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Immunology and Infection

À l’aide de systèmes robotiques pour traiter et intégrer coliques Murine échantillons pour Analyses histologiques

doi: 10.3791/58654 Published: January 7, 2019
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Manque de normalisation pour le traitement des tissus murins réduit la qualité de l’analyse histopathologique murin par rapport aux spécimens humains. Nous présentons ici un protocole pour effectuer l’examen histopathologique des tissus coliques murines, enflammées et inflammθe, à démontrer la faisabilité des systèmes robotiques couramment utilisées pour le traitement et l’incorporation des échantillons humains.

Abstract

La compréhension des maladies humaines a été considérablement élargie grâce à l’étude de modèles animaux. Néanmoins, histopathologique des modèles expérimentaux doit être aussi rigoureuse que celle appliquée pour les échantillons humains. En effet, tirer des conclusions fiables et précises critique dépend de la qualité de tissu section préparation. Nous décrivons ici un protocole pour l’analyse histopathologique des tissus murins qui implémente plusieurs étapes automatisées au cours de la procédure, de la préparation initiale à l’enrobage de paraffine des échantillons murines. La réduction des variables méthodologiques grâce à la normalisation du protocole rigoureux des procédures automatisées contribue à une plus grande fiabilité globale d’analyse pathologique murine. Plus précisément, ce protocole décrit l’utilisation d’un traitement automatisé et intégration de systèmes robotiques, couramment utilisées pour le traitement des tissus et enrobage de paraffine d’échantillons humains, pour traiter des spécimens murins d’inflammation intestinale. Nous concluons que la fiabilité de l’examen histopathologique des tissus murins est sensiblement augmentée lors de l’introduction de techniques standardisés et automatisés.

Introduction

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Au cours des dernières décennies, plusieurs modèles expérimentaux ont été développés pour disséquer les mécanismes pathogènes conduisant à des maladies humaines1,2. Afin d’évaluer la gravité d’une maladie, les chercheurs doivent évaluer l’effet d’un traitement et étudier les variations architecturales cytologiques et histologiques ou le montant de l’inflammation,3. Pour effectuer sur ces modèles expérimentaux, des analyses détaillées histopathologiques sont nécessaires, souvent en comparant des échantillons murins et humains4,5.

En outre, des échantillons humains sont généralement traités et marqués par des installations de base histopathologie et expérimentés pathologistes humaines à travers standardisé critères histopathologiques et méthodes. À l’inverse, tissus murins sont habituellement fixes, intégrées et analysés par des chercheurs ayant une expérience limitée des protocoles histopathologiques. La qualité et la fiabilité de l’examen histopathologique commence par la préparation des coupes de tissus de haute qualité. Plusieurs facteurs contribuent critique pour augmenter ou diminuer la qualité de l’analyse finale, y compris la fixation, macroscopique de sectionnement, de transformation, de paraffine incorporation et incorporation des échantillons6,7.

Tous ces passages impliquant la manipulation de l’échantillon sont soumis à des erreurs manuelles, y compris l’intégration manuelle des échantillons et, dans une moindre mesure, manuel microtome de sectionnement et de coloration. À l’heure actuelle, l’ensemble du processus de préparation de tissus murins pour évaluation histologique repose sur des protocoles qui varient d’un laboratoire à et protocoles manuelles. L’objectif de cette étude est de mettre en œuvre des protocoles standardisés et automatisés pour réduire les erreurs et la variabilité dans l’examen histopathologique murine.

À notre connaissance, nous décrivons ici les premiers protocoles pour tissu entièrement automatisé de traitement et d’incorporation d’évaluation histologique des tissus murins ; Ces sont couramment utilisées dans les unités de pathologie pour les analyses d’échantillons humains. Un exemple concret de la faisabilité de la méthode, un modèle murin d’inflammation intestinale a été analysé, c'est-à-dire, le modèle de colite chronique causée par l’ingestion répétée de sulfate de sodium de dextran (DSS) dans l’eau potable8 ,9. Ce paramètre expérimental étroitement ressemble à humaine inflammatoire de l’intestin (IBD) les maladies10 car les animaux traités DSS montrent des signes d’inflammation intestinale, par exemple, perte de poids, selles ou diarrhée et raccourcissement de la colon ainsi que la fibrose 8,9,11. Tel qu’observé pour des patients humains IBD, traitement DSS génère une évolution de la maladie complexe. Dans ce contexte, évaluations histologiques complexes sont nécessaires pour comprendre la profonde altération de l’architecture du tissu. Ainsi, la mise en œuvre des protocoles décrits pour augmenter la qualité de préparation d’échantillon peut-être bénéficier des chercheurs en se fondant sur l’interprétation de histologique et immunohistochimique analyse des paramètres expérimentaux murins. Des modèles expérimentaux murins de maladies humaines impliquant des modifications de l’architecture tissulaire, la présence d’infiltration du tissu cellulaire ou d’inflammation dans différents tissus et organes (intestin, cerveau, foie, peau) pourrait utiliser la qualité accrue de la préparation d’échantillons pour examen histopathologique.

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Protocol

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Procédures d’animaux ont été approuvés par le ministère italien de la santé (auth. 127/15 27/13) et suivait les directives de protection des animaux de l’Institut européen d’oncologie IACUC (Institutional Animal Care et Comité d’urbanisme)

1. chronique de colite Induction par Administration de DSS répétitives

  1. Séparé âge et le sexe correspondant souris en 2 groupes (traitement DSS vs contrôle H2O, au moins 5 autres souris par groupe expérimental).
  2. Administrer 2,5 % DSS (40 kDa) dans l’eau potable pendant 7 jours pour le groupe de traitement et de l’eau pour le groupe témoin.
    Remarque : Ce modèle induit une inflammation intestinale chronique transmurale9.
  3. Après 7 jours, arrêtez le traitement DSS et donner de l’eau pour les deux groupes pendant 14 jours. Répétez cette opération 3 fois.
    NOTE : Administration répétitive du mas induit des altérations de la muqueuse colique ressemblant étroitement à EIA humaine, c'est-à-dire, la fibrose9.
  4. Sacrifier la souris selon les procédures autorisées par l’IACUC institutionnelle, c'est-à-dire, par l’inhalation de CO2 .
  5. Ouvrir le ventre de la souris et le péritoine avec un scalpel.
    Remarque : La stérilité est recommandée mais pas strictement obligatoire.
  6. Séparer le côlon de l’intestin grêle avec pince et pince à épiler. Le côlon avec pinces et pinces de l’accise.
    Remarque : Mesure de la longueur du côlon (Figure 1 a) est une méthode pour déterminer si la colite a eu lieu chez les souris traitées DSS.
  7. Rincer les deux-points dans une boîte de pétri avec 10 mL de froid 1 x solution saline le tampon au phosphate (PBS) et appuyez doucement pour éliminer les matières fécales.

2. murin tissus Fixation

  1. Plongez chaque spécimen murin de colon dans 10 mL de 10 % neutre tamponné au formol (NBF) à ta (température ambiante).
    Remarque : La stérilité est recommandée mais pas strictement obligatoire.
  2. Difficulté le tissu pendant 18 à 24 h à température ambiante.

3. deux points de sectionnement et de préparation du tissu

  1. Retirer le conteneur NBF tissus fixés avec petites pinces et mettez-les dans un plat de pétri. Mettre les deux points sur une plaque de travail sectionnement avec petites pinces.
  2. Couper les deux-points dans les fragments (0,2 cm de longueurs de 0,3 cm) avec un scalpel stérile. Cette longueur de fragment est optimale pour ne pas dépasser l’épaisseur de la cassette.
  3. Ramasser le segment 1 colon avec petites pinces (Figure 2 a). Insérez segment 1 colon dans un du plastique qui dépassent les conseils de la paraffine orientée intégration cassette avec petites pinces (Figure 2 b).
  4. Répéter l’opération (3.2, 3.3) avec un segments 3 deux points supplémentaires par cassette. Évitez d’insérer les segments en extrémité saillante adjacents, pour minimiser le chevauchement des tissus
  5. Bien fermer la cassette en poussant délicatement les quatre arêtes (Figure 2). Éviter de presser le tissu afin d’éviter des lésions tissulaires.
  6. Insérez la grille dans une structure de support en plastique. La structure portante pour identifier l’échantillon de l’étiquette. Répétez pour chaque échantillon biologique.

4. traitement de tissu

  1. Mettez le processeur automatisé en appuyant sur le bouton d’alimentation (Figure 3 a, 3 b).
  2. Chauffer pendant 1 h afin de faire fondre la cire de paraffine. Attendez que l’appareil confirme que la paraffine est complètement fondue, en observant la présence de l’icône dédié (Figure 3).
  3. Insérez chaque cassette orienté (contenant les échantillons de tissus) manuellement dans le panier métallique fourni par le processeur automatisé (Figure 3D). Placez les cassettes verticalement en les alignant à proximité d’un à l’autre afin d’optimiser l’occupation de panier.
  4. Fermer le panier métallique (Figure 3E).
  5. Ouvrez le couvercle de la riposte (Figure 3F). La riposte est l’endroit où est placé le panier dans la machine. Insérer le panier dans le boîtier dédié du processeur (Figure 3). Fermer le couvercle de la riposte (Figure 3 H).
  6. Utilisez l’écran tactile sur l’ordinateur de l’instrument pour définir le protocole de travail (Figure 3I). Choisir la séquence de solutions, calendrier et température à mettre en œuvre selon le schéma fourni dans le tableau 1.
  7. Affecter le protocole pour être exécuté sur la riposte contenant le panier en cliquant sur l’icône ordinateur dédié (Figure 3J). Commencer le protocole en cliquant sur le Bouton démarrer (Figure 3 L).
  8. Attendez que l’appareil confirme la fin du protocole, en observant la présence de l’icône dédiée et en entendant la sonnerie d’alarme provenant de la machine.
  9. Ouvrez le couvercle de la riposte. Retirez le panier du transformateur (Figure 3 M).

5. tissu incorporation

  1. Allumez l’embedder automatique en appuyant sur le bouton d’alimentation (Figure 4 a).
  2. Chauffer pendant 1 h afin de faire fondre la cire de paraffine. Attendez que l’appareil confirme que la paraffine est complètement fondue en observant la température du bain de paraffine, indiquée par le thermomètre interne de l’instrument.
  3. Transférer manuellement toutes les cassettes transformés du panier processeur sur le rack embedder. Chaque grille peut contenir jusqu'à 32 cassettes. (Figure 4 b, 4C).
  4. Ouvrir le couvercle principal embedder (Figure 4, 4D, 4E).
  5. Utilisez l’écran tactile sur l’ordinateur de l’instrument pour signaler à la robotique système qu’un rack est inséré (Figure 4F).
  6. Ouvrez le couvercle du boîtier d’admission (Figure 4). Placer la grille dans la boîte d’entrée. Chaque embedder peut contenir jusqu'à 4 grilles simultanément (Figure 4 H, 4I). Fermer le couvercle du boîtier d’admission (Figure 4J).
  7. Utilisez l’écran tactile sur l’ordinateur de l’instrument pour commencer la procédure d’incorporation, d’après le tableau 2 (Figure 4 K).
    Remarque : Chaque carré de 32 cassettes prend 45 min pour être embarquée.
  8. Attendez que l’appareil confirme la fin du protocole, en observant la présence de l’icône dédié (Figure 4 L).
  9. Retirer la grille de sortie (Figure 4 M). Fermer le couvercle principal embedder.
  10. Supprimer les blocs embarqués (contenant les grilles d’orientation) de la crémaillère. Transférer les blocs incorporés dans une boîte de rangement en carton.

6. micromètre de sectionnement

  1. Tourner sur la plaque de refroidissement du microtome. Régler la température entre -8 et -10 ° C.
  2. Allumez le bain-marie thermostatique du microtome, contenant 2 L d’eau distillée. Régler la température de l’eau du bain entre 42 et 45 ° C.
  3. Place la paraffine les blocs sur le plateau de refroidissement incorporés. Attendre au moins 5 min pour permettre les blocs se refroidir.
  4. Prenez un pâté de maisons de la plaque de refroidissement et placez-le dans le porte-bloc microtome.
  5. Définissez le microtome coupé épaisseur à 10 µm. Trim le bloc en le coupant fois 6 à 10 µm d’épaisseur.
  6. Changer le réglage de l’épaisseur du microtome de 10 µm à 3 µm. coupe un 3 µm section hématoxyline et éosine (H & E) coloration.
  7. Recueillir la section 3 µm, avec une petite brosse. Placer la section de 3 µm dans le bain-marie, posant délicatement sur la surface de l’eau pour réduire les rides de tissu. Recueillir la section tissus du bain-marie thermostaté sur une lame de verre unique.
    1. Si nécessaire, couper des sections supplémentaires.
  8. L’étiquette de la lame de verre en écrivant l’identification de l’échantillon.
  9. Placez les diapositives dans un four à 37 ° C pendant au moins 10 min.
  10. Mettre lames de verre dans les racks pour l’analyse immédiate ou dans les boîtes de rangement.

7. l’hématoxyline et éosine (H & E) coloration

  1. Allumez le passoire automatique en appuyant sur le bouton d’alimentation. Permettre l’initialisation du bras robotisé, en observant le changement de la barre de chargement sur l’écran de l’instrument.
  2. Insérer les lames de verre dans le panier de stainer, insérant verticalement jusqu'à 30 diapositives.
  3. Étiqueter le rack avec l’étiquette en plastique de radiofréquence approprié d’identification (RFID). Marquage RFID est un système d’identification du protocole de coloration correct chargé dans l’ordinateur de stainer.
  4. Insérer le panier dans la passoire. Laissez l’ordinateur automatiquement charger et démarrer le protocole de coloration selon la reconnaissance de l’étiquette RFID.
    Remarque : Le protocole pour la coloration H & E est décrit dans tableau 3.

8. marquage immunohistochimique

  1. Effectuer immunohistochimiques et Mallory trichrome coloration comme décrit précédemment7.

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Representative Results

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Colite chronique expérimentale induite par l’administration répétée de DSS dans l’eau potable est un modèle murin d’inflammation intestinale ressemblant humaine EIA8,9. La figure 1 décrit les effets du traitement de DSS, y compris le côlon raccourcissement (Figure 1 a), un paramètre utilisé pour marquer la présence de l’inflammation induite par le DSS et colique expression de gènes pro-inflammatoires dont CXCL10 , tnf et mcp-1 (Figure 1 b). Infiltration de cellules inflammatoires a été grandement améliorée par un traitement de DSS, montrant un recrutement de la réponse immunitaire dans la lamina propria intestinale tel qu’analysé par cytofluorimetry (Figure 1).

La figure 2 illustre comment coliques tissus sont sectionnés et insérés dans les cassettes orientés. Ces cassettes sont destinés à contenir une grille avec des extrudés conseils, permettant l’insertion du tissu verticalement et avec l’orientation correcte, c'est-à-dire, avec la lumière dans la partie intérieure et la paroi extérieurement (Figure 2 a, 2 b, 2C ). Une fois que les cassettes sont fermés, l’orientation du tissu est préservée par les grilles, contrairement à ce qui se passe avec les cassettes histologiques classiques (Figure 2 b).

Le traitement de tissus est effectué avec un processeur automatisé (Figure 3 a-3 M et tableau 1), lors de l’incorporation procédure est exécutée avec un embedder automatisé (Figure 4 a-4 M et tableau 2). Dans ce dernier instrument, un robot recueille les cassettes et distribue la quantité correcte de paraffine. Enfin, à l’aide d’un microtome, sections sont coupées à partir de chaque bloc de paraffine. Les lames sont ensuite préparés pour une analyse ultérieure.

Figure 5 décrit les principaux passages de l’automatisé H & E coloration (Figure 5 a-5E et tableau 3) et comment les diapositives apparaissent après H & E coloration (Figure 5F). Figure 6 et 7 montrent comment la mise en œuvre du traitement automatisé et des protocoles encastrement augmenter fortement la qualité de l’analyse histopathologique des spécimens coliques murins. Les salissures H & E des échantillons préparés avec les protocoles automatisés provenant de souris non traitées (Figure 6 a) ont été comparés à ceux des souris traitées de DSS (Figure 6 b). Histopathologiques scores ont été évalués en évaluant les modifications de paramètres différents qui se produisent dans la muqueuse intestinale, notamment inflammatoires cellules infiltration, altérations épithéliales et changements de l’architecture muqueuse comme décrit dans Tableau 4. La figure 6 représente un représentant H & E coloration d’un tissu colique traitées manuellement et inclus dans les cassettes traditionnelles. Dans la Figure 7, la qualité de la préparation des tissus murins et enrobage réalisée au moyen d’instruments automatisés a en outre confirmée par IHC coloration CD20 et Mallory trichrome coloration8,9 en colique articles de non traitées (Figure 7 a, 7c) et imprégnées de DSS (Figure 7 bet 7 D) souris.

Figure 8 décrit l’intérêt pratique de cette méthode. Les mêmes échantillons du côlon ont été traitées et intégrées manuellement ou par des méthodes automatiques. Chaque échantillon (soit le contrôle ou imprégnées de DSS) a été coupé en 2 parties égales et traitée en parallèle avec le manuel ou avec les méthodes de l’automatiques. La coloration H & E a été effectués et une évaluation microscopique complète concernant tous les paramètres pathologiques s’adressant infiltrer de changements dans l’architecture muqueuse, la granularité, la cellule immunitaire, Epaisseur muqueuse, raréfaction glandulaire normalement observés au cours de l’inflammation intestinale, a été évalué pour chaque échantillon, tant pour le manuel et automatisé de protocole (Figure 8 a et tableau 4). La préparation des échantillons avec le protocole automatisé a toujours permis l’évaluation d’une proportion plus élevée des paramètres histologiques que la méthode manuelle. En outre, une analyse séparée des différents paramètres histologiques a été réalisée (Figure 8 b). L’architecture et l’évaluation de l’infiltrat basal ont influencé positivement, surtout chez les souris non traitées, de la préparation de l’échantillon avec la méthode automatisée.

La méthode automatisée pour l’échantillon de traitement et d’incorporation actuellement utilisé pour l’analyse histopathologique humaine peut être appliquée avec succès pour l’analyse de spécimens murins. Les échantillons de haute qualité sont générés avec la méthode automatisée qui démontre la supériorité sur la méthode manuelle dans l’évaluation de l’architecture et l’infiltrat immunitaire basale des tissus du côlon murines.

Figure 1
Figure 1 : évaluation de l’inflammation intestinale chronique. (A) mesure de la longueur du côlon. (B) du côlon expression de gènes pro-inflammatoires (cxcl10, tnf, mcp-1) en imprégnées de DSS (noire, n = 12) et n’est pas traité de souris (blanc barres, n = 6). Immunophénotypage (C) de colique lamina propria cellules dans DSS-traités (fermé symboles, n = 12) et n’est pas traité de souris (ouvrir symboles, n = 6). CD11b + Ly6G + neutrophiles, CD11b + F4 / 80 + les macrophages (panneau de gauche), CD4 + et CD8 + T cells infiltration (panneau de droite) chez les témoins (ouvrir les symboles, n = 10) et chez les souris traitées DSS (fermé les symboles, n = 10). Signification statistique a été calculée à l’aide de paires appariés de Wilcoxon signé test t rang. p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01. Moyenne valeur ± SEM sont signalés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Description de la préparation de l’échantillon. (A) Instruments nécessaires à la préparation du tissu et l’image de la cassette plus orientée, composée par une cassette externe (blanc) et une grille interne avec extrudé conseils d’orientation. (B, C) Insertion de colons murins dans les grilles internes de la cassette avant (B) et après (C) la fermeture des grilles. Dans le groupe B est représentée la cassette orientée (à gauche) ou dans une cassette traditionnelle (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Description d’un traitement automatisé. (A, B) automatisés processeur. (C) icône décrivant la paraffine correcte température de fusion. (D, E) Insertion de la cassette dans le panier métallique (D) et sa fermeture (E). (F, G, H) Insertion du panier métallique dans la riposte. (I, J, K) Sélection du protocole de traitement. (L) en cours d’exécution du protocole. (M) ablation du panier forme la riposte. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Description d’incorporation automatique . (A) image de l’embedder automatisé. (B, C) Insertion des cassettes dans le panier. (D, E) (D) d’ouverture et de fermeture (E) du couvercle. Signalisation (F) à la machine de la présence d’un support. (G, H) Insertion du panier dans le boîtier d’admission. (I, J) fermeture du couvercle. (K) début du protocole encastrement. (L) ouverture du couvercle du boîtier de sortie. (M) ablation du panier forme du boîtier de sortie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Description des automatisé de coloration H & E. Photo (A) de la pince valet. (B, C) Insertion de la pince valet dans la machine. (D) fermeture de la machine. (E) début du protocole de coloration. (F) exemples photo d’une lame après coupe microtome et une coloration H & E. Panneau de droite, H & E coloration illustrant l’orientation de l’échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : H & E de salissures des échantillons coliques forment des souris non traitées ou traitées DSS. H & E coloration non traitées (A) et imprégnées de DSS (B) les échantillons préparés (traitées, incorporés, teinté) avec automatisé (A, B) ou manuel (C) méthodes. Echelle = 100 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Mallory trichrome (A, B) et salissures IHC d’infiltration de cellules CD20 + (C, D) de non traitée (A-C) et DSS traitée (B, D) souris. Coloration de Mallory : collagène, Rose foncé, noyaux, rouge foncé, bleu, cytoplasme. Echelle = 100 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : comparaison entre l’analyse histopathologique avec protocoles automatisés et manuels. (A) Total histopathologiques paramètres évaluables dans toutes les sections préparées avec le manuel (barres blanches) ou avec la méthode automatisée (barres de pourpres). (B) pourcentage des paramètres indiqués dans les échantillons préparés avec le manuel (barres blanches) ou avec la méthode automatisée (barres de pourpres) non traitées (barres lisses) ou chez les souris traitées DSS (barres en pointillé). Signification statistique a été calculée à l’aide de paires appariés de Wilcoxon signé test t rang. p < 0,05 ; p < 0,005. Moyenne valeur ± SEM sont signalés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Réactif temps (min) température (° C) pression
NBF 1 RT ambiante
Éthanol 95 % 1 RT ambiante
Éthanol 95 % 1 RT ambiante
Éthanol 95 % 1 RT ambiante
Éthanol absolu 1 45 ambiante
Éthanol absolu 11 45 ambiante
Éthanol absolu 30 RT ambiante
Xylène 1 RT ambiante
Xylène 1 45 ambiante
Xylène 28 45 ambiante
Cire de paraffine 5 65 sous vide

Tableau 1 : Automated protocole de traitement des tissus.

Action réalisée par le robot pour chaque cassette
Retirez une cassette de la crémaillère
Identifier la cassette
Préchauffer le moule
Placez la cassette sur le moule préchauffé
Distribuer la quantité de paraffine pour la cassette
Refroidir le moule
Permettre à la paraffine solidifier
Retirer le bloc de paraffine solidifiée du moule
Présenter le bloc aux capteurs de qualité
Placez le bloc de paraffine dans la porte de sortie

Tableau 2 : Automatisé intégrant le protocole.

Catégorie Critère Définition Valeur de partition
Infiltrat cellulaire inflammatoire Gravité (densité de leucocytes de la lamina propria zone infiltrée dans évaluée hpf) Aucune infiltration 0
Minime aiguë (< 10 %) 0.25
Chronique légère (10 à 25 %, neutrophiles épars) 0,5
Moyennement chronique (26 à 50 %) 0,75
Marquée (> 51 %, dense s’infiltrer) 1
Dans quelle mesure (expansion d’infiltration leucocytaire) Muqueuse 0,5
Muqueuse et sous-muqueuse 0,75
Modifications épithéliales Hyperplasie (augmentation du nombre de cellules épithéliales dans les cryptes longitudinales, visibles comme l’allongement de la crypte) Aucune hyperplasie 0
Minimes (< 25 %) 0.25
Douces (26 – 35 %) 0,5
Modérée (36 à 50 %, mitoses dans le tiers supérieur de l’épithélium de la crypte) 0,75
Marquée (> 51 %, mitoses dans l’épithélium crypte éloigné de crypte base) 1
Perte de cellules caliciformes (réduction du nombre de cellules caliciformes par rapport au nombre de cellules caliciformes de base par la crypte) Aucune perte 0
Minimes (< 25 %) 0.25
Douces (26 – 35 %) 0,5
Modérée (36 – 50 %) 0,75
Marquée (> 51 %) 1
Architecture de la muqueuse Ulcération (défaut épithélial allant au-delà des muqueuses muscolaris) Aucun ulcère 0
Ulcères 0.25
Tissu de granulation (réparation du tissu conjonctif avec nouveaux capillaires, entouré de s’infiltrer dans les cellules, hypertrophiées zones) Aucun tissu de granulation 0
Tissu de granulation 0.25
Profondeur de l’épaisseur de la muqueuse et de la crypte Aucun épaississement 0
Épaississement 0,5
Raréfaction glandulaire Aucune raréfaction 0
Raréfaction 0,5
Dysplasie Aucune dysplasie 0
Dysplasie 0,5
SCORE DE MAX 6

Tableau 3 : Automated souillant le protocole.

Action réalisée par le passoire pour chaque diapositive Réactif heure (s) température (° C)
Essicate 180 60
Essicate 180 60
Déparaffiner Xylène 120 RT
Déparaffiner Xylène 120 RT
Hydrate de Éthanol à 96 % 120 RT
Hydrate de Éthanol à 96 % 120 RT
Lavage Eau distillée 240 RT
Coloration hématoxyline Hématoxyline de Carazzi 540 RT
Rinçage Eau du robinet 360 RT
Tache d’éosine Solution d’aqueos éosine Y 1 % 60 RT
Rinçage Eau du robinet 120 RT
Déshydrater Éthanol à 96 % 20 RT
Déshydrater Éthanol à 96 % 20 RT
Déshydrater Éthanol absolu 15 RT
Déshydrater Éthanol absolu 15 RT
Claire Xylène 30 RT
Claire Xylène 30 RT

Tableau 4 : Notation de schéma pour l’évaluation de l’inflammation intestinale.

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Discussion

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Nous utilisons différentes étapes automatisées lors de la préparation des tissus murins pour l’analyse histopathologique. Ce protocole vise à fournir des conseils techniques pour augmenter la reproductibilité et la standardisation de l’ensemble du processus, ce qui améliore la qualité globale de l’évaluation finale histopathologique. Nous avons implémenté des instruments automatisés et méthodes pour la préparation et l’incorporation de tissus, couramment utilisés dans des installations de centrales de pathologie pour l’étude de spécimens humains.

Pour démontrer les possibilités d’application de cette méthode, nous avons choisi un cadre expérimental murin chronique de l’inflammation intestinale, appelé modèle de colite chronique induite par le DSS. Ce paramètre ressemble à l’évolution de la maladie complexe observée chez les patients de l’EIA, nécessitant une évaluation histologique élaborée pour enquêter sur les altérations profondes de l’architecture tissulaire survenant lors de l’inflammation intestinale chronique. Au total, l’évaluation histologique de ces processus peut grandement bénéficier de qualité de préparation d’échantillon accrue. A noter, le présent protocole peut être appliqué à d’autres tissus murins (rate, ganglions lymphatiques, foie, cerveau), avec la seule différence étant que la cassette orientée n’est pas nécessaire pour les tissus sans un lumen.

L’observation plus importante qui a été la diminution des erreurs manuelles, (c'est-à-dire, l’orientation de l’échantillon) compte tenu de l’utilisation de cassettes avec grilles et l’élimination de la cassette de ré-ouverture pour l’intégration (une étape fréquemment exécutée au cours du manuel protocoles), a fortement amélioré la reproductibilité globale de l’analyse. Avec le protocole décrit ici, l’échantillon est manipulé qu’au début de la préparation, lorsque l’expérimentateur insère le tissu dans les cassettes orientés. Une fois fermé, les cassettes ne soient jamais rouvertes, ce qui assure la maintenance de la bonne orientation et réduit les erreurs manuelles3,11. La normalisation de ces deux étapes critiques amélioré la qualité d’ensemble des analyses ultérieures et diminue le nombre d’échantillons perdus ou non évaluables, problèmes toutes les deux liées à la réouverture de la cassette ou à la mauvaise orientation de l’échantillon3 ,11.

Nous avons également réussi à évaluer un événement biologique complexe comme la fibrose (Figure 7), qui est très souvent sous-estimée dans les modèles murins d’experimental inflammation intestinale, de la mise en œuvre du protocole automatisé. Au cours de la mise en place du protocole, nous strictement normalisée des détails techniques tels que le temps de fixation, ce qui ne doit pas dépasser 24 h pour éviter les altérations tissulaires, nous avons réalisé. Ce faisant, nous pourrions préserver la qualité des analyses ultérieures immunohistochimiques.

La méthode automatisée améliore l’évaluation de ces paramètres associés à la modification de l’architecture tissulaire, en particulier chez les souris non traitées. En effet, la comparaison correcte d’un tissu pathologique avec un homologue sain est essentiel pour l’évaluation finale du modèle expérimental3.

En ce qui concerne le traitement de tissus, nous avons testé différents protocoles pour être exécuté par le processeur automatisé disponible dans le laboratoire. Le protocole décrit ici ont donné des résultats sonores et très cohérentes. Nous avons également mis en œuvre une longueur de temps pour le protocole. Murines échantillons étant comparables à des échantillons humains de biopsic petites taille, un protocole plus court ne suffisait pas à traiter murin (intestinal, en l’occurrence) les tissus. Enfin, la procédure automatisée tout réduit le temps expérimental total. Depuis le début du traitement au microtome découpage et préparation de tranches, nous avons calculé que le temps total nécessaire est de 5 h. Au contraire, selon la capacité technique de l’opérateur, l’achèvement des protocoles mêmes manuellement peut exiger plus que doubler la quantité de temps, surtout pendant le traitement et l’intégration. Une des limites de la technique, c’est qu’il exige des processeurs automatisés et embedder à effectuer pour être en laboratoire.

En conclusion, nous croyons que la mise en œuvre de ces protocoles automatisés pourrait améliorer grandement le travail des chercheurs translationnelles traitant des modèles expérimentaux murins de maladies humaines.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le département de pathologie de l’hôpital Policlinico IRCCS, Milan pour le support technique et l’IEO Animal Facility d’assistance dans l’élevage.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Absolute Ethanol anhydrous Carlo Erba 414605 reagent
Absolute ETOH Honeywell 02860-1L reagent
Aluminium Potassium Sulfate SIGMA A6435 reagent
Aniline Blue SIGMA 415049 reagent
carbol Fuchsin SIGMA C4165 reagent
CD11b (clone M1/70) TONBO biosciences 35-0112-U100 antibody
CD20 IHC (clone SA275A11) Biolegend 150403 antibody
CD3 (17A2) TONBO biosciences 35-0032-U100 antibody
CD4 (GK1.5) BD Biosciences 552051 antibody
CD45.2 (clone 104) BioLegend 109837 antibody
CD8 (53-6.7) BD Biosciences 553031 antibody
Citrate Buffer pH 6 10x SIGMA C9999 reagent
Dab Vector Laboratories SK-4100 reagent
DPBS 1x Microgem L0615-500 reagent
DSS TdB Consultancy DB001 reagent
EDTA SIGMA E9884 reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP DAKO compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker DAKO compreso in GV80011-2
Eosin VWR 1.09844 reagent
F4/80 (clone BM8) BioLegend 123108 antibody
Formalin PanReac 2,529,311,215 reagent
glacial acetic acid SIGMA 71251 reagent
Goat-anti-Rat-HRP Agilent DAKO P0448 antibody
Haematoxylin DIAPATH C0303 reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255) Leica RM2255 equipment
Ly6g (clone 1A8) BD Biosciences 551459 antibody
Mercury II Oxide SIGMA 203793 reagent
Omnis Clearify Clearing Agent DAKO CACLEGAL reagent
Omnis EnVision Flex TRS DAKO GV80011-2 reagent
Orange G SIGMA O3756 reagent
Paraffin Sakura 7052 reagent
Peloris LEICA equipment
Percoll SIGMA P4937 reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine Microgem L0501-500 reagent
STS020 Leica equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette SAKURA 7022 equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder Sakura equipment
Xylene J.T.Baker 8080.1000 reagent

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References

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  2. Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
  3. Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
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  5. Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
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  7. Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. Elsevier. (2011).
  8. Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
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Erratum

Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:

Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

to:

Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

À l’aide de systèmes robotiques pour traiter et intégrer coliques Murine échantillons pour Analyses histologiques
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Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).More

Cribiù, F. M., Burrello, C., Tacchi, R., Boggio, F., Ricca, D., Caprioli, F., Ferrero, S., Facciotti, F. Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. J. Vis. Exp. (143), e58654, doi:10.3791/58654 (2019).

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