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Genetics

Isoler, séquençage et l’analyse des microARN extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses humaines

Published: March 8, 2019 doi: 10.3791/58655
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1, 1,2
1The Interdisciplinary Nanoscience Centre, Aarhus University, 2Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole montre comment purifier les microARN extracellulaires de milieux de culture cellulaire pour petite construction de bibliothèque de RNA et de séquençage de la génération suivant. Différents points de contrôle de contrôle de la qualité sont décrites pour permettre aux lecteurs de comprendre à quoi vous attendre lorsque vous travaillez avec des échantillons d’entrée faibles comme exRNAs.

Abstract

Extracellulaires et circulation RNAs (exRNA) sont produites par plusieurs types de cellules du corps et existent dans nombreux fluides corporels comme la salive, plasma, sérum, lait et l’urine. Un sous-ensemble de ces ARN sont les régulateurs post-transcriptionnel – microARN (miARN). Pour délimiter les miARN produites par les types spécifiques de cellules, systèmes de culture in vitro permet de récolter et profil exRNAs dérivé d’un sous-ensemble de cellules. Les facteurs sécrétés de cellules souches mésenchymateuses sont impliqués pour soulager de nombreuses maladies et est utilisé comme système modèle in vitro ici. Cet article décrit le processus de collecte, de purification de petits ARN et de génération de la bibliothèque de séquence miARN extracellulaire. ExRNAs de milieux de culture diffèrent des ARN cellulaire étant faibles échantillons d’entrée d’ARN, qui prévoit des procédures optimisées. Ce protocole fournit un guide complet à exRNA petite séquence de milieux de culture, montrant les points de contrôle de la qualité à chaque étape au cours de la purification d’exRNA et de séquençage.

Introduction

Extracellulaire et circulant RNAs (exRNAs) sont présents dans divers liquides organiques et sont résistants vers RNases1,2. Leur abondance élevée, la stabilité et la facilité d’accessibilité sont attrayants pour l’évaluation clinique des marqueurs diagnostiques et pronostiques3. Le mode de transport pour exRNAs comprennent les vésicules extracellulaires (EVs), liaison avec les lipoprotéines (tels que les lipoprotéines de haute densité ; HDL) et des complexes ribonucléoprotéiques (comme avec des complexes Argonaute2)4.

Un sous-ensemble d’exRNAs sont les microARN (miARN), qui est de petite taille non codantes ARN d’environ 22 nt qui régulent l’expression génique post-transcriptionnel. Ex-miARN ont été impliqués dans la communication de cellule-cellule et régulation de l’homéostasie cellulaire5. Par exemple, les HDL offre ex-miR-223 aux cellules endothéliales pour réprimer la molécule d’adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1) et l’inflammation6. Fait intéressant, miR-223 voit également transportés par des vésicules extracellulaires des leucocytes pour les cellules cancéreuses du poumon, à prendre sur une plus invasive de phénotype7programmation. Ainsi, le transcriptome d’ex-miARN provenant de divers fluides corporels et milieu de culture cellulaire améliorera grandement notre compréhension de la signalisation des ex-miRNA.

Petit ARN séquençage (petits RNA seq) est un outil puissant qui permet de comprendre la transcriptomique de petits ARN. Non seulement on peut comparer différents échantillons parmi RNAs connus différentiellement exprimés, mais nouveaux petits ARN aussi peut être détecté et caractérisé. Par conséquent, c’est aussi une méthode robuste pour identifier des miARN différentiellement exprimés dans des conditions différentes. Cependant, un des obstacles de petits RNA-seq est la difficulté à produire des petites bibliothèques de seq RNA provenant des liquides de basse exRNA d’entrée comme les échantillons de liquide céphalorachidien, salive, urine, lait, sérum et milieux de culture. Le protocole de TruSeq petits ARN bibliothèque Prep de Illumina exige environ 1 µg d’ARN total de haute qualité et le protocole NEBNext petits ARN bibliothèque Prep Set de New England Biolabs 100 ng-1 µg de RNA8,9. Souvent, les ARN total de ces échantillons sont inférieures à la limite de détection pour classiques spectrophotomètres UV-visible.

Ex-miARN dérivés de fluides corporels est potentiellement bons marqueurs pronostiques et diagnostiques. Cependant, afin d’étudier les effets fonctionnels ou de déterminer l’origine des ex-miRNAs spécifiques, systèmes de cultures cellulaires sont souvent utilisés à la place. Cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été étudiés intensivement car leurs EVs ont été impliqués pour soulager de nombreuses maladies, y compris l’infarctus du myocarde, la maladie d’Alzheimer et maladie du greffon contre hôte10. Ici, nous démontrons la purification des ex-miARN de moelle osseuse MSCs (BMSC) et les étapes spécifiques utilisés pour optimiser la petite construction de bibliothèque de RNA, séquençage et analyse de données (Figure 1).

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Protocol

NOTE : Milieu de culture de cellules souches mésenchymateuses (médias MSC) est établi au préalable, comme indiqué dans la Table des matières.

1. culture cellulaire

Remarque : Les cellules souches mésenchymateuses humaines peut provenir de la moelle osseuse, tissu adipeux ou autres sources11. Alternativement, les CSM peut être achetés chez un fournisseur. Le BMSC utilisés dans le présent protocole ont été dérivées de la moelle osseuse des patients et acheté auprès d’une société.

  1. Décongelez les 1 x 106 BMSC dans une fiole de T175 contenant 20 mL de médias MSC. Incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et remplacer les médias tous les 2-3 jours jusqu'à la confluence de 80 %.
  2. Laver les cellules avec 5 mL de solution 1 PBS x et jeter le PBS.
  3. Détacher les cellules en ajoutant 5 mL de 0,05 % trypsine-EDTA et en incubant les cellules pendant 5 min à 37 ° C. Appuyez sur les côtés du ballon afin de faciliter le détachement.
  4. Ajouter 15 mL de médias MSC pour inactiver la trypsine, de détacher les cellules de la surface et la pipette de haut en bas pour obtenir des suspensions de cellules du même.
  5. Recueillir les cellules dans un tube de 50 mL et la centrifuger pendant 5 min à 300 g pour granuler les cellules.
  6. Remettre en suspension les cellules dans 1 mL de médias MSC et de compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    Remarque : La moelle osseuse humaine primaire MSCs à confluence de 80 % dans une fiole de T175 est environ 2 x 106 cellules.
  7. CSM plaque à 2 000 cellules/cm2 dans les milieux frais de MSC à 5 flacons T175. Cultiver les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2 et remplacer les médias tous les jours 2 et 3 jusqu'à obtient 5 flacons de 90 % confluentes T175 flacons.

2. EVs et biomolécules associés à RNA collection

NOTE : Media collection EV est établi au préalable (de l’aigle de la modification de Dulbecco Medium [DMEM] avec le sérum de veau fœtal [BF] 10 % et 1 % la pénicilline/streptomycine [P/S]). EV collection médias est normal MSC médias, mais préparé avec le commercial appauvris en EV SVF (Table des matières). C’est pour éviter la contamination des exRNA bovine de FBS, qui contient normalement exRNAs associé à EVs, ribonucléoprotéines et lipoprotéines. Pour préparation de bibliothèque petite ARN, exRNAs dérivés de 5 flacons confluentes de MSCs sont nécessaires pour permettre la construction de la bibliothèque.

  1. Laver les cellules 3 x avec 20 mL de PBS par T175 flacon. Ajouter 20 mL de médias collection EV par confluentes T175 flacon de MSCs et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 48 h.
  2. Recueillir les médias et centrifuger les médias pendant 10 min à 300 x g et 4 ° C.
  3. Recueillir le liquide surnageant et centrifuger les médias pendant 20 min à 2 000 x g et 4 ° C.
  4. Recueillir le liquide surnageant et centrifuger les médias pendant 30 min à 15 500 x g et 4 ° C. Puis recueillir le surnageant.
  5. Transfert des médias à tubes ultracentrifugeuse et pellet l’exRNAs pendant 90 min à 100 000 x g et 4 ° C. Un rotor à angle fixe est utilisé ici et le culot est ancré sur le côté du tube. Marquez le côté du couvercle et tracez un cercle sur le côté du tube où le culot est attendu.
  6. Retirez le surnageant, sécher l’intérieur du tube en renversant le tube sur un papier absorbant et utiliser de petits morceaux de papier absorbant pour enlever le liquide dans le tube sans toucher le fond du tube. Resuspendre le culot dans 200 μl de PBS au vortex pendant 30 s et pipetage et descendre de 20 x.
  7. Évaluer les véhicules électriques et les biomolécules à nanoparticules suivi d’analyse (NTA) (Figure 2).
    NOTE : Les véhicules électriques et les biomolécules pouvant être évaluée par nanoparticules suivi d’analyse (NTA), diffusion de la lumière dynamique (DLS) ou transmission electron microscopy (TEM)12.
  8. Stocker le SVE et biomolécules à-80 ° C jusqu'à ce que des expériences plus loin en aval.
    Remarque : Si les EVs vont être utilisées pour des études fonctionnelles, 20 % de glycérol s’ajoutent pour les protéger de se rompre. Les cellules peuvent être collectées à l’aide de procédures standards si nécessaire.

3. EVs et biomolécules associés à RNA collection de cellules différenciées

NOTE : EVs et ARN associés biomolécules peuvent également être prélevés dans les milieux de culture cellulaire tandis que les cellules subissent une différenciation. L’exemple décrit dans le protocole décrit la différenciation ostéoblastique et exRNA collection à jour 0 et 7 de la différenciation. Si aucune distinction n’est requise, puis sauter 3 Section et allez à la Section 4.

  1. Préparer les milieux de la différenciation ostéoblastique (DMEM avec 10 % BF, 1 % P/S, β-glycérophosphate de 10 mM, 10 dexaméthasone nM, 50 μM ascorbate-2-phosphate et 10 mM 1,25-vitamine-D3) frais chaque fois.
  2. Une fois que MSCs sont 80 % anastomosé, changer les médias MSC aux médias de différenciation ostéoblastique.
  3. Reconstituer les médias de différenciation ostéoblastique après 2 ou 3 jours.
  4. Jour 5 de différenciation, retirez le support et laver les cellules 3 x avec 20 mL de PBS par T175 flacon.
  5. Ajouter 20 mL de support de collection EV contenant des β-glycérophosphate de 10 mM, 10 dexaméthasone nM, ascorbate-2-phosphate de 50 μM à 10 mM 1,25-vitamine D3 par confluentes T175 flacon de MSCs. incuber les cellules à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 48 h pour s’assurer a continué différenciation tout en collectant les EVs et biomolécules.
  6. Recueillir des médias au jour 7 et continuer à isoler le SVE et biomolécules comme décrit aux points 2.2 à 2,6.
  7. Pour le contrôle de la qualité, semences cellules en 96 puits 6-puits afin d’évaluer la différenciation à l’aide d’un dosage de l’activité de la phosphatase alcaline (ALP) ou PCR quantitative (qPCR), respectivement.
    Remarque : La Figure 3 est un exemple illustrant la différenciation des cellules ostéogénique.

4. extraction de l’ARN et contrôle de la qualité

  1. Décongeler les échantillons à l’étape 2.8 sur la glace. Extraire l’ARN utilisant un kit d’isolation d’ARN (Table des matières).
  2. Éluer l’ARN de la colonne fournie dans le kit d’isolation d’ARN (Table des matières) dans 100 μl d’eau exempte de RNase.
  3. Concentrer l’ARN par précipitation à l’éthanol en ajoutant 1 μL de glycogène, 10 μL 2 M pH 5,5 d’acétate de sodium et 250 μL d’éthanol à 99 % préalablement réfrigérées dans 100 μl de l’ARN purifié.
  4. Incuber les échantillons à-20 ° C durant la nuit à précipiter l’ARN. L’ARN a granulé par centrifugation pendant 20 min à 16 000 x g et 4 ° C.
    Remarque : Le pellet est blanc en raison de la coprécipitation avec glycogène.
  5. Retirez le surnageant et laver le culot de RNA avec 1 mL d’éthanol à 75 %. Granulés de l’ARN à nouveau pendant 5 min à 16 000 x g et 4 ° C.
  6. Retirez l’éthanol et laissez le couvercle du tube RNA ouvert pendant 5-10 min à l’air sec le culot de RNA. Resuspendre le culot de RNA dans 7 μL d’eau exempte de RNase.
  7. Vérifier la qualité de RNA et de la concentration à l’aide d’une machine d’électrophorèse capillaire puce pour détecter l’ARN selon protocole du fabricant avant la construction de la bibliothèque.
    Remarque : Une distribution de taille représentative de l’ARN est illustrée Figure 4.
  8. Extraire l’ARN cellulaire à l’aide d’un kit de purification commerciale (Table des matières) si nécessaire.

5. bibliothèque construction et contrôle de la qualité

NOTE : Bibliothèques de petits ARN sont construits à l’aide de kits commerciaux (Table des matières) avec des ajustements en raison de l’ARN basse d’entrée. Construction de la bibliothèque est effectuée sur le bloc refroidi.

  1. Refroidir le bloc chauffant pour tubes PCR 0,2 mL sur la glace et distribuer 5 μL de l’ARN de l’étape 4.6 dans tubes PCR de 0,2 mL RNase-libre sur un bloc refroidi.
  2. Diluer 3' adaptateurs (01:10) dans l’eau sans RNase dans un tube PCR de 0,2 mL RNase-libre. Ajouter 0,5 μL d’adaptateur dilué et mélanger avec 5 μL d’ARN de pipetage et descendre 8 x et centrifuger brièvement pour recueillir tout le liquide au fond du tube.
  3. Incuber le mélange adaptateur ARN et 3' à 70 ° C pendant 2 min dans un thermocycleur préchauffé et puis replacez l’échantillon sur le bloc refroidi.
  4. Ajouter 1 μL de tampon de ligature, 0,5 μL d’inhibiteur de RNase et 0,5 μL de ligase d’ARN T4 (mutant de délétion) dans le mélange de l’ARN et 3' adaptateur. La composition de pipetage et descendre 8 x et centrifuger brièvement.
  5. Incuber les tubes à 28 ° C pendant 1 h dans le thermocycleur préchauffé.
  6. Ajouter 0,5 μL de solution d’arrêt dans le tube à essais avec le tube restant dans le thermocycleur, mélanger en pipettant également, haut et bas x 8 et continuer à incuber à 28 ° C pendant 15 minutes.
  7. Diluer 5' adaptateurs (01:10) dans l’eau sans RNase dans un tube PCR de 0,2 mL RNase-libre. Ajouter 0,5 μL de 5' adaptateur dans un séparé libre de RNase 0,2 mL tube PCR, chaleur l’adaptateur 5' à 70 ° C pendant 2 min dans le thermocycleur préchauffé et placez l’échantillon sur le bloc refroidi.
  8. Ajouter 0,5 μL de 10 nM ATP, 0,5 μL de ligase d’ARN T4 au tube 5' adaptateur, mélanger en pipettant également monter et descendre de 8 x et centrifuger brièvement pour collecter tous les liquides dans le fond.
    NOTE : Gardez l’adaptateur 5' sur bloc refroidi autant que possible.
  9. Ajouter 1,5 μL du mélange 5' adaptateur à l’échantillon de point 5.6 et mélanger très doucement par pipetage x 8 lentement. Incuber les échantillons à 28 ° C pendant 1 h dans le thermocycleur préchauffé.
  10. Diluer RT amorce 01:10 dans de l’eau exempte de RNase dans un tube de PCR de 0,2 mL de RNase-libre. Ajouter 0,5 μL d’apprêt de RT dilué dans l’échantillon de l’étape 5.9, mélange très délicatement en pipettant également monter et descendre de 8 x lentement et centrifuger brièvement.
  11. Incuber les échantillons à 70 ° C pendant 2 min dans le thermocycleur préchauffé et placez l’échantillon sur un bloc refroidi.
  12. Ajouter 1 μL de 5 x premier tampon strand, 0,5 μL du mélange dNTP 12,5 mM, 0,5 μL de 100 mM dithiothréitol (DTT), 0,5 μL d’inhibiteur de RNase et 0,5 μL de la transcriptase inverse. Mélanger très doucement en pipettant également monter et descendre de 8 x lentement et centrifuger brièvement.
  13. Incuber l’échantillon à 50 ° C pendant 1 h dans le thermocycleur préchauffé pour obtenir l’ADNc.
  14. Ajouter 4,25 μL d’eau ultrapure, 12,5 μL du mélange PCR, 1 μL d’apprêt index et 1 μL de l’amorce universelle dans l’ADNc. La composition de pipetage et descendre 8 x et centrifuger brièvement.
  15. Placer l’échantillon dans un thermocycleur et mis en place le cycler comme suit : 98 ° C pendant 30 s ; 15 cycles de 98 ° C pendant 10 s, 60 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 15 s ; et au bout du cycle avec 72 ° C pendant 10 min.
    Remarque : La bibliothèque de prête peut être stockée à-20 ° C pendant une semaine.
  16. Purifier la bibliothèque RNA séparant la bibliothèque sur un gel de l’ADN et en coupant le gel (gel extraction) entre 140 bp et 160 bp et la bibliothèque du gel suivant le protocole donné par le kit de construction de bibliothèque d’élution.
    Remarque : Dans cette étude, la bibliothèque de prête de l’étape 5.15 est chargée sur un gel commercial (Table des matières) et la bibliothèque entre 140 bp et 160 bp est purifié dehors par un fractionnateur automatisé de taille sur les ADN (Table des matières) conformément à la protocole du fabricant.
  17. Se concentrer et se laver de la bibliothèque de l’étape 5.16 à l’aide d’un kit de purification PCR basée sur les colonnes (Table des matières) et éluer la bibliothèque dans l’eau sans RNase 10 μL enfin.
  18. Charge 1 μL de la bibliothèque purifiée sur une puce à ADN (Table des matières) pour vérifier la taille de la bibliothèque de base du protocole par le fabricant.
  19. Diluer 1 μL de la bibliothèque purifiée (1 : 1000) du pH 8.0 de 10 mM Tris-HCl à 0,05 %, polysorbate 20 et quantifier la bibliothèque de qPCR en utilisant un kit de quantification de la bibliothèque commerciale pour quantifier la concentration de bibliothèque en utilisant les normes de l’ADN dans le kit.
  20. Quantités égales de piscine des bibliothèques selon les exigences de la machine de séquençage et de la séquence sur un système de séquençage haut-débit.
    Remarque : La construction de la bibliothèque d’ARN cellulaire peut être faite en utilisant les mêmes kits en suivant un protocole standard des kits.

6. bioinformatique pipeline

Remarque : Il s’agit d’un pipeline interne et les programmes utilisés ici sont répertoriés dans le Table des matières.

  1. Tailler loin lectures de faible qualité et retirer les lectures brutes de séquences d’adaptateur.
  2. Mapper les lectures propres à différents types d’ARN.
    1. Annoter les Arnt en autorisant deux décalages parce que les séquences fortement modifiées de tRNA causent misincorporation base fréquente par la transcriptase inverse.
    2. Annoter des miARN par cartographie de miARN humaine de miRBase v21 permettant à zéro non-correspondances. Puisque miARN est soumis A et U nontemplated 3' fin ajouts, séquences qui ne sont pas mappent sont garnis de jusqu'à trois A ou T ent après quoi lectures sont mappés aux miARN humaine et autres miARN de miRBase v21 permettant à zéro décalages de 3'.
    3. Annoter à l’autre les petits ARN (snRNA, Arnpno, piRNA et Y RNAs) en permettant une incompatibilité.
    4. Mapper les lectures restantes non mappés à long RNA datasets (ARNr, autre ARN de Rfam et ARNm) afin d’évaluer la dégradation.
    5. Annoter les séquences au génome humain.
    6. Annoter les séquences de génomes bactériens.
    7. Normaliser les miRNA expression à l’aide de la formule suivante : miRNA compte / total chiffres de tous les miARN mappé) x 106.

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Representative Results

La méthode décrite dans le présent protocole est optimisée afin de recueillir des exRNA de culture MSC pour l’ordonnancement de la génération suivante. L’économie générale du flux de travail est à la Figure 1 sur la gauche et les points de contrôle de la qualité respective sont sur la droite.

La morphologie des cellules sur le jour du prélèvement pour indifférencié (Figure 3 a) et différenciées (Figure 3 b) cellules apparaissent. En outre, représentant les niveaux normalisées d’activité ALP de cellules induites pendant 7 jours sont également indiqués (Figure 3). Ici, l’activité ALP est environ 2,5 fois celle des cellules non induits.

Trois flacons de T175 de MSCs confluentes donnent 2-5 x 1010 particules/mL (Figure 2). Taille moyenne des particules est environ 160-165 nm alors que la plupart des particules sont de 130-140 nm. Il y avait quelques petits pics entre 200 et 500 nm, ce qui indiquerait des grands complexes ou grands agrégats.

Étant donné que les RNA peut se dégrader rapidement, se conformer strictement aux conditions d’extraction de l’ARN selon le kit ou le protocole utilisé. Exempte de RNase conditions d’utilisation, en particulier eau exempte de RNase pour remettre en suspension l’ARN et de garder les RNA sur glace lorsque cela est possible. Après extraction, l’ARN peut être quantifiée à l’aide d’une machine d’électrophorèse capillaire puce. Représentant électrophérogrammes de l’ARN après cours d’analyse sont indiquées à la Figure 4. L’électrophorèse d’exRNAs comprend une large gamme de RNAs (Figure 4 a). En revanche, l’ARN cellulaire a des pics très distincts à autour de 70-120, 1800 et 3800 nt, qui correspondent aux tRNA/5 s rRNA / 5,8 s ARNr 18 s et ARNr 28 s, respectivement (Figure 4 b). Le nombre d’intégrité RNA (RIN) représente la qualité de l’ARN. Un bon RIN d’ARN cellulaire est > 8 (n’indiquant presque aucune dégradation de l’ARN). L’algorithme sur laquelle repose le RIN est le rapport entre 28 s et 18 s. Cela signifie que RIN n’est pas un bon indicateur de qualité de RNA d’exRNAs car rRNA pleine longueur n’est habituellement pas détectables dans exRNAs.

Après extraction de l’ARN, les bibliothèques de miARN ont été construits et les banques d’ADNc ont été séparés par électrophorèse sur gel. L’ADNc ligaturé à l’adaptateur de la miARN se situe habituellement entre 140 et 160 nt. Ensuite, la qualité de la bibliothèque a été visualisée sur une machine de puce l’électrophorèse capillaire (Figure 5). Figure 5 a et 5 b Figure sont les bibliothèques de l’ARN cellulaire au jour 0 et 7 jour, respectivement. Figure 5 et Figure 5 sont respectivement les bibliothèques exRNA au jour 0 et 7 jours. Les quatre échantillons avaient des pics à environ 140 nt, qui indiquent la construction de bibliothèque de miRNA réussie. Le montant de l’ADNc dans les bibliothèques a été quantifié par qPCR en utilisant un kit de quantification de bibliothèque. Le cycle de la quantification (Cq) des normes a été tracé sur le journal de la concentration afin d’obtenir une courbe standard (Figure 6). L’équation de la courbe standard est ensuite utilisée pour calculer la concentration des bibliothèques (tableau 1). Dans notre échantillon, la concentration des bibliothèques d’exRNAs était de 5 à 8 nM, qui était significativement plus faible que les librairies de l’ARN cellulaire (8-30 nM). Les bibliothèques ont été ensuite mis en commun avec la quantité égale et envoyés pour le séquençage.

Après que les bibliothèques ont été séquencés, les lectures de faible qualité ont été taillés de loin avec FASTX-boîte à outils et la qualité qui en résulte de l’exRNAs de la bibliothèque a été élevé et comparable à celui des bibliothèques des cellules (Figure 7 aB). La longueur de la séquence des bibliothèques de cellules avait un seul pic à environ 22 nt (Figure 7), qui est en corrélation avec les miARN. En revanche, les bibliothèques d’exRNAs sont plus hétérogènes et contiennent 3 pics majeurs : 22 nt, 30 nt et 33 nt (Figure 7). Comme leurs homologues cellulaires, le pic à 22 nt est le miARN. Approfondi a révélé que pics à nt 30 et 33 sont des moitiés/fragments d’ARNt ou piRNAs. Les annotations des mappé lectures ont été ensuite tracées. Plupart des lectures (65,1 %) de l’ARN cellulaire mappée aux humains miARN et chacun des autres petits RNAs représentés une petite portion de la mappé se lit comme suit (Figure 8 a). Par contraste, seulement 8 % des exRNAs mappées aux humains miARN (Figure 8 b). Le plus abondant petit ARN à laquelle mappé les lectures étaient Arnt. La plupart des lectures ont été « inégalées lectures » (43 %). De plus examen les lectures inégalée d’exRNAs et bases de données mondiales conduit à la conclusion surprenante que la plupart d'entre eux correspondre à des séquences bactériennes (74 % et 85 % pour exRNA D0 et D7, respectivement ; Le tableau 2). En revanche, seulement 0,9 % de l’ARN cellulaire était inégalée et de ceux, seulement 10 % associé aux bactéries. Une comparaison avec le génome bovin a montré moins de 1 % correspondent à ce qui semble indiquer que BF n’était pas une source de contamination (tableau 2). Par conséquent, exRNAs présentent un profil atypique par rapport à l’ARN cellulaire normale.

Figure 1
Figure 1 : flux de travail de séquençage de l’exRNA et l’analyse. L’ensemble du workflow est représenté sur la gauche dans les cases grises et contrôle de la qualité associée à chaque étape est dans les zones rouges sur la droite. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : répartition des particules sécrétées par les cellules au jour 0 et 7 de la différenciation de la taille. Résultats représentant NTA de particules provenant de 3 flacons de x T175 à (A) 0 et (B) jour 7 de différenciation. Les tailles respectives de moyenne et de la mode ainsi que la concentration des particules est compilée sous les graphiques. SD : écart-type. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : cellules de morphologie et la différenciation ostéogénique ayant précédé le prélèvement de RNA extracellulaire. (A) micrographie d’indifférenciées BMSC cultivés avec les médias de la collection sur le jour du prélèvement. (B) micrographie de BMSC différenciés pour 7 jours avec les médias de la collection sur le jour du prélèvement. Barreaux de l’échelle = 100 µm. (C) activités ALP des cellules ont été normalisées à leur viabilité cellulaire respectifs. Des valeurs sont celle de trois expériences indépendantes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : électrophorégramme représentant d’intégrité RNA après extraction de l’ARN. Analyses de RNA d’ARN extracellulaire (A) et (B) l’ARN cellulaire. L’axe des x sont la longueur de l’ARN (nt) et l’axe des ordonnées sont la fluorescence. Le premier pic est l’échelle à 25 nt. Ribosomal RNA sont affichés sous forme de 18 ans (1 800 nt) et 28 (3 800 nt). Numéro de l’intégrité de RNA (RIN) est un indicateur de qualité de RNA basée sur l’intégrité de l’ARN ribosomique 18 s et 28. Des nombres plus élevés de RIN égal de meilleure qualité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : électrophorégramme représentant des bibliothèques après la construction de la bibliothèque de cDNA. Analyse de l’ADN des bibliothèques de (A) les cellules au jour 0, (B) au jour 7, RNA extracellulaire (C) du jour 0 et (D) extracellulaire ARN du jour 7. Les numéros verts et violets sont les échelles à 35 nt et 10 380 nt, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : ADNc de quantification de la bibliothèque et calcul. Les bibliothèques ont été dilués entre 500 - 1 000 fois pour ceux d’exRNA et entre 1 000 et 4 000 fois pour l’ARN cellulaire. Les bibliothèques ont été exécutés aux côtés des normes de kit de quantification de la bibliothèque. Les valeurs moyennes de Cq des normes ADN ont comploté contre la concentration de10 log (MP) pour générer la courbe d’étalonnage, une équation de la courbe d’étalonnage et une valeur de2 R. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : scores de qualité et de la distribution de longueur des séquences de. Lit de mauvaise qualité et séquences adaptateur étaient garnis de FASTX-boîte à outils pour les cellules (A) et (B) exRNAs. La distribution de longueur des propre lit pour cellules (C) et (D) exRNAs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Annotation de petits ARN après séquençage. Les annotations représentent des pourcentages de lectures propres cellules (A) et (B) exRNAs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Échantillon Facteur de dilution Valeur de CQ log(PM) Concentration (pM) Moyenne de concentration (pM) Moyenne de concentration * (452/143) Multiplier par le facteur de dilution (pM)
BMSC D0 exRNA 500 7,72 0,702 5.036 5.276 16.678 8338.993
BMSC D0 exRNA 500 7.57 0,754 5.677
BMSC D0 exRNA 500 7.7 0,709 5.117
BMSC D0 exRNA 1000 8.64 0,383 2.416 2.365 7,477 7476.846
BMSC D0 exRNA 1000 8.68 0.369 2.340
BMSC D0 exRNA 1000 8.68 0.369 2.340
ExRNA BMSC D7 500 8.52 0,425 2.659 3.221 10.182 5090.913
ExRNA BMSC D7 500 8,42 0,459 2.880
ExRNA BMSC D7 500 7.97 0,615 4.125
ExRNA BMSC D7 1000 8.87 0,303 2.011 1.933 6.110 6110.391
ExRNA BMSC D7 1000 8,92 0,286 1.932
ExRNA BMSC D7 1000 8.97 0,269 1.857
Cellule BMSC D0 1000 6,86 1.000 10,005 9.810 31.007 31006.974
Cellule BMSC D0 1000 6.91 0.983 9.614
Cellule BMSC D0 4000 8.68 0.369 2.340 2,398 7,581 30322.041
Cellule BMSC D0 4000 8.59 0,400 2,514
Cellule BMSC D0 4000 8.68 0.369 2.340
Cellule BMSC D7 1000 8.44 0.452 2.834 2.880 9.104 9104.439
Cellule BMSC D7 1000 8.43 0,456 2,857
Cellule BMSC D7 1000 8.39 0,470 2.950
Cellule BMSC D7 4000 10.36 -0.213 0.612 0,702 2.218 8872.689
Cellule BMSC D7 4000 10.27 -0.182 0,658
Cellule BMSC D7 4000 9.97 -0.078 0,836
Calculs :
log(PM) =-0.3467 x (valeur de l’échantillon Cq) + 3.3786 ; utiliser la courbe d’étalonnage et de la formule
concentration (pM) = 10^log(pM)
Calcul de l’ajustement de taille = taille de l’ADN standard (452 bp) divisé par la longueur moyenne de fragment (143 bp)

Tableau 1 : miRNA quantification de bibliothèque.

Échantillon : # lit sans mappage humaine # lit le mappage aux bactéries % de bactéries lectures # lit le mappage à vache % de bovins lectures
BMSC D0 cellulaire 131007 9858 8 % 99 0,08 %
Cellule D7 BMSC 169730 7935 5 % 188 0,11 %
BMSC D0 exRNA 6122833 4551477 74 % 891 0,01 %
ExRNA BMSC D7 7046691 5970086 85 % 771 0,01 %

Tableau 2 : Pourcentage d’inégalée lit cette carte aux bactéries et aux lectures bovines.

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Discussion

Nous décrivons ici un protocole pour l’ordonnancement de production prochaine d’exRNAs qui permet des analyses des échantillons d’entrée faibles expression différentielle. Il est important de respecter un protocole spécifique pour l’isolement EV et exRNA parce que même de petites modifications (l’étape de l’ultracentrifugation ou un changement de type de rotor) peuvent influencer le transcriptome et miRNA niveaux13,14. Ainsi, quelle que soit la façon dont l’exRNA est isolé, il est important d’appliquer la même procédure expérimentale et bioinformatiques pour tous les échantillons à une expérience de pouvoir comparer les résultats.

Intégrité de RNA est généralement évaluée sur le bioanalyzer. Toutefois, puisque les exRNAs sont dépourvues de pleine longueur ARNr, leur valeur RIN est très faible, mais cela ne reflète pas nécessairement les échantillons de faible qualité RNA. En outre, la concentration d’ARN de l’exRNAs varie beaucoup et est souvent inexacte. Par conséquent, au lieu d’évaluer la qualité de RNA et quantification de l’ARN sur le bioanalyzer, utiliser le même volume de médias chaque fois pour un traitement ultérieur. En outre, remettre en suspension l’ARN extrait dans le même volume de tampon de resuspension et utiliser le même volume pour la construction de la bibliothèque.

Petite construction de bibliothèque de RNA a été optimisée en réduisant la quantité d’adaptateurs à un dixième du protocole standard et à l’aide de la moitié des autres réactifs. Réduisant les adaptateurs empêche non seulement les dimères d’adaptateur, il empêche aussi intramoléculaire RNA circularization15. La réduction des réactifs est optimisée pour les Illumina TruSeq petits ARN échantillon Kit de préparation. Autres kits doivent être utilisés, il est recommandé de baisser aussi adaptateur et réactifs en conséquence, à moins que le kit spécifie qu’elle est adaptée aux faibles échantillons d’entrée. Enfin, le cycle PCR pour la construction de la bibliothèque est passé de 12 à 15 cycles dans le présent protocole pour tenir compte de la faible concentration d’exRNAs. Nous avons trouvé ceci pour être l’ajustement optimal sans voir amplification biais15.

Diverses mesures de contrôle de la qualité peuvent être évaluées, y compris les scores de qualité de base et lisez le profil de longueur. Lorsque vous effectuez des analyses bioinformatiques, la qualité de base du se lit dans les ARN cellulaires et les exRNAs étaient semblables ; Toutefois, la distribution de la longueur et l’origine annotée des séquences étaient complètement différentes. La plupart des lectures de l’ARN cellulaire mappés à des miARN humaines, cependant, une grande partie de l’exRNA dispose étaient lectures inégalées. Après inspection, les lectures inégalées s’avéra bactérienne lit (tableau 2). C’était surprenant, car les antibiotiques ont été utilisés couramment dans notre culture. Notre résultat s’aligne bien avec d’autres rapports démontrant aussi grande proportion des lectures inégalées lors de séquençage de culture de cellules dérivées exRNA16. Une des raisons pour ces contaminants est que les bactéries se chevauchent en taille avec des complexes extracellulaires ou EVs et par conséquent co purifient au cours de l’ultracentrifugation étape17. Publications antérieures ont identifié une contamination généralisée de certaines bactéries dans les milieux de culture qui ne soit pas détectée sous cellules normales labo procédures18. A ce jour, ce problème a été largement ignoré, mais devrait être pris en compte lors de la purification et l’analyse exRNAs.

Ce protocole décrit en détail un guide complet pour la récolte exRNAs de milieux de culture, d’optimiser la préparation de bibliothèque petite ARN et de traitement des données brutes de bibliothèque. Ce protocole particulier met en évidence les différents points de contrôle de contrôle de la qualité tout au long du processus afin de démontrer comment faible échantillons d’entrée (comme exRNAs) peuvent s’écarter de préparations normales afin que d’autres personnes travaillant avec des échantillons d’entrée faibles peuvent savoir ce qu’il faut s’attendre.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants à M. Claus Bus et Mme Rita Rosendahl à iNANO pour leur assistance technique. Merci à Dr Daniel Otzen pour permettre à notre usage fréquent de son ultracentrifugeuse. Cette étude a été financée par le fonds d’Innovation danois (projet MUSTER).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells ATCC PCS-500-012 Cells used in this protocol was bought from ATCC
MSCGM BulletKit Lonza PT-3001 Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media)
Exosome-depleted FBS Gibco A2720801
ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS
Trypsin-EDTA Gibco 25200056
T175 Flask Sarstedt 833,912
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphate Buffered Saline Sigma 806552
Ultracentrifuge Beckman Coulter
Polycarbonate Bottle with Cap Assembly Beckman Coulter 355618
Beckman Coulter Type 60 Ti Rotor used here
NucleoCounter Chemometec NC-3000 Cell Counter
β-glycerophosphate Calbiochem 35675 Components of the osteogenic differentiation media
Dexamethasone Sigma D4902-25MG Components of the osteogenic differentiation media
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt Sigma 49752-10G Components of the osteogenic differentiation media
1α,25-Dihydroxyvitamin D3 Sigma D1530-1MG Components of the osteogenic differentiation media
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 miRNA and total RNA purification kit for step 4.8
Agilent RNA 6000 Pico Kit Agilent Technologies 5067-1514 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies G2939BA Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
Agilent High Sensitivity DNA Kit Agilent Technologies 5067-4626 Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis
KAPA Library Quantification Kits Roche KK4824 Library quantification kit used here
TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) Illumina RS-200-0012 Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5
Pippin Prep Sage Science Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too
MinElute PCR Purification Kit Qiagen 28004 PCR purification in step 5.17
FASTX_Toolkit Cold Spring Harbor Lab Trimming low-quality reads in step 6
cutadapt Adaptor removal in step 6
Bowtie Mapping of clean reads in step 6
Samtools To make the expression profile in step 6
Bedtools To make the expression profile in step 6

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References

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  3. Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
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  5. Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
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  9. NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
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Les cellules souches mésenchymateuses génétique numéro 145 RNAs extracellulaires exosomes vésicules extracellulaires ribonucleproteins microARN petit RNAs séquençage de prochaine génération petite construction de bibliothèque de RNA
Isoler, séquençage et l’analyse des microARN extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses humaines
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Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. … More

Yan, Y., Chang, C. C., Venø, M. T., Mothershead, C. R., Su, J., Kjems, J. Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e58655, doi:10.3791/58655 (2019).

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