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Summary
Falta de padronização para processamento do tecido murino reduz a qualidade da análise histopatológica murino em comparação com espécimes humanos. Aqui, apresentamos um protocolo para realizar o exame histopatológico dos tecidos do cólon inflamados e uninflamed murino para mostrar a viabilidade de sistemas robóticos rotineiramente utilizados para processamento e incorporação de amostras humanas.
Abstract
A compreensão de doenças humanas foi grandemente ampliada graças ao estudo de modelos animais. Não obstante, avaliação histopatológica de modelos experimentais precisa ser tão rigoroso que o aplicado para amostras humanas. Com efeito, conclusões confiáveis e precisos criticamente é influenciado pela qualidade da preparação de secção de tecido. Aqui, descrevemos um protocolo para análise histopatológica de tecidos murino que implementa várias etapas automatizadas durante o procedimento, desde a preparação inicial para a incorporação de parafina das amostras murino. A redução de variáveis metodológicas através de padronização de protocolo rigoroso de procedimentos automatizados contribui para maior confiabilidade global de murino análise patológica. Especificamente, este protocolo descreve a utilização de processamento automatizado e incorporando sistemas robóticos, rotineiramente utilizado no processamento do tecido e parafina incorporação de amostras humanas, para processar amostras murino de inflamação intestinal. Podemos concluir que a confiabilidade do exame histopatológico de tecidos murino é significativamente maior em cima da introdução de técnicas padronizadas e automatizadas.
Introduction
Nas últimas décadas, vários modelos experimentais foram desenvolvidos para dissecar os mecanismos patogénicos, levando a doenças humanas1,2. Para avaliar a gravidade de uma doença, os pesquisadores devem avaliar o efeito de um tratamento e estudar as variações de arquiteturais citológicas e histológicas ou a quantidade de inflamação3. Para executar esses modelos experimentais, detalhadas análises histopatológicas são necessários, muitas vezes comparando amostras de murino e humano4,5.
Além disso, amostras humanas são comumente processadas e marcou pelas instalações do núcleo de histopatologia e padronizado de experientes patologistas humanos através de critérios histopatológicos e métodos. Por outro lado, murino tecidos são geralmente fixa, incorporados e analisados por pesquisadores com experiência limitada de protocolos histopatológicos. A qualidade e a confiabilidade do exame histopatológico começa com a preparação de cortes de tecido de alta qualidade. Criticamente, vários fatores contribuem para aumentar ou diminuir a qualidade da análise final, incluindo fixação, macroscópica de seccionamento, processamento, parafina incorporação e incorporação de amostras6,7.
Todas estas passagens envolvendo a manipulação da amostra estão sujeitos a erros manuais, incluindo incorporação manual das amostras e, em menor medida, micrótomo manual de corte e coloração. Neste momento, todo o processo de preparação do tecido murino para avaliação histológica baseia-se nos protocolos manuais e protocolos que variam de laboratório para laboratório. O objetivo deste estudo é implementar protocolos padronizados de automatizado para reduzir erros e variabilidade no exame histopatológico murino.
A nosso conhecimento, nós descrevemos aqui primeiros protocolos para tecido totalmente automatizado de processamento e incorporação para a avaliação histológica dos tecidos murino; Estes são rotineiramente utilizados em unidades de patologia para as análises de amostras humanas. Como um exemplo prático da viabilidade do método, um modelo murino de inflamação intestinal foi analisado, ou seja,, o modelo de colite crônica causada pela administração repetida de sulfato de dextrano de sódio (DSS) na água bebendo8 ,9. Esta configuração experimental de perto se assemelha a humana inflamatória intestinal (IBD) de doenças10 desde que os animais tratados com DSS exibem sinais de inflamação intestinal, por exemplo, perda de peso, fezes soltas ou diarreia e encurtamento do cólon, bem como fibrose 8,9,11. Como observado para pacientes humanos IBD, tratamento de DSS gera um curso de doenças complexas. Neste contexto, elaboradas avaliações histológicas são necessários para compreender a profunda alteração da arquitetura do tecido. Assim, a implementação dos protocolos descritos para o aumento da qualidade de preparação de amostra pode beneficiar pesquisadores baseando-se na interpretação do histológico e imuno-histoquímica analisa para configurações experimentais murino. Murino modelos experimentais de doenças humanas que envolvem alterações da arquitetura do tecido, a presença de infiltrado de tecido celular ou inflamação em diferentes tecidos e órgãos (intestino, cérebro, fígado, pele) pode usar o aumento da qualidade da preparação da amostra para exame histopatológico.
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Protocol
Procedimentos de animais foram aprovados pelo Ministério da saúde (auth. 127/15, 27/13) italiano e seguiram as orientações de cuidados com animais do Instituto Europeu de Oncologia IACUC (Comité de uso e cuidados institucionais do Animal)
1. crônica colite indução pela administração repetitiva de DSS
- Idade separada e sexo combinam ratos em 2 grupos (tratamento DSS vs controle de H2O, pelo menos 5 littermates ratos por grupo experimental).
- Administrar 2,5% DSS (40 kDa) na água potável por 7 dias para o grupo de tratamento e água ao grupo controle.
Nota: Esse modelo induz um transmural crônica inflamação intestinal9. - Após 7 dias, parar o tratamento de DSS e dar água para os dois grupos durante 14 dias. Repita este processo 3 vezes.
Nota: A administração repetitiva de DSS induz alterações da mucosa do cólon, muito parecidos com humano IBD, de fibrose ou seja,9. - Sacrificar os ratos de acordo com os procedimentos autorizados pelo IACUC institucional, ou seja,, por inalação de CO2 .
- Abra o abdômen de rato e peritônio com um bisturi.
Nota: Esterilidade é recomendada mas não estritamente necessária. - Separe o cólon do intestino com pinças e pinças. Impostos especiais de consumo do cólon com uma pinça e fórceps.
Nota: Medida do comprimento do cólon (figura 1A) é um método para determinar se a colite ocorreu em camundongos tratados com DSS. - Lavar o cólon em uma placa de Petri com 10 mL de frio 1x salino de tampão fosfato (PBS) e pressione suavemente para remover o material fecal.
2. fixação de tecidos murino
- Mergulhe cada espécime de cólon murino em 10 mL de 10% neutro tamponado formalina (NBF) no RT (temperatura ambiente).
Nota: Esterilidade é recomendada mas não estritamente necessária. - Fixar o tecido para 18-24 h a RT
3. dois pontos de corte e preparação do tecido
- Remover tecidos fixos do recipiente NBF com pequenas pinças e colocá-los em um prato de Petri. Colocar os dois pontos em uma placa de trabalho corte com pequenas pinças.
- Corte dois-pontos em fragmentos (0,2 cm de comprimentos de 0,3 cm) com um bisturi estéril. Este comprimento do fragmento é ideal para não exceder a espessura da fita.
- Pegar o segmento de um cólon com pequenas pinças (Figura 2A). Inserir o segmento de um cólon em um do plástico salientes dicas da parafina orientada a incorporação de gaveta com pequenas pinças (Figura 2B).
- Repita a operação (3.2-3.3) com um segmentos 3 dois pontos adicionais por gaveta. Evitar introduzir os segmentos adjacentes pontas salientes, para minimizar a sobreposição dos tecidos
- Feche a gaveta empurrando cuidadosamente as quatro bordas (Figura 2). Evite apertar o tecido para evitar danos aos tecidos.
- Inserir a grade em um frame plástico de apoio. Rotule o frame de apoio para identificar a amostra. Repita para cada amostra biológica.
4. tecido processamento
- Ligue o processador automático pressionando o botão liga / desliga (Figura 3A, 3B).
- Aquecer por 1 h para garantir a parafina derreter. Espere até que o instrumento confirma que a parafina é completamente derretida, observando a presença do ícone dedicado (Figura 3).
- Cada gaveta orientada (contendo as amostras de tecido) manualmente inserir a cesta do metal fornecida pelo processador automatizado (Figura 3D). Coloque as fitas verticalmente alinhando-os perto de um para o outro para otimizar a ocupação de cesta.
- Feche a cesta do metal (Figura 3E).
- Abra a tampa da retorta (Figura 3F). Retorta é o lugar onde a cesta é inserida na máquina. Colocar o cesto no compartimento dedicado do processador (Figura 3). Feche a tampa da retorta (Figura 3 H).
- Use a tela de toque no computador instrumento para definir o protocolo de trabalho (Figura 3I). Escolha a sequência de soluções, tempo e temperatura para ser implementado de acordo com o regime previsto na tabela 1.
- Atribua o protocolo a ser executado na retorta que contém a cesta, clicando no ícone do computador dedicado (Figura 3J). Inicie o protocolo clicando no Botão iniciar (Figura 3 L).
- Espere até que o instrumento confirma o fim do protocolo, observando-se a presença do ícone dedicado e ao ouvir o tom de alarme proveniente da máquina.
- Abra a tampa da retorta. Retire o cesto do processador (Figura 3 M).
5. tecido incorporação
- Ligue o automatizado embedder pressionando o botão liga / desliga (Figura 4A).
- Aquecer por 1 h para garantir a parafina derreter. Espere até que o instrumento confirma que a parafina é completamente derretida, observando a temperatura do banho de parafina indicado pelo termômetro interno do instrumento.
- Transferi manualmente todas as fitas transformadas da cesta processador rack embedder. Cada rack pode conter até 32 fitas. (Figura 4B, 4C).
- Abra a tampa principal embedder (Figura 4, 4D, 4E).
- Use a tela de toque no computador instrumento para sinalizar para o robótico sistema que está sendo um rack inserido (Figura 4F).
- Abra a tampa de caixa de entrada (Figura 4). Insira a cremalheira da caixa de entrada. Cada embedder pode conter até 4 cremalheiras simultaneamente (Figura 4 H, 4I). Feche a tampa de caixa de entrada (Figura 4J).
- Use a tela de toque no computador instrumento para iniciar o processo de incorporação, de acordo com a tabela 2 (Figura 4 K).
Nota: Cada rack de 32 cassettes leva 45 min para ser incorporado. - Espere até que o instrumento confirma o fim do protocolo, observando-se a presença do ícone dedicado (Figura 4 L).
- Retire o cesto de saída (Figura 4 M). Feche a tampa principal embedder.
- Remova os blocos incorporados (contendo os eixos de orientação) do rack. Transferi os blocos incorporados em uma caixa de papelão de armazenamento.
6. micrômetro seccionamento
- Ligue a placa de resfriamento do micrótomo. Definir a temperatura entre -8 e -10 ° C.
- Prepara o banho termostático água do micrótomo, contendo 2 L de água destilada. Regule a temperatura do banho de água entre 42-45 ° C.
- Lugar da parafina incorporado blocos na placa de resfriamento. Espere pelo menos 5 min para permitir que os blocos esfriar.
- Leve a um quarteirão da placa de resfriamento e coloque-o no suporte do bloco do micrótomo.
- Defina o micrótomo corte espessura a 10 µm. Trim o bloco por um corte 6 vezes em 10 µm de espessura.
- Altere a configuração da espessura do micrótomo de 10 µm a 3 µm. corte um 3 µm seção para hematoxilina e eosina (H & E) coloração.
-
Recolha a seção 3 µm com uma escova pequena. Colocar a seção 3 µm em banho-Maria, colocando-lo cuidadosamente na superfície da água para reduzir as rugas de tecidos. Recolha a seção de tecido do banho de água controlado termostaticamente sobre uma lâmina de vidro único.
- Se necessário, corte seções adicionais.
- Rotule a lâmina de vidro, por escrito, a identificação da amostra.
- Coloque os slides em um forno de 37 ° C pelo menos 10 min.
- Colocar as lâminas de vidro em racks para análise imediata ou em caixas de armazenamento.
7. hematoxilina e eosina (H & E) coloração
- Ligue o corante automatizado pressionando o botão de energia. Permita a inicialização do braço robótico, observando-se a mudança da barra de carregamento sobre o monitor de instrumento.
- Inserir as lâminas de vidro dentro do rack de corante, inserindo verticalmente até 30 slides.
- Rotule o rack com a tag plástico de identificação (RFID) adequado radiofrequência. Colocação de etiquetas de RFID é um sistema de identificação do protocolo de coloração correto carregado para o computador de corante.
- Insira a cremalheira do corante. Permitir que o computador automaticamente carregar e iniciar o protocolo de coloração de acordo com o reconhecimento da tag RFID.
Nota: O protocolo para coloração H & E é descrito no tabela 3.
8. coloração imuno-histoquímica
- Execute a imuno-histoquímica e Mallory tricromo de coloração como descrito anteriormente,7.
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Representative Results
Colite crônica experimental, induzida pela administração repetida de DSS na água potável é um modelo murino de inflamação intestinal, muito parecidos com humanos IBD8,9. A Figura 1 descreve os efeitos do tratamento de DSS, incluindo cólon encurtamento (figura 1A), um parâmetro utilizado para marcar a presença de inflamação induzida por DSS e Colônica expressão de genes pró-inflamatórios, incluindo CXCL10 , tnf e mcp-1 (figura 1B). Infiltração de células inflamatórias foi bastante reforçada pelo tratamento de DSS, mostrando um recrutamento da resposta imune na lâmina própria intestinal como analisado por cytofluorimetry (Figura 1).
A Figura 2 mostra como Colônico tecidos são seccionados e inserido as cassetes orientada. Essas fitas são projetadas para conter uma grade com extrusão dicas, permitindo a inserção do tecido verticalmente e com a orientação adequada, ou seja,, com a luz na parte interna e a parede de superfície (Figura 2A, 2B, 2C de ). Uma vez que as fitas estão fechadas, a orientação de tecido é preservada por grades, ao contrário do que acontece com fitas histológicas convencionais (Figura 2B).
O processamento do tecido é executado com um processador automatizado (Figura 3A-3 M e tabela 1), enquanto a incorporação de um procedimento é realizado com um automatizado embedder (Figura 4A-4 M e tabela 2). No último instrumento, um robô recolhe as fitas e distribui a quantidade correta de parafina. Finalmente, usando um micrótomo, seções são cortadas de cada bloco de parafina. Os slides são então preparados para posterior análise.
Figura 5 descreve as principais passagens do automatizado H & E mancha (Figura 5A-5E e tabela 3) e como os slides aparecem depois de H & E mancha (Figura 5F). Figura 6 e 7 mostram como a implementação do processamento automatizado e incorporação de protocolos fortemente para aumentar a qualidade das análises histopatológicas de murino espécimes do cólon. As H & E citológicas de amostras preparadas com os protocolos automatizados derivados de ratos não tratados (figura 6A) foram comparadas dos ratos tratados de DSS (Figura 6B). Resultados histopatológicos foram avaliados por avaliar as modificações dos diferentes parâmetros que ocorrem na mucosa intestinal, incluindo inflamatória células infiltração, alterações epiteliais e alterações da arquitetura da mucosa, como descrito no Tabela 4. Figura 6 mostra um representante H & E mancha de um tecido do cólon processadas manualmente e incluídos em fitas tradicionais. Na Figura 7, a qualidade da preparação murino tecido e incorporação realizada através de instrumentos automatizados Adicionalmente foi confirmada por IHQ coloração de CD20 e Mallory tricromo coloração8,9 no cólon seções de não tratados (Figura 7A, 7C) e tratados com DSS (Figura 7B, 7D) ratos.
A Figura 8 descreve a relevância prática desse método. As mesmas amostras de cólon foram processadas e embutidas manualmente ou através de métodos automáticos. Cada amostra (ou o controle ou tratados com DSS) foi cortado em 2 partes iguais e processada em paralelo com o manual ou com os métodos automáticos. Coloração H & E foi então realizada e uma avaliação microscópica completa sobre todos os parâmetros patológicos abordando mudanças na arquitetura da mucosa, granularidade, células imunes se infiltrar, espessura da mucosa, rarefação glandular normalmente observados durante a inflamação intestinal, foi avaliada para cada amostra, tanto para o manual e automatizada de protocolo (Figura 8A e tabela 4). A preparação das amostras com o protocolo automatizado consistentemente permitiu a avaliação de uma proporção maior do que o método manual de parâmetros histológicos. Além disso, realizou-se uma análise separada dos diferentes parâmetros histológicos (Figura 8B). A arquitetura e a avaliação basal infiltrado foram positivamente afetados, especialmente em ratos não tratados, pela preparação da amostra com o método automatizado.
O método automatizado para amostra de processamento e incorporação de objetos atualmente utilizados para análises histopatológicas humanas pode ser aplicado com sucesso para a análise de amostras de murino. Amostras de alta qualidade são geradas com o método automatizado que demonstra a superioridade sobre o método manual na avaliação da arquitetura e o infiltrado imune basal de murino tecidos do cólon.
Figura 1: avaliação de inflamação intestinal crônica. (A) medida do comprimento do cólon. (B) do cólon expressão de genes pró-inflamatórios (cxcl10, tnf, mcp-1) em DSS-tratada (preto bares, n = 12) e não tratada ratos (branco bares, n = 6). (C) Immunophenotyping da propria do lamina do cólon em DSS-tratados células (fechado símbolos, n = 12) e não tratada ratos (Abra símbolos, n = 6). CD11b + Ly6G + neutrófilos, CD11b + F4 / 80 + macrófagos (painel esquerdo), CD4 + e CD8 + T cells infiltração (painel direito) em controles (Abra símbolos, n = 10) e ratos tratados com DSS (fechado símbolos, n = 10). Significância estatística foi calculada usar pares combinados de Wilcoxon assinou o teste t de classificação. p ≤ 0,05 * * p ≤ 0.01. Quer dizer valor ± SEM são relatados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Descrição da preparação da amostra. (A) instrumentos necessários para a preparação do tecido e imagens da fita orientada, composta por uma gaveta externa (branco) e grade interna com extrudados dicas de orientação. (B, C) Inserção de dois-pontos murino nas grades internas da fita antes (B) e após (C) encerramento das grades. No painel B é retratado a gaveta orientada (à esquerda) ou em uma gaveta tradicional (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Descrição de processamento automatizado. (A, B) automatizado processador. (C) ícone descrevendo a correta temperatura de fusão da cera de parafina. (D, E) Inserção da fita na cesta metal (D) e seu encerramento (E). (F, G, H) Inserção da cesta de metal na retorta. (I, J, K) Seleção do protocolo de tratamento. (L) a execução do protocolo. (M) remoção do formulário cesta retorta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Descrição de incorporação automática . (A) imagens do embedder automatizado. (B, C) Inserção das fitas no rack. (D, E) Abertura (D) e (E) de fechamento da tampa. (F) sinalização para a máquina da presença de um rack. (G, H) Inserção do rack dentro da caixa de entrada. (I, J) fechamento da tampa. (K) início do protocolo de incorporação. (L) abertura da tampa do alojamento da tomada. (M) remoção do formulário cremalheira da caixa de saída. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Descrição de corante automatizado de H & E. Imagens do (A) do titular do slide. (B, C) Inserção do porta corrediça na máquina. (D) fechamento da máquina. (E) início do protocolo de coloração. (F) foto ilustrativa de um slide após corte de micrótomo e coloração H & E. Painel à direita, H & E mancha representando a orientação da amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: H & E citológicas de amostras do colo formam ratos não tratados e tratados com DSS. H & E mancha dos não tratado (A) e tratados com DSS (B) amostras preparadas (processadas, embutidos, manchada) com automatizado (A, B) ou manual (C) métodos. Barra de escala = 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Mallory tricromo (A, B) e IHC citológicas de CD20 + células (C, D) de infiltrar-se não for tratada (A-C) e DSS tratados (B, D) ratos. Coloração de Mallory: azul, colágeno, rosa escuro, núcleos, vermelho escuro, citoplasma. Barra de escala = 100 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: comparação entre as análises histopatológicas com protocolos manuais e automatizados. (A) Total histopatológicos parâmetros avaliável em todas as seções preparadas com o manual (barras brancas) ou com o método automatizado (barras de roxos). (B) percentual dos parâmetros indicados nas amostras preparadas com o manual (barras brancas) ou com o método automatizado (barras de roxos) não tratadas (barras simples) ou ratos tratados com DSS (barras pontilhados). Significância estatística foi calculada usar pares combinados de Wilcoxon assinou o teste t de classificação. p < 0,05; p < 0.005. Quer dizer valor ± SEM são relatados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagente | tempo (min) | temperatura (° C) | pressão |
| NBF | 1 | RT | ambiente |
| Etanol 95% | 1 | RT | ambiente |
| Etanol 95% | 1 | RT | ambiente |
| Etanol 95% | 1 | RT | ambiente |
| Etanol absoluto | 1 | 45 | ambiente |
| Etanol absoluto | 11 | 45 | ambiente |
| Etanol absoluto | 30 | RT | ambiente |
| Xileno | 1 | RT | ambiente |
| Xileno | 1 | 45 | ambiente |
| Xileno | 28 | 45 | ambiente |
| Cera de parafina | 5 | 65 | vácuo |
Tabela 1: Automated protocolo de processamento do tecido.
| Ação perfomed pelo robô para cada gaveta |
| Remover uma gaveta do rack |
| Identificar a fita |
| Pré-aquecer o molde |
| Coloque a fita sobre o molde pré-aquecido |
| Retirar a quantidade de parafina para a gaveta |
| Arrefecer o molde |
| Deixe a parafina solidificar |
| Remover o bloco de parafina solidificada do molde |
| Presente do bloco para sensores de qualidade |
| Coloque o bloco de parafina na porta de saída |
Tabela 2: Automated protocolo de incorporação.
| Categoria | Critério | Definição | Valor da Pontuação |
| Infiltrado de células inflamatórias | Gravidade (densidade de leucócitos de área propria do lamina infiltrada em avaliados hpf) | Não há infiltrado | 0 |
| Mínimo aguda (< % de 10) | 0.25 | ||
| Crônica leve (10-25%, neutrófilos dispersados) | 0,5 | ||
| Moderada crônica (26-50%) | 0.75 | ||
| Marcado (> 51%, denso infiltrado) | 1 | ||
| Extensão (expansão de infiltração leucocitária) | Da mucosa | 0,5 | |
| Da mucosa e submucosa | 0.75 | ||
| Alterações epiteliais | Hiperplasia (aumento no número de células epiteliais em criptas longitudinais, visíveis como alongamento cripta) | Sem hiperplasia | 0 |
| Mínimo (< 25%) | 0.25 | ||
| Leve (26 – 35%) | 0,5 | ||
| Moderada (36 – 50%, mitoses no terço superior do epitélio cripta) | 0.75 | ||
| Marcado (> 51%, mitoses no epitélio cripta distante da cripta base) | 1 | ||
| Perda de células de Goblet (redução do número de células de goblet em relação ao número de células de cálice de base por cripta) | Sem perda | 0 | |
| Mínimo (< 25%) | 0.25 | ||
| Leve (26 – 35%) | 0,5 | ||
| Moderada (36 – 50%) | 0.75 | ||
| Marcado (> 51%) | 1 | ||
| Arquitetura da mucosa | Ulceração (defeito epitelial ultrapassam muscolaris mucosa oral) | Sem úlceras | 0 |
| Úlceras | 0.25 | ||
| Tecido de granulação (o reparo do tecido conjuntivo com novos capilares, rodeado por infiltração de células, hipertrofiada áreas) | Não tecido de granulação | 0 | |
| Tecido de granulação | 0.25 | ||
| Espessura da mucosa e cripta de profundidade | Não há espessamento | 0 | |
| Espessamento | 0,5 | ||
| Rarefação glandular | Sem rarefação | 0 | |
| Rarefação | 0,5 | ||
| Displasia | Sem displasia | 0 | |
| Displasia | 0,5 | ||
| PONTUAÇÃO DE MAX | 6 |
Tabela 3: Automatizado que mancha o protocolo.
| Ação perfomed pelo corante para cada slide | Reagente | tempo (s) | temperatura (° C) |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Deparaffinize | Xileno | 120 | RT |
| Deparaffinize | Xileno | 120 | RT |
| Hidratar | Etanol 96% | 120 | RT |
| Hidratar | Etanol 96% | 120 | RT |
| Lavagem | Wtaer destilada | 240 | RT |
| Hematoxilina de mancha | Hematoxilina de Carazzi | 540 | RT |
| Enxaguamento | Água da torneira | 360 | RT |
| Mancha de eosina | Solução de eosina Y 1% aqueos | 60 | RT |
| Enxaguamento | Água da torneira | 120 | RT |
| Desidratar | Etanol 96% | 20 | RT |
| Desidratar | Etanol 96% | 20 | RT |
| Desidratar | Etanol absoluto | 15 | RT |
| Desidratar | Etanol absoluto | 15 | RT |
| Clara | Xileno | 30 | RT |
| Clara | Xileno | 30 | RT |
Tabela 4: Marcar o esquema para a avaliação da inflamação intestinal.
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Discussion
Nós utilizamos diferentes etapas automatizadas durante a preparação dos tecidos murino para análise histopatológica. Este protocolo visa proporcionar dicas técnicas para aumentar a reprodutibilidade e a padronização de todo o processo, melhorando assim a qualidade geral da avaliação histopatológica final. Implementamos automatizado de instrumentos e métodos para a preparação e a incorporação de tecidos, rotineiramente utilizados em instalações de núcleo de patologia para o estudo de espécimes humanos.
Para demonstrar a aplicabilidade potencial deste método, escolhemos uma configuração experimental murino crônica de inflamação intestinal, chamada modelo de colite crônica induzida em DSS. Essa configuração se assemelha o curso da doença complexa observado em pacientes de DII, que necessitam de avaliação histológica elaborada para investigar as profundas alterações da arquitetura do tecido, ocorrendo após inflamação intestinal crônica. No total, a avaliação histológica destes processos pode beneficiar muito de qualidade de preparação de amostra maior. Para ter nota, este protocolo pode ser aplicado a outros tecidos murino (i.e., baço, linfonodos, fígado, cérebro), com a única diferença é que a fita orientada não é necessário para os tecidos sem um lúmen.
A observação mais importante foi que a diminuição de erros manuais, (ou seja,, a orientação da amostra) dado o uso de fitas com grades e a eliminação de gaveta re-abertura para a incorporação (uma etapa comumente realizada manual protocolos), fortemente reforçada a reprodutibilidade geral da análise. Com o protocolo descrito aqui, a amostra é manipulada apenas no início da preparação, quando o experimentador insere o tecido as cassetes orientado. Uma vez fechado, as fitas nunca são re-inauguradas, assim garantindo a manutenção da orientação correta e reduzindo erros manual3,11. A padronização destes dois passos críticos reforçada toda a qualidade das análises subsequentes e diminuiu o número de amostras perdidas ou não avaliável, problemas vinculados para a re-abertura da fita ou a orientação errada da amostra3 ,11.
Também foi possível avaliar um evento biológico complexo como fibrose (Figura 7), que é muitas vezes subestimado em modelos murino de inflamação intestinal experimental, pela implementação do protocolo automatizado. Durante a configuração do protocolo, nós estritamente padronizados detalhes técnicos como o tempo de fixação, o que percebemos não deve exceder 24 h para evitar alterações de tecido. Fazendo assim, preservamos a qualidade das análises subsequentes imuno-histoquímica.
O método automatizado melhorou a avaliação desses parâmetros associados à alteração da arquitetura do tecido, especialmente em ratos não tratados. Com efeito, a comparação correta de um tecido patológico com uma contrapartida saudável é criticamente importante para a avaliação final do modelo experimental3.
No que diz respeito ao processamento do tecido, testamos diferentes protocolos para ser executado no processador automatizado disponível no laboratório. O protocolo descrito aqui deu resultados de som e muito consistentes. Também implementamos um comprimento de tempo para o protocolo. Desde murino amostras eram comparáveis aos espécimes humanos de biopsic pequenos em tamanho, um protocolo mais curto foi suficiente para processar murino (intestinal, neste caso) os tecidos. Finalmente, o procedimento todo automatizado reduziu o tempo de experimental total. Desde o início do tratamento para o micrótomo e preparação de fatias, calculamos que o tempo total necessário é 5h. Pelo contrário, dependendo da habilidade técnica do operador, a conclusão dos protocolos mesmos manualmente pode exigir mais do que o dobro do tempo, especialmente durante o processamento e a incorporação. Um limite da técnica é que ele requer processadores automatizados e embedder a ser executada para ser em laboratório.
Em conclusão, acreditamos que a implementação desses protocolos automatizado grandemente poderia amenizar o trabalho dos investigadores translacionais lidando com murino modelos experimentais de doenças humanas.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos ao departamento de patologia do Hospital Policlínico IRCCS, Milão para suporte técnico e a facilidade de Animal OIE para assistência na pecuária.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10x | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1x | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
- Peters, S. R. A Practical Guide to Frozen Section Technique. , New York, N.S.N.Y. (2010).
- Rosai, J. Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. , Elsevier. (2011).
- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature. 2, 541-546 (2007).
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
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Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. An author affiliation was updated.
The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:
Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology
to:
Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS
