Robot sistemleri kullanarak işlemek ve histolojik analizler için kolon fare örnekleri katıştır

Summary

Belirli fare doku işleme için fare histopatolojik analiz insan numuneler ile karşılaştırıldığında kalitesini azaltır. Burada, robot sistemleri işleme ve insan örnekleri katıştırma için rutin olarak kullanılan fizibilite göstermek için fare iltihaplı ve uninflamed kolon dokularında histopatolojik incelenmesi gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

İnsan hastalıkları anlayış hayvan modelleri çalışma sayesinde büyük ölçüde genişletti. Yine de, deneysel modeller histopatolojik değerlendirilmesi olarak insan örnekler için uygulanan sıkı olması gerekiyor. Nitekim, güvenilir ve doğru kararınızı eleştirel doku bölümü hazırlık kalitesi ile etkilenir. Burada, biz yordam, parafin gömmenin fare örnekleri ilk hazırlanması sırasında birkaç otomatik adımları uygular histopatolojik analiz fare dokuların bir protokol tanımlamak. Metodolojik değişkenler üzerinden titiz Protokolü standardizasyon otomatik yordamlar gelen azalma artan genel güvenilirliğini fare patolojik analiz için katkıda bulunur. Özellikle, bu iletişim kuralını otomatik işleme kullanımını açıklar ve robot sistemleri, gömme rutin olarak doku işleme ve parafin insan örnekleri katıştırma için fare bağırsak iltihabı örnekleri işlemek için kullanılan. Biz standart ve otomatik teknikleri getirilmesi fare dokuların histopatolojik muayene güvenilirliğini önemli ölçüde arttığını sonucuna.

Introduction

Son yıllarda, insan hastalıkları^1,2için önde gelen patojenik mekanizmaları incelemek için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bir hastalığın şiddetini değerlendirmek için araştırmacılar bir tedavinin etkisini değerlendirmek ve çalışma saytolojik ve histolojik mimari farklılıklar veya iltihap³miktarı. Bu modeller üzerinde gerçekleştirmek için detaylı histopatolojik analizler, fare ve insan örnekleri^4,5kez karşılaştırma ihtiyaç vardır.

Ayrıca, insan örnekleri yaygın olarak işlenir ve histopatoloji çekirdek özellikleri tarafından attı ve histopatolojik kriterleri ve yöntemleri ile deneyimli insan patologlar standart. Bunun tersi olarak, fare dokular genellikle sabit, gömülü ve histopatolojik iletişim kurallarının sınırlı deneyimi olan araştırmacılar tarafından incelendi. Histopatolojik inceleme güvenilirliğini ve kalitesini yüksek kaliteli doku bölümleri hazırlanması ile başlar. Çeşitli faktörler eleştirel artmak ya da azalmak fiksasyon, makroskopik dahil olmak üzere son tahlilde kalitesini kesit, işleme, alkol gömme ve örnekleri^6,7/ katıştırma için katkıda bulunur.

Manipülasyon örneği içeren bu pasajlar el ile hataları el ile gömme örnekleri de dahil olmak üzere ve daha az bir ölçüde, kesit ve boyama el ile microtome tabi tutulmaktadır. Şu anda, tüm fare doku hazırlık histolojik değerlendirme için Laboratuvar Laboratuvar farklı protokolleri ve el ile iletişim kuralları üzerinde dayanır. Bu çalışmanın amacı hatalar ve fare histopatolojik Muayene değişkenliği azaltmak için standart otomatik iletişim kuralları uygulamaktır.

Bilgimizi, burada ilk iletişim kuralları işleme ve fare dokuların histolojik değerlendirme için gömme tam otomatik dokusu için tanımlamak; Bunlar düzenli olarak insan numune analizleri için patoloji birimlerinde kullanılır. Yöntem fizibilite pratik bir örnek olarak, bağırsak iltihabı fare modeli, yani analiz edilmiştir, kronik kolit modeli tarafından neden yinelenen yönetim dextran sodyum sülfat (DSS) içme suyu^{8 ,9}. DSS-tedavi hayvanlar Örneğin, kilo kaybı, gevşek dışkı veya ishal ve kolon gibi fibrozis ^{kısalma bağırsak iltihabı belirtileri sergileyen bu yana bu deneysel ayarı yakından benzer insan iltihabi bağırsak hastalıkları (IBD)10 8,9,11}. İnsan IBD hastalar için gözlemlediği gibi DSS tedavi karmaşık hastalık sahası oluşturur. Bu bağlamda, ayrıntılı histolojik değerlendirme doku mimari derin İLETİMLERİNİZE anlamak için gereklidir. Bu nedenle, örnek hazırlık kalitesini artırmak için açıklanan protokoller uygulanması histolojik yorumlanması güvenerek araştırmacılar yararlanabilir ve immunohistokimyasal için fare deneysel ayarları inceliyor. İnsan hastalıkları doku mimari değişiklikler içeren fare deneysel modelleri, hücresel doku sızmak ya da farklı doku ve organların (bağırsak, beyin, karaciğer, cilt) iltihabı varlığı artan kalitesini kullanabilirsiniz histopatolojik inceleme için örnek hazırlanması.

Protocol

Hayvan yordamlar İtalyanca (auth 127/15, 27/13) Sağlık Bakanlığı tarafından kabul edildi ve onkoloji IACUC (kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi) Avrupa Enstitüsü ve hayvan bakımı kuralları takip

1. kronik kolit indüksiyon tekrarlayan DSS yönetim tarafından

1. Ayrı yaş ve cinsiyet 2 grup (kontrol H₂O vs tedavi DSS, deney grubu başına en az 5 fareler littermates) farelerde eşleştirdi.
2. % 2.5 yönetmek DSS (40 kDa) 7 gün tedavi grubuna ve kontrol grubuna su içme suyu.
   Not: Bu model bir kronik transmural bağırsak iltihabı⁹neden olmaktadır.
3. 7 gün sonra DSS tedaviyi durdurunca ve 14 gün boyunca her iki grup için su verin. Bu işlem 3 kez tekrarlayın.
   Not: DSS tekrarlayan yönetim yakından insan IBD, yani, fibrozis⁹benzeyen bağırsak mukoza değişikliklere neden olmaktadır.
4. Fareler tarafından kurumsal IACUC, yani yetkili yordamlara, göre CO₂ inhalasyon tarafından kurban.
5. Fare karın ve karın zarını neşterle açmak.
   Not: Kısırlık önerilir ancak kesinlikle gerekli.
6. İki nokta üst üste ince bağırsak forseps ve cımbız ile ayırın. İki nokta üst üste cımbız ve forseps ile tüketim.
   Not: İki nokta üst üste uzunluk ölçüm (Şekil 1A) kolit DSS tedavi edilen farelerde meydana Eğer belirlemek için bir yöntemdir.
7. Bir petri soğuk 1 fosfat tampon serum (PBS) x 10 mL ile iki nokta üst üste durulama ve fekal malzeme çıkarmak için hafifçe bastırın.

2. fare doku fiksasyon

1. 10 ml % 10 fare her iki nokta üst üste numune bırakın tarafsız arabelleğe alınmış Formalin (NBF) RT (Oda sıcaklığında).
   Not: Kısırlık önerilir ancak kesinlikle gerekli.
2. 18-24 h için doku RT. düzeltmek

3. kolon kesit ve doku hazırlık

1. Sabit dokular NBF kapsayıcıdan küçük cımbızla çıkarın ve bir kabında koydu. İki nokta üst üste ile küçük cımbız bir parça iş tabağa koy.
2. İki nokta üst üste parçaları (0,3 cm uzunlukları 0.2 cm) steril neşter ile kesti. Bu parça uzunluğu kaset kalınlığını aşmayacak şekilde sırayla en iyi yöntemdir.
3. Bir iki nokta üstüste segmenti kadar küçük cımbızla (Şekil 2A) seç. Bir iki nokta üstüste kesimi küçük cımbızla (Şekil 2B) kaset katıştırma odaklı parafin ipuçları çıkıntılı plastik birini takın.
4. Kaset başına bir ek 3 iki nokta üstüste parçalarla (3.2-3.3) işlemini yineleyin. Segmentleri dokuları örtüşen en aza indirmek için bitişik çıkıntılı ipuçları ekleme kaçının
5. Sıkıca kaset dikkatle dört kenarları (Şekil 2C) iterek kapatın. Doku hasarı önlemek için doku sıkma kaçının.
6. Izgarayı plastik bir destek çerçeve içine yerleştirin. Örnek tanımlamak için destekleyici çerçeve etiket. Her biyolojik örnek için yineleyin.

4. doku işleme

1. Otomatik işlemcilerde (Şekil 3A, 3B) güç düğmesine basarak kapatın.
2. Sıcak Parafin balmumu erime sağlamak için 1 h için. Parafin tamamen özel simge (Şekil 3 c) varlığı gözlemleyerek erimiş araç doğrular kadar bekleyin.
3. Otomatik işlemcisi (şekil 3D) tarafından sağlanan metal sepet içine odaklı kaset (doku örnekleri içeren) her el ile ekleyin. Kasetleri yakın bir diğer sepet doluluk optimize etmek için astar tarafından dikey olarak yerleştirin.
4. Metal sepet (Şekil 3E) kapatın.
5. İmbik (Şekil 3F) kapağını açın. İmbik sepeti makinenin içine yerleştirildiği yer. Sepet işlemci (Şekil 3 g) özel gövde içine yerleştirin. İmbik (Şekil 3 H) kapağını kapatın.
6. Dokunmatik ekran araç bilgisayarda çalışma Protokolü (Şekil 3I) tanımlamak için kullanın. Çözüm, zamanlama ve Tablo 1' de sağlanan düzenine göre uygulanacak sıcaklık sırasını seçin.
7. Sepeti (Şekil 3J) özel bilgisayar ikonuna tıklayarak içeren imbik çalıştırılması için iletişim kuralı atayın. Protokolü Başlat düğmesini (Şekil 3 L) yanında tıkırtı üstünde başlamak.
8. Özel simge varlığı gözlemleyerek ve makine gelen alarm zil sesi işitme tarafından Protokolü ' nün sonu araç onaylar kadar bekleyin.
9. İmbik kapağını açın. Sepet işlemciden (Şekil 3 M) kaldırın.

5. doku gömme

1. Otomatik embedder (Şekil 4A) güç düğmesine basarak kapatın.
2. Sıcak Parafin balmumu erime sağlamak için 1 h için. Parafin tamamen aracı dahili termometre tarafından belirtilen parafin banyo sıcaklığı gözlemleyerek erimiş araç onaylar kadar bekleyin.
3. Elle işlenmiş kaset işlemci sepetten embedder raf aktarın. Her raf en çok 32 kaset içerebilir. (Şekil 4B, 4 C).
4. (Şekil 4 c, 4 D, 4E) ana embedder kapağı açın.
5. Araç bilgisayarda robot için sinyal için dokunmatik ekranı kullanın bir raf olmak sistem takılı (Şekil 4F).
6. Giriş konut kapak (Şekil 4 g) açın. Raf giriş gövde içine yerleştirin. Her embedder aynı anda 4 raflar içerebilir (Şekil 4 H, 4I). (Şekil 4J) giriş konut kapağını kapatın.
7. Dokunmatik ekran araç bilgisayarda Tablo 2 göre (Şekil 4 K) gömme işlemi başlatmak için kullanın.
   Not: Her raf 32 kaset katıştırılması için 45 dakika sürer.
8. Özel simge (Şekil 4 L) varlığı gözlemleyerek Protokolü ' nün sonu araç doğrular kadar bekleyin.
9. Çıkış raf (Şekil 4 M) kaldırın. Ana embedder kapağını kapatın.
10. (Yönlendirme ızgaralar içeren) katıştırılmış blokları rafa kaldırın. Katıştırılmış blok depolama mukavva koli içerisinde aktarın.

6. mikrometre kesit

1. Microtome soğutma plaka üzerinde açın. -8 arasında sıcaklığı ayarlamak ve -10 ° c
2. 2 L distile su içeren microtome, termostatik su banyosu üzerinde açın. Su banyosu 42-45 ° c arasında sıcaklık ayarlayın
3. Yer parafin blok soğutma plaka üzerinde gömülü. Blok soğutmak izin vermek için en az 5 dakika bekleyin.
4. Soğutma plaka bir blok alın ve microtome blok yuvasına yerleştirin.
5. 10 µm kalınlık 6 kere keserek ila 10 µm. Trim blok kesme microtome ayarlayın.
6. Microtome kalınlık ayarı 10 µm Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama için 3 µm. kesim bir 3 µm bölümüne değiştirin.
7. Küçük bir fırça 3 µm bölümle toplamak. 3 µm bölümüne su banyosunda dikkatle doku kırışıklıkları azaltmak için su yüzeyine döşeme koymak. Doku bölümü termostatik kontrollü su banyosundan bir tek cam slayt üzerinde toplamak.
   1. Gerekirse, ek bölümler kesti.
8. Cam slayt örnek kimliği yazılı olarak etiketleyin.
9. En az 10 dk. 37 ° C fırında slaytları koymak.
10. Cam slaytlar raflar hemen analizleri veya saklama kutuları içine koymak.

7. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama

1. Otomatik stainer güç düğmesine basarak geçin. Robotik kol Başlatma araç monitör yükleme çubuğu değişikliği gözlemleyerek izin.
2. Cam slayt dikey olarak 30 slaytlar ekleme stainer raf yerleştirin.
3. Raf ile uygun radyo frekansı tanımlama (RFID) plastik etiket etiket. RFID etiketleme stainer bilgisayara yüklenen doğru boyama Protokolü tanımlayan bir sistemdir.
4. Raf stainer yerleştirin. Bilgisayar otomatik olarak yüklemek ve RFID etiket tanıma göre boyama Protokolü başlatmak izin veriyor.
   Not: H & E boyama için protokol açıklanan Tablo 3.

8. immunohistokimyasal boyama

1. İmmunohistokimyasal ve Mallory yukarıda açıklanan⁷olarak boyama trichrome gerçekleştirin.

Representative Results

İçme suyundaki DSS yinelenen yönetim tarafından indüklenen deneysel kronik kolit bağırsak iltihabı yakından benzeyen insan IBD^8,9fare bir modeldir. Şekil 1 kısalma iki nokta üst üste (Şekil 1A), DSS kaynaklı inflamasyon varlığı ve pro-inflamatuar genlerin CXCL10 dahil olmak üzere kolon ifade puanı için yaygın olarak kullanılan parametre de dahil olmak üzere DSS tedavisinin etkileri açıklar , tnf ve mcp-1 (Şekil 1B). İnflamatuar hücre infiltrasyonu büyük ölçüde DSS tedavi, işe alım bağışıklık yanıtının gösteren bağırsak lamina propria içinde cytofluorimetry (Şekil 1 c) tarafından analiz gibi tarafından geliştirilmiş oldu.

Şekil 2 gösteriyor nasıl kolon dokularında kesitli ve odaklı kaset eklenmiş. Bu kasetler bir kılavuz doku ekleme dikey olarak ve uygun yönlendirmeyi ile yani izin haddelenmiş ipuçları ile, iç kısım ve duvar Lümen ile harici içerecek şekilde tasarlanmıştır (Şekil 2A, 2B, 2 C ). Kasetleri kapandıktan sonra doku yönlendirme ne geleneksel histolojik kaset (Şekil 2B) ile olur aksine ızgaralar tarafından korunur.

Doku işleme otomatik bir işlemci (Şekil 3A-3 M ve Tablo 1), gömme sırasında gerçekleştirilir müdahalede bir otomatik embedder ile (Şekil 4A-4 M ve Tablo 2). İkinci alet bir robot kasetleri toplar ve parafin doğru miktarda dağıtır. Son olarak, bir microtome kullanarak, bölümler parafin blokların kesilir. Slaytları sonra daha ayrıntılı bir çözümleme için hazırlanır.

Şekil 5 otomatik H & E (Şekil 5A-5E ve Tablo 3) boyama ana pasajlar açıklar ve nasıl slaytları H & E (Şekil 5F) boyama sonra görünür. Şekil 6 ve 7 nasıl otomatik işleme ve Gömme iletişim kurallarının uygulanması önemle fare kolon örneklerin histopatolojik analizleri kalitesini artırmak göster. Tedavi edilmemiş fareler (Şekil 6A) türetilmiş otomatik protokolleri ile hazırlanan örnekleri H & E stainings bu tedavi DSS fareler (Şekil 6B) karşılaştırıldı. Histopatolojik puanları değişik parametrelerle bağırsak mukoza inflamatuar dahil olmak üzere hücreleri infiltrasyon, epitelyal değişiklikler ve değişikliklerin açıklandığı gibi mukozal mimarisinin meydana gelen değişiklikler değerlendirerek değerlendirildi Tablo 4. Şekil 6C bir temsilcisi H & E bir kolon doku el işleme ve geleneksel kaset dahil boyama gösteriyor. Şekil 7' de, fare doku hazırlık ve otomatik aletler gerçekleştirilen katıştırma kalitesini Ayrıca IHC tarafından doğrulandı CD20 ve Mallory trichrome boyama^8,9 kolon içinde boyama tedavi edilmemiş (Şekil 7A, 7 C) ve DSS tedavi (Şekil 7B, 7 D) fareler.

Şekil 8 bu yöntemin pratik alaka açıklar. Aynı iki nokta üst üste örnekleri işleme ve el ile veya otomatik yöntemlerle gömülü. Her örnek (her iki denetim veya DSS tedavi) 2 eşit parçaya kesin ve manuel veya otomatik yöntemleri ile paralel olarak işlenir. H & E boyama sonra gerçekleştirilen ve tam bir microscopical değerlendirme hitaben bütün patolojik parametreler ile ilgili değişiklikler mukozal mimarisi, taneciklik, bağışıklık hücre sızmak, mukozal kalınlığı, salgı rarefaction normalde yapıldı. bağırsak iltihabı sırasında gözlenen, her örnek, her ikisi belgili tanımlık elle yapılan için için değerlendirildi ve otomatik Protokolü (Şekil 8A ve Tablo 4). Otomatik Protokolü örnekleriyle hazırlanması sürekli olarak yüksek oranda histolojik parametreleri elle yapılan yöntem daha değerlendirilmesi izin. Ayrıca, farklı histolojik parametreleri ayrı bir analizini gerçekleştirildi (Şekil 8B). Mimari ve bazal infiltrat değerlendirme olumlu, özellikle tedavi edilmezse farelerde, otomatik yöntemi ile numune hazırlama tarafından etkilendi.

İşleme ve şu anda insan histopatolojik analiz için kullanılan katıştırma örnek için otomatik yöntemi başarıyla fare numuneler analiz için uygulanabilir. Yüksek kaliteli örnekler mimarisi değerlendirilmesi ve fare kolon dokuların bazal bağışıklık infiltrat el ile yöntemi üzerinde üstünlük gösterir otomatik yöntemi ile oluşturulur.

Şekil 1: kronik bağırsak iltihabı değerlendirme. (A)iki nokta üstüste uzunluk ölçüm. (B) kolon ifade genlerin pro-inflamatuar (cxcl10, tnf, mcp-1) DSS tedavi (Siyah barlar, n = 12) ve tedavi edilmezse fareler (beyaz barlar, n = 6). (C) Immunophenotyping kolon lamina propria ve hücreleri DSS tedavi (kapalı sembolleri, n = 12) ve tedavi edilmezse fareler (açık sembolleri, n = 6). CD11b + Ly6G + nötrofil, CD11b + F4 / 80 + makrofajlar (sol kapı aynası), CD4 + ve CD8 + T hücreleri (doğru kapı aynası) infiltrasyon denetimlerindeki (açık sembolleri, n = 10) ve fareler DSS tedavi (kapalı sembolleri, n = 10). İstatistiksel anlamlılık Wilcoxon eşleşen çiftleri ile imzalanan rütbe t testi hesaplanır. p ≤ 0,05 ** p ≤ 0,01. SEM bildirilen değer ± demek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: numune hazırlama açıklaması. (A)bir dış kaset (beyaz) tarafından oluşan doku hazırlık ve resim odaklı kaset için aletleri gerekli ve iç kılavuzla kalıptan çekilmiş Yönlendirme ipuçları. (B, C) Fare iç ızgaralar kaset (B) önce iki nokta üst üste yerleştirilmesi ve Kılavuzlar (C) kapatılması sonra. Masası'nda B tasvir edilir (solda) odaklı kaset veya geleneksel kaset (sağda). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: otomatik işlem açıklaması. (A, B) işlemci otomatik. (C) simgesi erime sıcaklığı doğru parafin açıklayan. (D, E) Metal sepet (D) ve (E) kapatılması kasete ekleme. (F, G, H) İmbik metal sepete ekleme. (I, J, K) İşlem protokolü seçimi. Protokolü'nün (L) çalışan. İmbik sepet formunun (M) kaldırma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: otomatik katıştırma açıklama . Otomatik embedder(a)resmi. (B, C) Ekleme rafa kaset. (D, E) (D) açılış ve kapanış kapağı (E). (F) sinyal bir raf varlığı makine için. (G, H) Raf giriş konut içine ekleme. (I, J) kapağı kapanışı. Gömme Protokolü (K) başlar. (L) çıkış konut kapak açılması. Çıkış konut raf formunun (M) kaldırma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: otomatik H & E stainer açıklaması. (A)resim slayt tutucusunun. (B, C) Slayt tutucusunun içinde belgili tanımlık makine ekleme. (D) kapanış makine. Boyama Protokolü'nün (E) Başlat. (F) Exemplificative resmi bir slayttan sonra microtome kesme ve H & E boyama. Doğru kapı aynası, H & E örnek yönünü gösteren boyama. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: H & E stainings kolon örnekleri formu tedavi edilmezse ve DSS tedavi fareler. H & E tedavi edilmemiş (A) ve DSS tedavi (B) örnekleri boyama hazırlanan (işlenen, gömülü, lekeli) ile (A, B) otomatik veya el ile (C) yöntemleri. Ölçek çubuğu = 100 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7: Mallory trichrome (A, B) ve CD20 + hücreler (C, D), sızmak, IHC stainings tedavi edilmezse (A-C) ve (B, D) tedavi DSS fareler. Mallory boyama: mavi, kollajen, koyu pembe, çekirdek, koyu kırmızı, sitoplazma. Ölçek çubuğu = 100 nm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 8: el ile ve otomatik iletişim kuralları ile histopatolojik analizler arasında karşılaştırma. (A)toplam histopatolojik parametrelerinde değerlendirilebilir Kılavuzu (beyaz çubukları) veya otomatik yöntemi (mor çubuk) ile hazırlanan tüm bölümleri. (B) yüzdesi Kılavuzu (beyaz çubukları) veya tedavi edilmemiş (düz çubuk) veya DSS tedavi fareler (noktalı çubuk) otomatik yöntemi (mor çubuk) ile hazırlanan örneklerde belirtilen parametreler. İstatistiksel anlamlılık Wilcoxon eşleşen çiftleri ile imzalanan rütbe t testi hesaplanır. p < 0,05; p < 0.005. SEM bildirilen değer ± demek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Reaktif	Süresi (dk)	sıcaklık (° C)	basınç
NBF	1	RT	ortam
Etanol %95	1	RT	ortam
Etanol %95	1	RT	ortam
Etanol %95	1	RT	ortam
Mutlak etanol	1	45	ortam
Mutlak etanol	11	45	ortam
Mutlak etanol	30	RT	ortam
Ksilen	1	RT	ortam
Ksilen	1	45	ortam
Ksilen	28	45	ortam
Parafin mumu	5	65	Vakum

Tablo 1: otomatik doku işleme protokolü.

Her kaset için robot tarafından eylem perfomed

Bir kaset rafa kaldırmak

Kaset tanımlamak

Kalıp ön ısı

Üzerinde önceden ısıtılmış kalıp kaset yerleştirin

Parafin kaseti için miktarı dağıtmak

Kalıp serin

Parafin kuvvetlendirmek izin

Katılaşmış parafin blok kalıp kaldırma

Engellemek için kalite sensörler mevcut

Parafin blok çıkış kapı yerleştirin

Tablo 2: iletişim kuralı gömme otomatik.

Kategori	Ölçüt	Tanımı	Puan değeri
İnflamatuar hücre sızmak	Önem derecesi (lökosit yoğunluğu içinde sızmış lamina propria alanının hpf değerlendirilmesi)	Hiçbir sızmak	0
		En az akut (< % 10)	0,25
		Hafif kronik (% 10-25, dağınık nötrofil)	0,5
		Kronik (26-%50) orta	0,75
		İşaretli (> % 51, yoğun sızmak)	1
	Ölçüde (lökosit infiltrasyonu genişlemesi)	Mukozal	0,5
		Mukozal ve submucosal	0,75
Epitelyal değişiklikler	Hiperplazi (boyuna kriptalarının, crypt uzama görünür epitel hücre sayıları artış)	Hiçbir hiperplazi	0
		En az (< % 25)	0,25
		Hafif (26-%35)	0,5
		Orta (36-%50, mitoses crypt epitel üst üçüncü)	0,75
		İşaretli (> % 51, mitoses içinde crypt uzak epitel crypt temel üzerinden)	1
	Goblet hücre kaybı (goblet hücre sayıları temel goblet hücre sayıları crypt başına göre azalma)	Hiçbir kaybı	0
		En az (< % 25)	0,25
		Hafif (26-%35)	0,5
		Orta (36-%50)	0,75
		İşaretli (> % 51)	1
Mukozal mimarisi	Ülserasyon (epitel defekti muscolaris mucosae ulaşan)	Hiçbir ülser	0
		Ülser	0,25
	Granülasyon dokusu (bağ dokusu onarım ile yeni kılcal, hücreleri, infiltre tarafından çevrili alanlar hipertrofik)	Hiçbir granülasyon dokusu	0
		Granülasyon dokusu	0,25
	Mukozal kalınlığı ve crypt derinliği	Hiçbir kalınlaşma	0
		Kalınlaşma	0,5
	Salgı rarefaction	Yok rarefaction	0
		Rarefaction	0,5
	Displazi	Displazi	0
		Displazi	0,5
		MAX PUANI	6

Tablo 3: Protokolü boyama otomatik.

Eylem perfomed her slayt için boyayıcı tarafından	Reaktif	zaman (s)	sıcaklık (° C)
Essicate		180	60
Essicate		180	60
Deparaffinize	Ksilen	120	RT
Deparaffinize	Ksilen	120	RT
Hidrat	Etanol %96	120	RT
Hidrat	Etanol %96	120	RT
Yıkama	Distile wtaer	240	RT
Leke hematoksilen	Carazzi'nın hematoksilen	540	RT
Durulama	Musluk suyu	360	RT
Eozin leke	Eozin Y % 1 aqueos çözüm	60	RT
Durulama	Musluk suyu	120	RT
Kurutmak	Etanol %96	20	RT
Kurutmak	Etanol %96	20	RT
Kurutmak	Mutlak etanol	15	RT
Kurutmak	Mutlak etanol	15	RT
Açık	Ksilen	30	RT
Açık	Ksilen	30	RT

Tablo 4: düzeni bağırsak iltihabı değerlendirme için Puanlama.

Discussion

Histopatolojik analiz için fare doku hazırlanması sırasında farklı otomatik adımları kullanmak. Bu iletişim kuralı tekrarlanabilirlik ve böylece son histopatolojik değerlendirme genel kalitesini arttırmak tüm süreç standardizasyonu artırmak için teknik ipuçları sunmayı amaçlamaktadır. Biz otomatik aletler ve hazırlık ve rutin olarak insan örneklerin incelenmesi için patoloji çekirdek tesislerinde kullanılan dokuların katıştırma yöntemleri hayata.

Bu yöntemin potansiyel uygulanabilirliği göstermek için biz bağırsak iltihabı, DSS kaynaklı kronik kolit modeli olarak adlandırılan kronik fare deneysel ayarı seçti. Bu ayar kronik bağırsak iltihabı meydana gelen doku mimarisinin derin değişiklikler araştırmak için ayrıntılı histolojik değerlendirme gerektiren IBD hastalarda gözlenen karmaşık hastalık sahası benzer. Özet olarak, bu süreçlerin histolojik değerlendirme büyük ölçüde artan örnek hazırlama kaliteden yarar olabilir. Odaklı kaset olmadan bir lümen dokular için gerekli değildir o varlık notu için bu Protokolü (yani, dalağı, lenf bezleri, karaciğer, beyin), diğer fare doku ile tek fark uygulanır.

En önemli gözlem el ile hataları, azalma olduğunu (yani, örnek yönünü) verilen kaset Izgaralar ile kullanımı ve kaset (yaygın olarak el ile sırasında gerçekleştirilen bir adım gömmek için yeniden açılması kaldırılması iletişim kuralları), güçlü genel tekrarlanabilirlik Analizi gelişmiş. Deneyci odaklı kaset doku ekler, burada açıklanan protokol ile hazırlık, başlangıçta yalnızca örnek yönetilebilir. Bir kez kapalı, kasetleri asla, böylece doğru yönlendirmeyi bakım sağlanması ve el ile hataları^3,11azaltarak tekrar hizmete vardır. Bu iki kritik adımı standardizasyon daha sonraki analizler tüm kalitesini arttırmak ve kayıp ya da değil değerlendirilebilir örnekleri, her ikisi de ve kaset yeniden açılması veya örnek^{3 yanlış yönünü bağlı sorunlar sayısı azaldı ,11}.

Biz de çok sık deneysel bağırsak iltihabı, fare modellerinde otomatik protokolünün uygulaması tarafından hafife fibrozis (Şekil 7), gibi karmaşık bir biyolojik olay değerlendirilmesinde başarılı oldu. Protokol kurulumu sırasında biz kesinlikle biz doku değişiklikleri önlemek için 24 h'ü fark fiksasyon zamanı gibi teknik ayrıntılar standart. Böylece, sonraki immunohistokimyasal analizleri kalitesini korumak.

Otomatik yöntem ilişkilendirilmiş doku mimari, tedavi edilmemiş farelerde özellikle İLETİMLERİNİZE için bu parametrelerin değerlendirilmesi geliştirilmiş. Gerçekten de, sağlıklı bir muadili patolojik bir dokuyla doğru karşılaştırılması kritik deneysel model³son değerlendirme için önemlidir.

Doku işleme ile ilgili laboratuvarda olan otomatik işlemci çalıştırılmak üzere farklı protokolleri test ettik. Burada açıklanan protokol ses ve son derece tutarlı sonuçlar vermiştir. Biz de protokol için bir zaman uzunluğu hayata. Fare örnekleri insan küçük biopsic numuneler boyutunda karşılaştırılabilir yaşından beri bir daha kısa protokol antikorundan (Bu durumda bağırsak,) işlemek için yeterli doku. Son olarak, tüm otomatik işlemleri toplam deneysel zaman azaltılmış. Microtome kesme ve dilimleri hazırlık için işlem başlangıcından itibaren toplam zaman gerekli-5 h olduğunu hesaplanır. Aksine, operatör teknik yetenek bağlı olarak, aynı protokolleri tamamlanması el ile iki katından fazla miktarı saat, işlenmesi ve katıştırma özellikle sırasında gerektirebilir. Teknik bir sınırı otomatik işlemciler ve laboratuvarda olmak gerçekleştirilecek embedder gerektirmesidir.

Sonuç olarak, biz bu otomatik iletişim kurallarının uygulanması büyük ölçüde insan hastalıkları fare deneysel modelleri ile mücadele translasyonel araştırmacılar çalışmalarını iyileştirmek inanıyoruz.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute Ethanol anhydrous	Carlo Erba	414605	reagent
Absolute ETOH	Honeywell	02860-1L	reagent
Aluminium Potassium Sulfate	SIGMA	A6435	reagent
Aniline Blue	SIGMA	415049	reagent
carbol Fuchsin	SIGMA	C4165	reagent
CD11b (clone M1/70)	TONBO biosciences	35-0112-U100	antibody
CD20 IHC (clone SA275A11)	Biolegend	150403	antibody
CD3 (17A2)	TONBO biosciences	35-0032-U100	antibody
CD4 (GK1.5)	BD Biosciences	552051	antibody
CD45.2 (clone 104)	BioLegend	109837	antibody
CD8 (53-6.7)	BD Biosciences	553031	antibody
Citrate Buffer pH 6 10x	SIGMA	C9999	reagent
Dab	Vector Laboratories	SK-4100	reagent
DPBS 1x	Microgem	L0615-500	reagent
DSS	TdB Consultancy	DB001	reagent
EDTA	SIGMA	E9884	reagent
EnVision Flex Peroxidase-Blocking Reagent	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex Substrate	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex/HRP	DAKO		compreso in GV80011-2
EnVision Flex+ Rat Linker	DAKO		compreso in GV80011-2
Eosin	VWR	1.09844	reagent
F4/80 (clone BM8)	BioLegend	123108	antibody
Formalin	PanReac	2,529,311,215	reagent
glacial acetic acid	SIGMA	71251	reagent
Goat-anti-Rat-HRP	Agilent DAKO	P0448	antibody
Haematoxylin	DIAPATH	C0303	reagent
LEICA Rotary microtome (RM2255)	Leica	RM2255	equipment
Ly6g (clone 1A8)	BD Biosciences	551459	antibody
Mercury II Oxide	SIGMA	203793	reagent
Omnis Clearify Clearing Agent	DAKO	CACLEGAL	reagent
Omnis EnVision Flex TRS	DAKO	GV80011-2	reagent
Orange G	SIGMA	O3756	reagent
Paraffin	Sakura	7052	reagent
Peloris	LEICA		equipment
Percoll	SIGMA	P4937	reagent
RPMI 1640 without L-Glutamine	Microgem	L0501-500	reagent
STS020	Leica		equipment
Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette	SAKURA	7022	equipment
Tissue-Tek Automated paraffin embedder	Sakura		equipment
Xylene	J.T.Baker	8080.1000	reagent