, d.w.z., bij CO2 inademing.
- Open de muis buik en buikvlies met een scalpel.
Opmerking: Steriliteit is aanbevolen maar niet strikt noodzakelijk. - De dikke darm van de dunne darm scheiden met pincet en pincet. Accijnzen van de dikke darm met pincet en pincet.
Opmerking: Colon lengte meting (figuur 1A) is een methode om te bepalen als colitis voorkwam in muizen DSS-behandeld. - Spoelen van de dikke darm in een petrischaal met 10 mL koude 1 x fosfaat buffer zoutoplossing (PBS) en zachtjes druk op verwijderen fecaal materiaal.
2. lymfkliertest weefsels fixatie
- Onderdompelen van elk lymfkliertest specimen van de dikke darm in 10 mL 10% neutraal gebufferd formaline (NBF) op RT (kamertemperatuur).
Opmerking: Steriliteit is aanbevolen maar niet strikt noodzakelijk. - Vaststellen van het weefsel voor 18 – 24 h op RT.
3. Colon segmenteren en weefsel voorbereiding
- Verwijderen van vaste weefsels van de NBF container met een kleine pincet en leg ze in een petrischaal. De dikke darm zetten met een vectorafbeeldingsbestanden werk-plaat met een kleine pincet.
- Dubbele punten in fragmenten (0,2 cm tot 0,3 cm lengtes) met een steriel scalpel gesneden. De lengte van dit fragment is optimaal om niet hoger zijn dan de dikte van de cassette.
- Een dikke darm segment halen met een kleine pincet (figuur 2A). Invoegen een dubbelpunt segment tot de plastic uitstekende tips van de georiënteerde paraffine insluiten cassette met kleine pincet (figuur 2B).
- Herhaal de handeling (3.2 – 3.3) met een extra 3 dikke darm segmenten per cassette. Vermijd de segmenten invoegen in aangrenzende uitstekende tips, om het minimaliseren van de samenloop van de weefsels
- Strak vlakbij de cassette zorgvuldig duwen de vier randen (figuur 2C). Vermijd knijpen het weefsel om weefselschade te voorkomen.
- Het raster in een kunststof ondersteunend frame invoegen. Label de ondersteunend frame ter identificatie van het monster. Herhaal voor elke biologische steekproef.
4. de weefsels Processing
- De geautomatiseerde processor inschakelen door te drukken van de knoop van de macht (figuur 3A, 3B).
- Warm up for 1 h om paraffine smelten. Wacht totdat het instrument dat de paraffine is volledig gesmolten bevestigt, door het observeren van de aanwezigheid van het specifieke pictogram (Figuur 3 c).
- Elke georiënteerde cassette (met de specimens weefsel) handmatig invoegen op de metalen mand geboden door de geautomatiseerde processor (figuur 3D). Plaats de cassettes verticaal door de voering ze dicht bij de ene naar de andere voor het optimaliseren van de bezetting van de mand.
- Sluit de metalen mand (figuur 3E).
- Open het deksel van de retort (figuur 3F). De retort is de plek waar de mand wordt ingevoegd in de machine. Plaats de mand in de speciale behuizing van de processor (Figuur 3 g). Sluit het deksel van de retort (Figuur 3 H).
- Gebruik het scherm van de aanraking op de computer van het instrument om te definiëren het protocol werken (figuur 3I). Kies de volgorde van de oplossingen, timing en temperatuur moeten worden uitgevoerd volgens de regeling in tabel 1.
- Het protocol moet worden uitgevoerd op de retort met de mand door te klikken op het pictogram (figuur 3J) van specifieke computer toewijzen. Het protocol start door te klikken op de Knop Start (Figuur 3 L).
- Wacht totdat het instrument het einde van het protocol, bevestigt door het observeren van de aanwezigheid van het specifieke pictogram en door te luisteren naar de alarmtoon uit de machine.
- Open het deksel retort. Verwijder de mand van de processor (Figuur 3 M).
5. de weefsels insluiten
- De geautomatiseerde embedder inschakelen door te drukken van de knoop van de macht (figuur 4A).
- Warm up for 1 h om paraffine smelten. Wacht totdat het instrument dat de paraffine is volledig gesmolten bevestigt door het observeren van de temperatuur van de Paraffinebad aangegeven door de interne thermometer van het instrument.
- Handmatig overbrengen alle de verwerkte cassettes uit de korf processor het embedder-rack. Elk rack kan maximaal 32 cassettes bevatten. (Figuur 4B, 4 C).
- Open het deksel van de belangrijkste embedder (figuur 4C, 4 D, 4E).
- Het touchscreen op de instrument-computer gebruiken om het signaal naar de robotic systeem dat een rek wordt ingevoegd (figuur 4F).
- Open het deksel behuizing inlaat (Figuur 4 g). Plaats het rek in de inlaat behuizing. Elke embedder kan gelijktijdig maximaal 4 rekken bevatten (Figuur 4 H, 4I). Het deksel dicht doet inlaat huisvesting (figuur 4J).
- Het scherm van de aanraking op de instrument-computer gebruiken om te beginnen de insluiten procedure, volgens tabel 2 (Figuur 4 K).
Opmerking: Elk rack van 32 cassettes duurt 45 min moet worden ingesloten. - Wacht totdat het instrument het einde van het protocol, bevestigt door het observeren van de aanwezigheid van het specifieke pictogram (Figuur 4 L).
- Verwijder het stopcontact rek (Figuur 4 M). Sluit het deksel van de belangrijkste embedder.
- Verwijder de ingesloten blokken (met de afdrukstand rasters) uit het rek. Overdracht van de ingesloten blokken in een kartonnen opbergdoos.
6. micrometer segmenteren
- De koeling plaat van de microtoom inschakelen. De temperatuur tussen -8 en -10 ° C.
- Zet de thermostaat waterbad van de microtoom, met 2 L gedestilleerd water. Stel de temperatuur van het waterbad tussen 42-45 ° C.
- Plaats de paraffine ingesloten blokken op de koeling plaat. Wacht ten minste 5 min zodat de blokken om te koelen.
- Neem een huizenblok van de koeling plaat en plaats het in de microtoom blok houder.
- Stel de microtoom dikte 10 µm. Trim het blok door het snijden van het 6 keer bij 10 µm dikte snijden.
- Wijzig de instelling van de dikte van de microtoom van 10 µm 3 µm. Cut één 3 µm sectie voor haematoxyline en eosine (H & E) kleuring.
-
Het verzamelen van de sectie 3 µm met een kleine borstel. Zet de 3 µm-sectie in het waterbad, het zorgvuldig leggen op het wateroppervlak te weefsel rimpels verminderen. De weefselsectie van het thermostatisch gecontroleerde waterbad verzamelen op een enkele glasplaatje.
- Indien nodig, snijden extra secties.
- Label het glasplaatje door het schrijven van de identificatie van het monster.
- Zet de dia's in een oven van 37 ° C gedurende ten minste 10 minuten.
- Glas dia's gestoken door rekken voor onmiddellijke analyses of in opslag vakken.
7. de haematoxyline en eosine (H & E) kleuring
- Schakel in de geautomatiseerde stainer door de power-knop te drukken. Laat de initialisatie van de robotarm, door het observeren van de verandering van de laden bar op de monitor van het instrument.
- De glas-dia's in de stainer rack, verticaal maximaal 30 dia invoegen.
- Label het rek met de juiste radiofrequentie-identificatie (RFID) kunststof tag. RFID-tagging is een systeem voor het identificeren van de juiste kleuring protocol in de stainer computer geladen.
- Plaats het rek in het brandschilderen. Toestaan dat de computer automatisch laden en start het kleuring protocol volgens de erkenning van de RFID-tag.
Opmerking: Het protocol voor H & E kleuring wordt beschreven in tabel 3.
8. immunohistochemische kleuring
- Immunohistochemische en Mallory trichrome kleuring zoals eerder beschreven7uitvoeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Experimentele chronische colitis geïnduceerd door herhaalde toediening van DSS in het drinkwater is een lymfkliertest model van darmontstekingen vertonen met menselijke IBD8,9. Figuur 1 beschrijft de effecten van DSS behandeling, met inbegrip van de dikke darm verkorten (figuur 1A), een veel gebruikte parameter te scoren de aanwezigheid van DSS-geïnduceerde ontsteking en Colon expressie van pro-inflammatoire genen met inbegrip van CXCL10 , tnf en mcp-1 (figuur 1B). Infiltratie van ontstekingscellen werd sterk verbeterd door DSS behandeling, een werving van de immuunrespons in de intestinale lamina propria tonen zoals geanalyseerd door cytofluorimetry (Figuur 1 c).
Figuur 2 toont hoe Colon weefsels zijn gesegmenteerd en ingevoegd in de georiënteerde cassettes. Deze cassettes zijn ontworpen om een raster met geëxtrudeerde tips, waardoor het inbrengen van het weefsel verticaal en met de goede richting, dat wil zeggen, met de lumen in het binnenste gedeelte en de muur exteriorly bevatten (figuur 2A, 2B, 2 C ). Zodra de cassettes zijn gesloten, is de afdrukstand weefsel bewaard door de rasters, in tegenstelling tot wat er met conventionele histologische cassettes (figuur 2B gebeurt).
De verwerking van weefsel is uitgevoerd met een automatische processor (figuur 3A-3 M en tabel 1), terwijl de inbedding procedure wordt uitgevoerd met een geautomatiseerde embedder (figuur 4A-4 M en tabel 2). In het laatste instrument, een robot verzamelt de cassettes en het juiste bedrag van paraffine uitdeelt. Tot slot, door gebruikend microtome, secties worden gesneden van elk blok paraffine. De dia's worden dan voorbereid voor verdere analyse.
Figuur 5 beschrijft de belangrijkste passages van de geautomatiseerde H & E kleuring (figuur 5A-5E en tabel 3) en hoe de dia's worden weergegeven na H & E kleuring (figuur 5F). Figuur 6 en 7 laten zien hoe de uitvoering van de geautomatiseerde verwerking en insluiten protocollen sterk verhogen de kwaliteit van de histopathologische analyses van lymfkliertest Colon specimens. De H & E technieken van monsters die zijn bereid met de geautomatiseerde protocollen afgeleid van onbehandelde muizen (figuur 6A) werden vergeleken met die van DSS behandeld muizen (figuur 6B). Histopathologisch scores werden beoordeeld door de beoordeling van de wijzigingen van verschillende parameters die zich voordoen in de intestinale mucosa, met inbegrip van inflammatoire cellen infiltratie, epitheliale aanpassingen en wijzigingen van de mucosal architectuur zoals beschreven in Tabel 4. Figuur 6 c toont een vertegenwoordiger H & E kleuring van een Colon weefsel handmatig verwerkt en opgenomen in traditionele cassettes. In Figuur 7, de kwaliteit van de voorbereiding lymfkliertest weefsel en insluiten uitgevoerd door middel van geautomatiseerde instrumenten werd bovendien bevestigd door IHC kleuring van CD20 en Mallory trichrome kleuring8,9 in Colon onderdelen van onbehandeld (figuur 7A, 7 C) en DSS-behandeld (figuur 7B, 7 D) muizen.
Figuur 8 beschrijft de praktische relevantie van deze methode. De dezelfde dubbele punt monsters werden verwerkt en ingesloten handmatig of via automatische methoden. Elk monster (ofwel het besturingselement of DSS-behandeld) werd gesneden in 2 gelijke delen en verwerkt parallel met de handleiding of met de automatische methode. H & E kleuring was dan uitgevoerd en een complete microscopische evaluatie betreffende alle pathologische parameters aanpak van veranderingen in de mucosal architectuur, de granulariteit, de immuun cel infiltreren, mucosal dikte, klierweefsel rarefaction normaal waargenomen tijdens de darmontstekingen, evalueerden voor elk monster, zowel voor de handleiding en geautomatiseerde protocol (figuur 8A en tabel 4). De voorbereiding van de monsters met de geautomatiseerde protocol toegestaan consequent de evaluatie van een groter aantal histologische parameters dan de handmatige methode. Bovendien een afzonderlijke analyse van verschillende histologische parameters werd uitgevoerd (Figuur 8). De architectuur en de basale infiltreren evaluatie werden positief beïnvloed, vooral bij onbehandelde muizen, door de bereiding van de monsters met de geautomatiseerde methode.
De geautomatiseerde methode voor monster verwerking en insluiten momenteel gebruikt voor menselijke histopathologische analyses kan met succes worden toegepast voor de analyse van lymfkliertest specimens. Hoge kwaliteit specimens worden gegenereerd met de geautomatiseerde methode waaruit de superioriteit over de handmatige methode bij de beoordeling van de architectuur en de basale immuun infiltreren van lymfkliertest Colon weefsels.
Figuur 1: evaluatie van de chronische darmontstekingen. (A) meting van de lengte van de dikke darm. (B) Colonic expressie van pro-inflammatoire genen (cxcl10, tnf, mcp-1) in de DSS-behandeld (zwarte balken, n = 12) en onbehandelde muizen (witte bars, n = 6). (C) Immunophenotyping van Colon lamina propria cellen in de DSS-behandeld (gesloten symbolen, n = 12) en onbehandelde muizen (open symbolen, n = 6). CD11b + Ly6G + neutrofielen, CD11b + F4 / 80 + macrofagen (linker paneel), CD4 +- en CD8 + T cellen (rechtervenster) infiltratie in besturingselementen (open symbolen, n = 10) en DSS-behandelde muizen (gesloten symbolen, n = 10). Statistische significantie werd berekend met behulp van Wilcoxon gematched-paren ondertekend rangschikking t-test. p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01. Bedoel waarde ± SEM worden gemeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: beschrijving van monstervoorbereiding. (A) instrumenten nodig voor weefsel voorbereiding en foto van de georiënteerde cassette, gecomponeerd door een externe cassette (wit) en interne raster met geëxtrudeerd oriëntatie tips. (B, C) Invoeging van lymfkliertest dubbele punten in de interne rasters van de cassette voor (B) en na (C) afsluiting van de rasters. In deelvenster B wordt afgebeeld de georiënteerde cassette (links) of in een traditionele cassette (rechts). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: beschrijving van de geautomatiseerde verwerking. (A, B) geautomatiseerd processor. (C) pictogram met een beschrijving van de juiste paraffine smelttemperatuur. (D, E) Toevoeging van de cassette in de metalen mand (D) en de sluiting (E). (F, G, H) Toevoeging van de metalen mand in de retort. (I, J, K) Selectie van het protocol van de verwerking. (L) het uitvoeren van het protocol. (M) verwijdering van de mand vormen de retort. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: beschrijving van het insluiten van geautomatiseerde . (A) afbeelding van de geautomatiseerde embedder. (B, C) Toevoeging van de cassettes in het rek. (D, E) Openen (D) en sluiten (E) van het deksel. (F) signalering aan de machine van de aanwezigheid van een rek. (G, H) Toevoeging van het rek in de inlaat behuizing. (I, J) sluiten van het deksel. (K) Start van het insluiten protocol. (L) Opening van het deksel van de behuizing outlet. (M) verwijdering van het rack vormen de outlet-behuizing. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: beschrijving van de geautomatiseerde H & E stainer. (A) afbeelding van de dia houder. (B, C) Toevoeging van de houder van de dia in de machine. (D) de sluiting van de machine. (E) Start van de kleuring protocol. (F) illustratieve afbeelding van een dia na de microtoom snijden en H & E kleuring. Rechterpaneel H & E kleuring beeltenis van de afdrukstand van de steekproef. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: H & E technieken van Colon monsters vormen onbehandeld en DSS-behandeld muizen. H & E kleuring van onbehandelde (A) en DSS-behandeld (B) monsters bereid (verwerkt, embedded, gekleurd) met geautomatiseerde (A, B) of handmatige (C) methoden. Schaal bar = 100 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Mallory trichrome (A, B) en IHC technieken van infiltreren CD20 + cellen (C, D) van onbehandeld (A-C) en DSS behandeld (B, D) muizen. Mallory kleuring: blauw, collageen, donker roze, kernen, donkerrood, cytoplasma. Schaal bar = 100 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8: vergelijking tussen histopathologische analyses met handmatige en geautomatiseerde protocollen. (A) totale histopathologisch parameters verifieerbare in alle secties die zijn bereid met de handleiding (witte balken) of met de geautomatiseerde methode (paarse balken). (B) Percentage van de aangegeven parameters in de monsters die zijn bereid met de handleiding (witte balken) of met de geautomatiseerde methode (paarse balken) in onbehandeld (Plain balken) of DSS-behandelde muizen (gestippelde balken). Statistische significantie werd berekend met behulp van Wilcoxon gematched-paren ondertekend rangschikking t-test. p < 0.05; p < 0.005. Bedoel waarde ± SEM worden gemeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Reagens | tijd (min) | temperatuur (° C) | Druk |
| NBF | 1 | RT | Ambient |
| Ethanol 95% | 1 | RT | Ambient |
| Ethanol 95% | 1 | RT | Ambient |
| Ethanol 95% | 1 | RT | Ambient |
| Absolute Ethanol | 1 | 45 | Ambient |
| Absolute Ethanol | 11 | 45 | Ambient |
| Absolute Ethanol | 30 | RT | Ambient |
| Xyleen | 1 | RT | Ambient |
| Xyleen | 1 | 45 | Ambient |
| Xyleen | 28 | 45 | Ambient |
| Paraffine | 5 | 65 | vacuüm |
Tabel 1: Geautomatiseerd weefsel verwerking protocol.
| Actie universiteitstheater door de robot voor elke cassette |
| Een cassette verwijderen uit het rek |
| Identificeren van de cassette |
| Verwarm de schimmel |
| Plaats de cassette op de voorverwarmde mal |
| Afzien van het bedrag van paraffine voor de cassette |
| Afkoelen van de schimmel |
| De paraffine te stollen toestaan |
| Het gestolde paraffine blok uit de schimmel verwijderen |
| Presenteren van het blok aan kwaliteit sensoren |
| Plaats de paraffine blokkeren in de uitgang deur |
Tabel 2: Geautomatiseerd protocol te embedding.
| Categorie | Criterium | Definitie | Waarde van de Score |
| Inflammatoire cel infiltreren | Ernst (leukocyten dichtheid van lamina propria gebied geïnfiltreerd geëvalueerd hpf) | Geen infiltreren | 0 |
| Minimale acute (< 10%) | 0,25 | ||
| Milde chronische (10-25%, verspreide neutrofielen) | 0,5 | ||
| Matig chronische (26-50%) | 0,75 | ||
| Gemarkeerde (> 51%, dichte infiltreren) | 1 | ||
| Mate (uitbreiding van leukocyten infiltratie) | Mucosale | 0,5 | |
| Cutane en submucosal | 0,75 | ||
| Epitheliale wijzigingen | Hyperplasie (stijging van de epitheliale cellen getallen in lengterichting crypten, zichtbaar als crypt rek) | Geen hyperplasie | 0 |
| Minimal (< 25%) | 0,25 | ||
| Mild (26-35%) | 0,5 | ||
| Matig (36-50%, tussen in het bovenste derde van de crypte epitheel) | 0,75 | ||
| Gemarkeerde (> 51%, tussen in de crypte epitheel verre van crypt base) | 1 | ||
| Goblet cel verlies (vermindering van goblet cel nummers ten opzichte van de basislijn goblet cel nummers per crypt) | Geen verlies | 0 | |
| Minimal (< 25%) | 0,25 | ||
| Mild (26-35%) | 0,5 | ||
| Matig (36-50%) | 0,75 | ||
| Gemarkeerde (> 51%) | 1 | ||
| Mucosale het platform | Ulceration (epitheliale defect die verder reiken dan de muscolaris mucosae) | Geen maagzweren | 0 |
| Zweren | 0,25 | ||
| Granulatie weefsel (bindweefsel reparatie met nieuwe haarvaten, omgeven door het infiltreren van cellen, hypertrophied gebieden) | Geen granulatie weefsel | 0 | |
| Granulatie weefsel | 0,25 | ||
| Mucosale dikte en crypte diepte | Geen verdikking | 0 | |
| Verdikking | 0,5 | ||
| Klierweefsel rarefaction | Geen rarefaction | 0 | |
| Rarefaction | 0,5 | ||
| Dysplasie | Geen dysplasie | 0 | |
| Dysplasie | 0,5 | ||
| MAX SCORE | 6 |
Tabel 3: Geautomatiseerd kleuring protocol.
| Actie universiteitstheater door de stainer voor elke dia | Reagens | tijd (s) | temperatuur (° C) |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Deparaffinize | Xyleen | 120 | RT |
| Deparaffinize | Xyleen | 120 | RT |
| Hydraat | Ethanol 96% | 120 | RT |
| Hydraat | Ethanol 96% | 120 | RT |
| Wassen | Gedestilleerd wtaer | 240 | RT |
| Vlek Haematoxyline | Carazzi de Haematoxyline | 540 | RT |
| Spoelen | Leidingwater | 360 | RT |
| Vlek eosine | Eosine Y 1% aqueos oplossing | 60 | RT |
| Spoelen | Leidingwater | 120 | RT |
| Uitdrogen | Ethanol 96% | 20 | RT |
| Uitdrogen | Ethanol 96% | 20 | RT |
| Uitdrogen | Absolute Ethanol | 15 | RT |
| Uitdrogen | Absolute Ethanol | 15 | RT |
| Duidelijk | Xyleen | 30 | RT |
| Duidelijk | Xyleen | 30 | RT |
Tabel 4: Scoren regeling voor de evaluatie van darmontstekingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij gebruiken verschillende geautomatiseerde stappen tijdens de bereiding van lymfkliertest weefsels histopathologische analyseren. Dit protocol heeft tot doel technische tips om de reproduceerbaarheid en de standaardisatie van het hele proces, dus de verbetering van de algehele kwaliteit van de eindevaluatie histopathologisch te verhogen. Wij geautomatiseerde instrumenten en methoden voor de voorbereiding en de inbedding van weefsels, routinematig gebruikt in pathologie kern voorzieningen voor de studie van menselijke specimens.
Om aan te tonen de mogelijke toepasbaarheid van deze methode, kozen we voor een chronische lymfkliertest experimentele setting van darmontstekingen, chronische colitis DSS-geïnduceerde model genoemd. Deze instelling is vergelijkbaar met de cursus van de complexe ziekte waargenomen bij IBD patiënten, waarvoor uitgebreide histologische evaluatie te onderzoeken de diepgaande wijzigingen van de architectuur van de weefsel voorkomen bij chronische darmontstekingen. Over het geheel genomen de histologische evaluatie van deze processen kan veel baat hebben bij uitgebreide steekproef voorbereiding kwaliteit. Om er rekening mee dat kan dit protocol worden toegepast op andere lymfkliertest weefsels (dat wil zeggen, milt, lymfeklieren, lever, hersenen), met als enige verschil is dat de georiënteerde cassette is niet nodig voor weefsels zonder een lumen.
De belangrijkste opmerking was dat de daling van handmatige fouten, (dat wil zeggen, de richting van het monster) gezien het gebruik van cassettes met rasters en de afschaffing van de cassette opnieuw te openen voor het insluiten van (een stap vaak uitgevoerd tijdens handleiding protocollen), verbeterd sterk de algehele reproduceerbaarheid van de analyse. Met het protocol hier beschreven, wordt het monster gemanipuleerd pas aan het begin van het preparaat, wanneer de experimentator het weefsel in de georiënteerde cassettes voegt. Nadat gesloten, zijn de cassettes nooit opnieuw geopend, waardoor het onderhoud van de correcte oriëntatie en het verminderen van handmatige fouten3,11. De standaardisatie van deze twee kritische stappen verbeterd de hele kwaliteit van de latere analyses en daalde het aantal verloren of niet verifieerbare monsters, problemen zowel gekoppeld aan de heropening van de cassette of de verkeerde richting van het monster3 ,11.
Ook gelukt om bij de evaluatie van een complexe biologische gebeurtenis zoals fibrose (Figuur 7), dat is heel vaak onderschat in lymfkliertest modellen van experimentele darmontstekingen, door de uitvoering van het geautomatiseerde protocol. Tijdens de opbouw van het protocol gestandaardiseerd we strikt technische details zoals de fixatie tijd, wat we gerealiseerd mag niet groter zijn dan 24 h Voorkom weefsel wijzigingen. Door dit te doen, kunnen we de kwaliteit van latere immunohistochemische analyses behouden.
De geautomatiseerde methode verbeterd de evaluatie van deze parameters verbonden tot de wijziging van de architectuur van het weefsel, vooral bij onbehandelde muizen. Inderdaad, de juiste vergelijking van een pathologisch weefsel met een gezonde tegenhanger is cruciaal voor de eindbeoordeling van de experimentele model3.
Met betrekking tot de verwerking van het weefsel testten we verschillende protocollen moet worden uitgevoerd in de geautomatiseerde processor die beschikbaar zijn in het laboratorium. Het protocol hier beschreven gaf geluid en zeer consistente resultaten. We zijn ook uitgevoerd met een lengte van de tijd voor het protocol. Aangezien lymfkliertest monsters vergelijkbaar met menselijke kleine biopsic specimens in grootte waren, een kortere protocol was voldoende voor het verwerken van RattenUitrustingen (intestinale, in dit geval) weefsels. Tot slot, de hele geautomatiseerde procedure verminderd de totale tijd die experimentele. Vanaf het begin van de verwerking op de microtoom uitsnijden en de voorbereiding van de segmenten berekend we dat de totale tijd die nodig 5 h is. Integendeel, afhankelijk van de technische bekwaamheid van de exploitant, kan de voltooiing van de dezelfde protocollen handmatig vereist zijn meer dan het dubbele van de hoeveelheid tijd, met name tijdens de verwerking en de inbedding. Een limiet van de techniek is dat er geautomatiseerde processors en embedder te worden uitgevoerd om te worden in het laboratorium.
Tot slot zijn wij van mening dat de tenuitvoerlegging van deze geautomatiseerde protocollen kan sterk verbeteren het werk van translationeel onderzoekers die zich bezighouden met lymfkliertest experimentele modellen van ziekten bij de mens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken de afdeling pathologie van het ziekenhuis IRCCS Policlinico, Milaan voor technische ondersteuning en de OIE dier faciliteit voor bijstand in de veehouderij.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10x | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1x | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. A Practical Guide to Frozen Section Technique. , New York, N.S.N.Y. (2010).
- Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , Elsevier. (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
Tags
Immunologie en infecties probleem 143 histopathologisch analyse lymfkliertest modellen automatisering systeem normalisatie lymfkliertest intestinale exemplaren te embeddingErratum
Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. An author affiliation was updated.
The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:
Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology
to:
Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS
