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Summary
Falta de estandarización para el procesamiento de tejido murino reduce la calidad del análisis histopatológico murino en comparación con los especímenes humanos. Aquí, presentamos un protocolo para realizar el examen histopatológico de tejidos colon inflamados y uninflamed murinos para demostrar la viabilidad de sistemas robóticos que se utilizan habitualmente para el tratamiento y la inclusión de muestras humanas.
Abstract
La comprensión de enfermedades humanas se ha ampliado considerablemente gracias al estudio de modelos animales. Sin embargo, la evaluación histopatológica de modelos experimentales debe ser tan riguroso como el que aplica para muestras humanas. De hecho, extraer conclusiones fiables y precisas críticamente está influenciada por la calidad de la preparación de la sección de tejido. Aquí, describimos un protocolo para el análisis histopatológico de los tejidos murinos que implementa varios pasos automatizados durante el procedimiento, desde la preparación inicial para la inclusión en parafina de las muestras murinas. La reducción de variables metodológicas mediante la estandarización de protocolo riguroso de procedimientos automatizados contribuye al aumento de la fiabilidad global del análisis patológico murino. Específicamente, este protocolo describe la utilización de tratamiento automatizado e incorporar sistemas robóticos, utilizado habitualmente para el proceso de tejido y la inclusión en parafina de muestras humanas, para procesar a muestras murinas de inflamación intestinal. Concluimos que la fiabilidad de la examinación histopatológica de los tejidos murinos se aumentó significativamente con la introducción de técnicas estandarizadas y automatizadas.
Introduction
En las últimas décadas, se han desarrollado varios modelos experimentales para diseccionar los mecanismos patogénicos que conducen a enfermedades humanas1,2. Para evaluar la severidad de una enfermedad, los investigadores deben evaluar el efecto de un tratamiento y estudiar las variaciones citológicas e histológicas arquitectónicas o la cantidad de inflamación3. Para realizar en los modelos experimentales, son necesarios los análisis histopatológicos detallados, a menudo comparando muestras murino y humano4,5.
Además, muestras humanas comúnmente son procesadas y anotó por las instalaciones del núcleo de histopatología y patólogos experimentados humanos a través de estandardizado métodos y criterios histopatológicos. Por el contrario, tejidos murinos son generalmente fijos, incrustados y analizados por los investigadores con experiencia limitada de protocolos histopatológicos. La calidad y fiabilidad de la examinación histopatológica comienza con la preparación de las secciones de tejido de alta calidad. Varios factores contribuyen críticamente al aumento o disminución de la calidad de definitiva, incluyendo fijación, macroscópica seccionamiento, procesamiento, de parafina inclusión, inclusión de las muestras6,7.
Todos estos pasajes que implican manipulación de la muestra están sujetos a errores manuales, incluyendo la inclusión manual de las muestras y, en menor medida, microtomo manual corte y tinción. En la actualidad, todo el proceso de preparación de tejido murino para la evaluación histológica se basa en protocolos manual y protocolos que varían de laboratorio a laboratorio. El objetivo de este estudio es implementar protocolos estandarizados automatizados para reducir errores y variabilidad en la examinación histopatológica murina.
A nuestro conocimiento, Describimos aquí los primeros protocolos de tejido completamente automatizado de procesamiento y embebido para la evaluación histológica de los tejidos murinos; Estos se utilizan habitualmente en las unidades de patología para el análisis de muestras humanas. Como un ejemplo práctico de la viabilidad del método, un modelo murino de inflamación intestinal ha sido analizado, es decir,, el modelo de colitis crónica causada por la administración repetida de sulfato de sodio de dextrano (DSS) en el agua potable8 ,9. Este ajuste experimental de cerca se asemeja a humano inflamatoria intestinal (EII) las enfermedades10 puesto que animales tratados con DSS exhiben signos de inflamación intestinal, por ejemplo, pérdida de peso, heces sueltas o diarrea y acortamiento del colon, así como fibrosis 8,9,11. Como observado en pacientes humanos con enfermedad inflamatoria intestinal, tratamiento de DSS genera un curso de la enfermedad compleja. En este contexto, elaboradas evaluaciones histológicas están obligadas a entender la profunda alteración de la arquitectura del tejido. Así, la aplicación de los protocolos descritos para aumentar la calidad de preparación de la muestra podría beneficiarse los investigadores basándose en la interpretación de histológicos y análisis immunohistochemical para la configuración experimental murino. Modelos experimentales murinos de enfermedades humanas que implican alteraciones de la arquitectura del tejido, la presencia de infiltrado de tejido celular o inflamación de diferentes tejidos y órganos (intestino, cerebro, hígado, piel) puede utilizar el aumento de la calidad de la preparación de muestras para examen histopatológico.
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Protocol
Procedimientos animales fueron aprobados por el Ministerio de salud (auth. 127/15, 27/13) y siguieron las pautas de cuidado de los animales del Instituto Europeo de Oncología IACUC (Comité de uso y cuidado Animal institucional)
1. crónica Colitis inducción administración de DSS repetitivas
- Independiente edad y sexo igualada ratones en 2 grupos (DSS tratamiento vs control H2O, al menos 5 hermanos de camada de ratones por grupo experimental).
- Administrar 2.5% DSS (40 kDa) en el agua potable para 7 días para el grupo de tratamiento y agua para el grupo de control.
Nota: Este modelo induce una inflamación intestinal crónica transmural del9. - Después de 7 días, interrumpir el tratamiento de la DSS y dar agua a ambos grupos durante 14 días. Repita este proceso 3 veces.
Nota: La administración repetitiva de DSS induce alteraciones de la mucosa colónica muy parecidas a la humana enfermedad inflamatoria intestinal, es decir, fibrosis9. - Ratones según los procedimientos autorizados por la IACUC institucional, es decir,, de sacrificio por inhalación de CO2 .
- Abrir el ratón abdomen y peritoneo con bisturí.
Nota: Esterilidad se recomienda pero no estrictamente necesarios. - Separar el colon del intestino con fórceps y pinzas. Suprimir los puntos con pinzas y pinzas.
Nota: Medida de la longitud del colon (figura 1A) es un método para determinar si la colitis se produjo en ratones tratados con DSS. - Enjuague el colon en una placa Petri con 10 mL de frío 1 x solución salina buffer fosfato (PBS) y presione suavemente para eliminar materia fecal.
2. fijación de tejidos murino
- Sumerja cada muestra de colon murino en 10 mL de 10% neutro tamponado con formalina (NBF) a TA (temperatura ambiente).
Nota: Esterilidad se recomienda pero no estrictamente necesarios. - Fijar el tejido durante 18 – 24 h a TA.
3. dos puntos de seccionamiento y preparación de tejido
- Saque los tejidos fijos el contenedor NBF con pinzas pequeñas y ponerlas en una placa Petri. Poner el colon en una placa de trabajo seccionamiento con pinzas pequeñas.
- Corte de dos puntos en fragmentos (0,2 cm y longitudes de 0.3 cm) con un bisturí estéril. Esta longitud de fragmento es óptima para no exceder el espesor de la cinta.
- Recoger segmento colon uno con pinzas pequeñas (figura 2A). Inserte el segmento colon una en uno de plástico que sobresalen puntas de la parafina orientada encajadura del cassette con pequeñas pinzas (figura 2B).
- Repetir la operación (3.2 – 3.3) con un segmentos de colon 3 adicional por cassette. Evitar insertar los segmentos adyacentes puntas salientes, para minimizar la acumulación de los tejidos
- Cierre firmemente la cinta presionando cuidadosamente los cuatro bordes (figura 2). Evite apretar el tejido para evitar daños en los tejidos.
- Inserte la rejilla en un bastidor de soporte plástico. La estructura de soporte para identificar la muestra de la etiqueta. Repita para cada muestra biológica.
4. procesamiento de tejido
- Encienda el procesador automatizado pulsando el botón de encendido (Figura 3A, 3B).
- Caliente durante 1 h para derretir la cera de parafina. Espere hasta que el instrumento confirma que la parafina se derrita totalmente, observando la presencia del icono dedicado (figura 3).
- Inserte cada cassette orientada (contiene a las muestras de tejido) manualmente en el cesto metal proporcionado por el procesador automatizado (figura 3D). Coloque verticalmente los cassettes de guarnición cerca de uno a otro para optimizar la ocupación de la cesta.
- Cerca de la canasta de metal (figura 3E).
- Abra la tapa de la retorta (figura 3F). La réplica es el lugar donde se inserta el cesto en la máquina. Inserte la cesta en el alojamiento dedicado del procesador (figura 3). Cierre la tapa de la retorta (figura 3 H).
- Utilice la pantalla táctil en el equipo del instrumento para definir el protocolo de trabajo (figura 3I). Elegir la secuencia de soluciones, tiempo y temperatura a implementarse según el esquema previsto en la tabla 1.
- Asignar el protocolo para ejecutarse en la réplica que contiene la cesta haciendo clic en el icono de PC dedicado (figura 3J). Iniciar el protocolo haciendo clic en el Botón de inicio (figura 3 L).
- Espere hasta que el instrumento confirma el final del Protocolo, mediante la observación de la presencia del icono dedicado y escuchando el tono de alarma de la máquina.
- Abra la tapa de la réplica. Retire la cesta del procesador (figura 3 M).
5. tejido incrustar
- Encienda el embedder automática presionando el botón de encendido (Figura 4A).
- Caliente durante 1 h para derretir la cera de parafina. Espere hasta que el instrumento confirma que la parafina se derrita totalmente mediante la observación de la temperatura del baño de parafina indicada por el termómetro interno del instrumento.
- Transferir manualmente todos los cassettes procesados de la canasta del procesador a la rejilla embebido. Cada rack puede contener hasta 32 casetes. (Figura 4B, 4C).
- Abra la tapa principal embedder (figura 4, 4D, 4E).
- Utilice la pantalla táctil del equipo de instrumentos para indicar que la robótica sistema que un rack está siendo insertado (figura 4F).
- Abra la tapa de la caja de entrada (figura 4). Inserte la rejilla en la caja de entrada. Cada embebido puede contener hasta 4 estantes simultáneamente (figura 4 H, 4I). Cierre la tapa de entrada (figura 4J).
- Utilice la pantalla táctil en la computadora de instrumento para iniciar el procedimiento de inclusión, según la tabla 2 (figura 4 K).
Nota: Cada rack de 32 casetes tiene 45 minutos para empotrar. - Espere hasta que el instrumento confirma el final del Protocolo, mediante la observación de la presencia del icono dedicado (figura 4 L).
- Retire también la parrilla de salida (figura 4 M). Cierre la tapa principal embedder.
- Retire los bloques incrustados (contiene las redes de orientación) de la rejilla. La transferencia de los bloques integrados en una caja de cartón de almacenamiento.
6. micrómetro de seccionamiento
- Encienda la placa de enfriamiento del microtomo. Temperatura entre -8 y -10 ° C.
- Encender el baño de agua termostático del microtomo, que contiene 2 L de agua destilada. Fijar la temperatura del baño María entre 42 – 45 ° C.
- Lugar la parafina había incrustado bloques en la placa de enfriamiento. Espere al menos 5 minutos para permitir que los bloques se enfríe.
- Tome un bloque de la placa de enfriamiento y colóquelo en el soporte del bloque micrótomo.
- Establecer el micrótomo grueso a 10 μm. Ajuste del bloque del corte cortando 6 veces en 10 μm de grosor.
- Cambiar el ajuste de espesor del microtoma de 10 μm a 3 μm. corte 3 μm sección de hematoxilina y eosina (H & E) tinción.
-
Recoge la sección de 3 μm con un cepillo pequeño. Poner la sección de 3 μm en el baño de agua, puesta con cuidado sobre la superficie del agua para reducir las arrugas del tejido. Recoge la sección del tejido desde el baño de agua termostáticamente controlada sobre un portaobjetos de vidrio solo.
- Si es necesario, cortar secciones adicionales.
- Etiquetar el portaobjetos de cristal por escrito la identificación de la muestra.
- Poner los portaobjetos en un horno de 37 ° C durante al menos 10 minutos.
- Poner laminas de vidrio racks para análisis inmediato o en cajas de almacenamiento.
7. hematoxilina y eosina (H & E)
- Encienda el stainer automatizado pulsando el botón de encendido. Permite la inicialización del brazo robótico, observando el cambio de la barra de carga en la pantalla del instrumento.
- Inserte las diapositivas de cristal en el rack de stainer, introduciendo verticalmente hasta 30 diapositivas.
- Etiqueta de la rejilla con la etiqueta de plástico apropiado radio frecuencia identificación (RFID). Etiquetado RFID es un sistema que identifica el protocolo de tinción correcta cargado en la computadora de stainer.
- Inserte la rejilla en el filtro. Deje que el ordenador automáticamente la carga y empezar el protocolo de tinción según el reconocimiento de la etiqueta de RFID.
Nota: El protocolo para la tinción de H & E se describe en tabla 3.
8. la coloración de Immunohistochemical
- Realizar inmunohistoquímica y Mallory trichrome de tinción como se describió anteriormente7.
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Representative Results
La colitis crónica experimental inducida por la administración repetida de DSS en el agua potable es un modelo murino de inflamación intestinal muy parecidas a la humana EII8,9. La figura 1 describe los efectos del tratamiento de DSS, incluyendo colon acortar (figura 1A), un parámetro utilizado para anotar la presencia de la inflamación inducida por DSS y colon expresión de genes proinflamatorios incluyendo CXCL10 , tnf y mcp-1 (figura 1B). Infiltración de células inflamatorias fue realzada grandemente por el tratamiento de DSS, que muestra una selección de la respuesta inmune en la lámina propia intestinal como analizados por cytofluorimetry (figura 1).
Figura 2 muestra los tejidos cómo colónicos son seccionadas e insertado en los cassettes orientados. Estas cintas están diseñados para contener exteriormente una cuadrícula con extrusión puntas, permitiendo la inserción del tejido vertical y con la orientación adecuada, es decir,, con la luz en la parte interna y la pared (figura 2A, 2B, C 2 ). Una vez que los cassettes están cerrados, la orientación del tejido se conserva por las rejillas, al contrario de lo que sucede con cassettes histológicos convencionales (figura 2B).
El proceso de tejido se realiza con un procesador automatizado (Figura 3A-3 M y tabla 1), mientras que la incrustación de procedimiento se realiza con un embedder automatizado (Figura 4A-4 M y tabla 2). En este último instrumento, un robot recoge los cassettes y dispensa la cantidad correcta de parafina. Finalmente, utilizando un micrótomo, se cortan secciones de cada bloque de parafina. Las diapositivas entonces se preparan para su posterior análisis.
Figura 5 describe los principales pasajes de la automática H & E tinción (figura 5A-5E y tabla 3) y aparecen de las diapositivas después de H & E tinción (figura 5F). Figura 6 y 7 muestran cómo la aplicación del tratamiento automatizado de los protocolos de inclusión aumentar fuertemente la calidad de los análisis histopatológicos de las muestras de colon murinos. Los stainings de H & E de muestras preparadas con los protocolos automatizados derivados de ratones no tratados (figura 6A) se compararon con los de los ratones tratados de DSS (Figura 6B). Resultados histopatológicos fueron evaluados mediante la evaluación de las modificaciones de parámetros diferentes que ocurren en la mucosa intestinal, incluyendo inflamación células infiltración, alteraciones epiteliales y cambios de la arquitectura de la mucosa como se describe en Tabla 4. Figura 6 muestra un representante de H & E tinción de un tejido colónico procesados manualmente e incluidas en cassettes tradicionales. En la figura 7, la calidad de la preparación del tejido murino e incrustación realizada con instrumentos automatizados fue confirmada además por IHC de CD20 y Mallory trichrome tinción8,9 en colon secciones de no tratadas (Figura 7A, 7C) y tratados con DSS (figura 7B, 7D) ratones.
Figura 8 describe la importancia práctica de este método. Las mismas muestras de colon fueron procesadas e incrustadas manualmente o a través de métodos automáticos. Cada muestra (ya sea el control o tratamiento de DSS) fue cortado en 2 partes iguales y procesado en paralelo con el manual o con métodos automáticos. Tinción H & E fue realizada y una evaluación microscópica completa sobre todos los parámetros patológicos abordar cambios en la arquitectura de la mucosa, granularidad, células inmunitarias infiltrarse, espesor mucosa glandular vacuo normalmente observado durante la inflamación intestinal, se evaluó para cada muestra, tanto para el manual y automatizado de protocolo (figura 8A y tabla 4). La preparación de las muestras con el protocolo automatizado permite constantemente la evaluación de una mayor proporción de parámetros histológicos que el método manual. Además, se realizó un análisis separado de los diferentes parámetros histológicos (figura 8B). La arquitectura y la evaluación de infiltrado basal fueron positivamente afectadas, especialmente en ratones no tratados, por la preparación de la muestra con el método automatizado.
El método automatizado para la muestra de incrustación actualmente utilizado para análisis histopatológicos humanos y procesamiento puede aplicarse con éxito para el análisis de muestras murinos. Ejemplares de alta calidad son generados con el método automatizado que demuestra la superioridad sobre el método manual en la evaluación de la arquitectura y el infiltrado inmune basal de los tejidos de colon murinos.
Figura 1: evaluación de la inflamación intestinal crónica. (A) medida de la longitud de Colon. (B) colon expresión de genes proinflamatorios (cxcl10, tnf, mcp-1) en Tratado de DSS (negro barras, números = 12) y sin tratar de ratones (blanco barras, números = 6). (C) Immunophenotyping de lámina propia colónica células en tratados de DSS (cerrado símbolos, números = 12) y sin tratar de ratones (abrir símbolos, números = 6). CD11b + Ly6G + neutrófilos, CD11b + F4 / 80 + macrófagos (panel izquierdo), CD4 + y CD8 + T células infiltración (panel derecho) en los controles (abrir símbolos, números = 10) y los ratones tratados con DSS (cerrado de símbolos, números = 10). Significancia estadística se calculó usando pares emparejados de Wilcoxon firmado prueba t fila. p ≤ 0.05 ** p ≤ 0.01. Promedio ± de valor SEM se divulgan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Descripción de la preparación de la muestra. (A) los instrumentos necesarios para preparación de tejido y el cuadro de la cinta orientada, compuesto por un cassette externo (blanco) y red interna con extrusión consejos de orientación. (B, C) Inserción de murinos colones en las redes internas del cassette antes de (B) y después (C) cierre de las rejillas. En el panel B se muestra la cinta orientada (izquierda) o en un cassette tradicional (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Descripción del procesamiento automatizado de. Procesador automatizado de (A, B). Icono de (C) describir la correcta temperatura de fusión la cera de parafina. (D, E) Inserción del cassette en la cesta metálica (D) y su cierre (E). (F, G, H) Inserción de la canasta de metal en la retorta. (I, J, K) Selección del Protocolo de tratamiento. (L) funcionamiento del protocolo. (M) retiro de la forma de la cesta la réplica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Descripción de encajadura automatizada . (A) imagen del embedder automatizado. (B, C) Inserción de los cassettes en el rack. (D, E) (D) de apertura y cierre (E) de la tapa. Señalización (F) a la máquina de la presencia de un bastidor. (G, H) Inserción de la cremallera en la caja de entrada. (I, J) cierre de la tapa. (K) Inicio del Protocolo de inclusión. (L) apertura de la tapa de salida. (M) retiro de la forma de rejilla salida de caja. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Descripción de stainer automatizado de H & E. (A) imagen de titular de la diapositiva. (B, C) Inserción del titular de la diapositiva en la máquina. (D) cierre de la máquina. (E) Inicio del Protocolo de tinción. (F) cuadro ejemplificativo de una diapositiva después del micrótomo corte y tinción H & E. Panel de la derecha, H & E tinción que representa la orientación de la muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: los stainings H & E de las muestras colon forman ratones no tratados y tratados con DSS. H & E tinción de no tratadas (A) y tratado de DSS (B) muestras preparadas (procesada, incrustado, teñido) con automatizado (A, B) o manual (C) métodos. Barra de escala = 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: tricrómica de Mallory (A, B) y los stainings IHC de CD20 + células (C, D) de la infiltración, sin tratamiento (A-C) y tratados de DSS (B, D) ratones. Tinción de Mallory: azul, colágeno, rosa oscuro, núcleos, rojo oscuro, citoplasma. Barra de escala = 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: comparación entre análisis histopatológicos con protocolos automatizados y manual. (A) Total histopatológicos parámetros evaluables en todas las secciones preparadas con el manual (barras blancas) o con el método automatizado (barras de color púrpura). (B) porcentaje de los parámetros indicados en las muestras preparadas con el manual (barras blancas) o con el método automatizado (barras de color púrpura) en no tratados (barras llanas) o los ratones tratados con DSS (barras punteadas). Significancia estadística se calculó usando pares emparejados de Wilcoxon firmado prueba t fila. p < 0.05; p < 0.005. Promedio ± de valor SEM se divulgan. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo de | tiempo (min) | temperatura (° C) | presión |
| NBF | 1 | RT | ambiente |
| Etanol 95% | 1 | RT | ambiente |
| Etanol 95% | 1 | RT | ambiente |
| Etanol 95% | 1 | RT | ambiente |
| Etanol absoluto | 1 | 45 | ambiente |
| Etanol absoluto | 11 | 45 | ambiente |
| Etanol absoluto | 30 | RT | ambiente |
| Xileno | 1 | RT | ambiente |
| Xileno | 1 | 45 | ambiente |
| Xileno | 28 | 45 | ambiente |
| Cera de parafina | 5 | 65 | vacío |
Tabla 1: Automatizado de protocolo de proceso de tejido.
| Acciones realizadas por el robot para cada cassette |
| Quitar un cassette de la rejilla |
| Identificar el cartucho de |
| Precalentar el molde |
| Coloque el cartucho en el molde precalentado |
| Dispensar la cantidad de parafina para el cassette |
| Enfriar el molde |
| Permitir que la parafina se solidifique |
| Desmoldar el bloque de parafina solidificada |
| Actualmente el bloque a los sensores de la calidad |
| Coloque el bloque de parafina en la puerta de salida |
Tabla 2: Automatizado de incrustación de protocolo.
| Categoría | Criterio | Definición | Valor de puntaje |
| Infiltrado de células inflamatorias | Gravedad (densidad del leucocito del área del propria de la lámina infiltrada en evaluar hpf) | No infiltrado | 0 |
| Mínimo agudo (< 10%) | 0.25 | ||
| Crónica leve (10-25%, neutrófilos dispersos) | 0.5 | ||
| Moderada crónica (26 – 50%) | 0.75 | ||
| Marcada (> 51%, denso infiltrado) | 1 | ||
| Medida de lo (extensión de la infiltración de leucocitos) | Mucosa | 0.5 | |
| Mucosa y submucosa | 0.75 | ||
| Cambios epiteliales | Hiperplasia (aumento en el número de células epiteliales en criptas longitudinales, visibles como alargamiento de la cripta) | Sin hiperplasia | 0 |
| Mínima (< 25%) | 0.25 | ||
| Leve (26-35%) | 0.5 | ||
| Moderada (36-50%, mitosis en el tercio superior del epitelio de la cripta) | 0.75 | ||
| Marcada (> 51%, mitosis en el epitelio de la cripta distante de base de la cripta) | 1 | ||
| Pérdida de células caliciformes (reducción del número de células caliciformes en relación con el número de células caliciformes de línea de base por cripta) | Sin pérdida de | 0 | |
| Mínima (< 25%) | 0.25 | ||
| Leve (26-35%) | 0.5 | ||
| Moderada (36 – 50%) | 0.75 | ||
| Marcada (> 51%) | 1 | ||
| Arquitectura de mucosa | Ulceración (más allá de la mucosa muscolaris del defecto epitelial) | No úlceras | 0 |
| Úlceras | 0.25 | ||
| Tejido de granulación (reparación del tejido conectivo con nuevos capilares, rodeados por las células, la infiltración hipertrofiadas áreas) | No hay tejido de granulación | 0 | |
| Tejido de granulación | 0.25 | ||
| Profundidad del espesor de la mucosa y la cripta | No hay engrosamiento | 0 | |
| Engrosamiento | 0.5 | ||
| Vacuo glandular | No vacuo | 0 | |
| Vacuo | 0.5 | ||
| Displasia | Sin displasia | 0 | |
| Displasia | 0.5 | ||
| MAX PUNTUACIÓN | 6 |
Tabla 3: Automatizado protocolo de tinción.
| Acciones realizadas por el filtro de cada diapositiva | Reactivo de | tiempo (s) | temperatura (° C) |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Essicate | 180 | 60 | |
| Desparafinizar | Xileno | 120 | RT |
| Desparafinizar | Xileno | 120 | RT |
| Hidrato de | Etanol 96% | 120 | RT |
| Hidrato de | Etanol 96% | 120 | RT |
| Lavado | Wtaer destilada | 240 | RT |
| Tinción de hematoxilina | Hematoxilina de Carazzi | 540 | RT |
| Enjuague | Agua del grifo | 360 | RT |
| Tinción de eosina | Solución de eosina 1% aqueos | 60 | RT |
| Enjuague | Agua del grifo | 120 | RT |
| Deshidratar | Etanol 96% | 20 | RT |
| Deshidratar | Etanol 96% | 20 | RT |
| Deshidratar | Etanol absoluto | 15 | RT |
| Deshidratar | Etanol absoluto | 15 | RT |
| Claro | Xileno | 30 | RT |
| Claro | Xileno | 30 | RT |
Tabla 4: Puntuación esquema para la evaluación de la inflamación intestinal.
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Discussion
Utilizamos diferentes pasos automatizados durante la preparación de tejidos murinos para análisis histopatológico. Este protocolo tiene como objetivo brindar consejos técnicos para aumentar la reproducibilidad y la estandarización de todo el proceso, mejorando así la calidad de la evaluación histopatológica definitiva. Implementamos instrumentos automatizados y métodos para la preparación y fijación de los tejidos, habitualmente utilizados en las instalaciones de base de patología para el estudio de especímenes humanos.
Para demostrar la potencial aplicabilidad de este método, elegimos un entorno experimental murino crónico de inflamación intestinal, llamado modelo de colitis crónica inducida por DSS. Esta configuración se asemeja a curso de la enfermedad complejo observado en pacientes IBD, que requiere la evaluación histológica elaborada para investigar las alteraciones profundas de la arquitectura del tejido que ocurren a los inflamación intestinal crónica. En conjunto, la evaluación histológica de estos procesos podría beneficiarse de la calidad de preparación de la muestra mayor. A la nota, este protocolo puede aplicarse a otros tejidos murinos (bazo, ganglios linfáticos, hígado, cerebro), con la única diferencia es que el cassette orientado no es necesaria para los tejidos sin una luz.
La observación más importante fue que la disminución de errores manuales, (es decir,, la orientación de la muestra) dado el uso de bandejas con rejillas y la eliminación del cassette reapertura para la inclusión (un paso realizado comúnmente durante el manual los protocolos), fuertemente mejorada la reproducibilidad total del análisis. Con el protocolo descrito aquí, se manipula la muestra solamente al principio de la preparación, cuando el experimentador introduce el tejido en los cassettes orientados. Una vez cerrada, los cassettes nunca se volvió a abrir, así asegurando el mantenimiento de la orientación correcta y la reducción de errores manuales3,11. La estandarización de estos dos pasos críticos mejora la calidad todo el análisis posterior y disminuyó el número de muestras perdidas o no valorables, problemas ambos ligados a la reapertura del cassette o a la incorrecta orientación de la muestra3 ,11.
También tuvo éxito en la evaluación de un evento biológico complejo como la fibrosis (figura 7), que muy a menudo se subestima en modelos murinos de inflamación intestinal experimental, mediante la implementación del protocolo automatizado. Durante la configuración del Protocolo, nosotros estrictamente estandarizado detalles técnicos como el tiempo de fijación, que nos dimos cuenta que no debe exceder 24 h para evitar alteraciones del tejido. Al hacerlo, podríamos preservar la calidad de los análisis immunohistochemical subsecuente.
El método automatizado mejora la evaluación de los parámetros asociados a la alteración de la arquitectura del tejido, especialmente en ratones no tratados. De hecho, la comparación correcta de un tejido patológico con una contraparte saludable es críticamente importante para la evaluación final del modelo experimental3.
En cuanto al proceso de tejido, probamos diferentes protocolos para ejecutarse en el procesador automatizado disponible en el laboratorio. El protocolo descrito aquí dieron resultados altamente consistentes y sonidos. Implementamos también una longitud del tiempo para el protocolo. Desde muestras murinas eran comparables a especímenes humanos de biopsic pequeño en tamaño, un protocolo más corto era suficiente para procesar murino (intestinal, en este caso) los tejidos. Por último, el procedimiento automatizado conjunto redujo el tiempo experimental total. Desde el comienzo del proceso para la preparación de rodajas y corte microtomo, calculamos que el tiempo total requerido es de 5 h. Por el contrario, dependiendo de la capacidad técnica del operador, la terminación de los mismos protocolos manualmente puede requerir más de doble de la cantidad de tiempo, especialmente durante el procesamiento y la fijación. Un límite de la técnica es que requiere procesadores automatizados y embebido a realizarse en el laboratorio.
En conclusión, creemos que la implementación de estos protocolos automatizados podría mejorar grandemente el trabajo de investigadores traslacionales con modelos experimentales murinos de enfermedades humanas.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Departamento de patología del IRCCS Policlinico Hospital, Milan para el soporte técnico y la facilidad de Animal de IEO para asistencia en la ganadería.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absolute Ethanol anhydrous | Carlo Erba | 414605 | reagent |
| Absolute ETOH | Honeywell | 02860-1L | reagent |
| Aluminium Potassium Sulfate | SIGMA | A6435 | reagent |
| Aniline Blue | SIGMA | 415049 | reagent |
| carbol Fuchsin | SIGMA | C4165 | reagent |
| CD11b (clone M1/70) | TONBO biosciences | 35-0112-U100 | antibody |
| CD20 IHC (clone SA275A11) | Biolegend | 150403 | antibody |
| CD3 (17A2) | TONBO biosciences | 35-0032-U100 | antibody |
| CD4 (GK1.5) | BD Biosciences | 552051 | antibody |
| CD45.2 (clone 104) | BioLegend | 109837 | antibody |
| CD8 (53-6.7) | BD Biosciences | 553031 | antibody |
| Citrate Buffer pH 6 10x | SIGMA | C9999 | reagent |
| Dab | Vector Laboratories | SK-4100 | reagent |
| DPBS 1x | Microgem | L0615-500 | reagent |
| DSS | TdB Consultancy | DB001 | reagent |
| EDTA | SIGMA | E9884 | reagent |
| EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex Substrate | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex/HRP | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| EnVision Flex+ Rat Linker | DAKO | compreso in GV80011-2 | |
| Eosin | VWR | 1.09844 | reagent |
| F4/80 (clone BM8) | BioLegend | 123108 | antibody |
| Formalin | PanReac | 2,529,311,215 | reagent |
| glacial acetic acid | SIGMA | 71251 | reagent |
| Goat-anti-Rat-HRP | Agilent DAKO | P0448 | antibody |
| Haematoxylin | DIAPATH | C0303 | reagent |
| LEICA Rotary microtome (RM2255) | Leica | RM2255 | equipment |
| Ly6g (clone 1A8) | BD Biosciences | 551459 | antibody |
| Mercury II Oxide | SIGMA | 203793 | reagent |
| Omnis Clearify Clearing Agent | DAKO | CACLEGAL | reagent |
| Omnis EnVision Flex TRS | DAKO | GV80011-2 | reagent |
| Orange G | SIGMA | O3756 | reagent |
| Paraffin | Sakura | 7052 | reagent |
| Peloris | LEICA | equipment | |
| Percoll | SIGMA | P4937 | reagent |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Microgem | L0501-500 | reagent |
| STS020 | Leica | equipment | |
| Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette | SAKURA | 7022 | equipment |
| Tissue-Tek Automated paraffin embedder | Sakura | equipment | |
| Xylene | J.T.Baker | 8080.1000 | reagent |
References
- Gibson-Corley, K. N., et al. Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research. Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).
- Olivier, A. K., et al. Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory. Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).
- Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. Principles for valid histopathologic scoring in research. Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).
- Stolfi, C., et al. Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer. The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).
- Begley, C. G., Ellis, L. M. Drug development: Raise standards for preclinical cancer research. Nature. 483, 531-533 (2012).
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- Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease. Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).
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- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory bowel disease. Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).
- Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis. European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).
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Inmunología e infección número 143 el análisis histopatológico modelos murinos automatización encajadura del sistema estandarización murinos especímenes intestinalesErratum
Formal Correction: Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses
Posted by JoVE Editors on 02/03/2019.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses. An author affiliation was updated.
The affiliation for Claudia Burrello and Federica Facciotti was updated from:
Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology
to:
Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS
