Summary
Este protocolo muestra cómo purificar microRNAs extracelulares de medios de cultivo celular para la construcción de biblioteca de RNA pequeño y secuencia de la generación siguiente. Varios puestos de control de calidad se describen para permitir a los lectores a entender qué esperar cuando trabajan con baja entradas muestras como exRNAs.
Abstract
Extracelulares y circulación RNAs (exRNA) son producidos por muchos tipos de células del cuerpo y existen en numerosos fluidos corporales como saliva, plasma, suero, leche y orina. Un subconjunto de estos RNAs son los reguladores postranscripcional, microRNAs (miRNAs). Para delinear los miRNAs producido por tipos celulares específicos, sistemas de cultivo in vitro se pueden utilizar para cosechar y perfil exRNAs deriva de un subconjunto de las células. Los factores secretados de las células madre mesenquimales están implicados en el alivio de numerosas enfermedades y se utiliza como sistema de modelo in vitro. Este documento describe el proceso de recogida, purificación de ARN pequeño y generación de biblioteca a secuencia extracelular miRNAs. ExRNAs de medios de cultivo difieren de ARN celular por ser muestras entradas baja de RNA, que exige procedimientos optimizados. Este protocolo proporciona a una guía completa secuencia de pequeños exRNA de medios de cultivo, mostrando los puntos de control de control de calidad en cada paso durante la secuencia y la purificación de exRNA.
Introduction
Extracelular y circulación RNAs (exRNAs) están presentes en varios fluidos corporales y son resistentes a RNasas1,2. Su alta abundancia, estabilidad y facilidad de accesibilidad son atractivos para la evaluación clínica como marcadores diagnósticos y pronósticos3. El modo de transporte para exRNAs incluyen vesículas extracelulares (EVs), asociación con lipoproteínas (como lipoproteína de alta densidad; HDL) y los complejos de ribonucleoproteína (como con complejos Argonaute2)4.
Un subconjunto de exRNAs son microRNAs (miRNAs), que son pequeños no-codificación RNAs de unos 22 nt que regulan la expresión del gen postranscripcional. Ex-miRNAs se han implicado en la comunicación célula-célula y regulación de la homeostasis de la célula5. Por ejemplo, HDL ofrece ex-miR-223 a las células endoteliales para reprimir la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) y de la inflamación6. Curiosamente, miR-223 se ve transportado por vesículas extracelulares de los leucocitos a las células cancerosas de pulmón, programación para tomar a un fenotipo más invasiva de7. Así, el transcriptoma de ex-miRNAs de diversos fluidos corporales y el medio de cultivo celular mejorará grandemente nuestra comprensión de la ex-miRNA señalización.
ARN pequeño de secuencia (seq pequeñas de RNA) es una poderosa herramienta que puede utilizarse para comprender la transcriptómica de RNAs pequeño. No pueden comparar diferentes muestras entre RNAs conocidos diferencialmente expresados sólo novela small RNAs también pueden ser detectados y caracterizados. En consecuencia, es también un método robusto para identificar diferencialmente expresado miRNAs bajo diferentes condiciones. Sin embargo, uno de los obstáculos de pequeño RNA seq es la dificultad en la generación de pequeñas bibliotecas de seq de RNA de bajo exRNA entrada fluidos como líquido cefalorraquídeo, saliva, orina, leche, suero y medios de cultivo. El protocolo de TruSeq pequeños ARN biblioteca Prep de Illumina requiere aproximadamente 1 μg de ARN total de alta calidad y el protocolo de NEBNext ARN pequeño biblioteca Prep Set de New England Biolabs requiere 100 ng-1 μg de RNA8,9. A menudo, ARN total de las muestras están por debajo de límite de detección por espectrofotometría UV-vis convencional.
Ex-miRNAs derivados líquidos corporales son potencialmente buenos marcadores pronósticos y diagnósticos. Sin embargo, con el fin de estudiar los efectos funcionales o para determinar el origen de ex-miRNAs específicos, sistemas de cultivo de células se utilizan en su lugar. Las células madre mesenquimales (MSCs) han sido estudiadas extensivamente porque sus EVs se han implicado en el alivio de muchas enfermedades incluyendo el infarto del miocardio, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad injerto contra huésped10. Aquí, demostramos la purificación de ex-miRNAs de MSCs de médula ósea (BMSCs) y los pasos específicos que se utilizan para optimizar la construcción de biblioteca de pequeños RNA, secuenciación y análisis de datos (figura 1).
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Protocol
Nota: Medio de cultivo de células madre mesenquimales (medios de comunicación MSC) se preparó de antemano como se indica en la Tabla de materiales.
1. cultivo celular
Nota: Las células madre mesenquimales humanas puede obtenerse de la médula ósea, tejido adiposo u otras fuentes11. Por otra parte, hMSCs puede comprarse a través de un proveedor. BMSCs utilizados en este protocolo se deriva de la médula ósea de los pacientes y compró a una empresa.
- Descongelación de 1 x 106 BMSCs en un frasco de T175 que contenga 20 mL de medio de MSC. Incubar las células a 37 ° C con 5% CO2 y reemplazar los medios de comunicación cada 2-3 días hasta el 80% de confluencia.
- Lavar las células con 5 mL de 1 x PBS y descartar el PBS.
- Separar las células añadiendo 5 mL de 0.05% tripsina-EDTA y la incubación de las células por 5 min a 37 ° C. Golpee los lados del frasco para facilitar la separación.
- Añadir 15 mL de medios de comunicación MSC para inactivar la tripsina, separar las células de la superficie y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para obtener suspensiones de la célula.
- Recoger las células en un tubo de 50 mL y desactivación por 5 min a 300 x g para que sedimenten las células.
- Resuspender las células en 1 mL de medios de comunicación MSC y contar las células usando un hemocitómetro.
Nota: Primaria médula ósea humana MSCs en confluencia del 80% en un matraz T175 es alrededor de 2 x 106 células. - Placa hMSCs en 2.000 células/cm2 en medios frescos de MSC en 5 frascos T175. Crecen las células a 37 ° C con 5% CO2 y reemplazar los medios de comunicación cada 2-3 días hasta que se obtienen 5 frascos de 90% confluente T175 frascos.
2. ve y biomoléculas asociadas a RNA colección
Nota: Los medios de Colección EV se prepararon de antemano (medio modificado Eagle de Dulbecco [DMEM] con 10% suero bovino fetal [SBF] y 1% de penicilina/estreptomicina [P+S]). Medios de Colección EV es normal media MSC, pero preparan con FBS comerciales EV-agotado (Tabla de materiales). Esto es para evitar la contaminación de la exRNA bovina de FBS, que normalmente contiene exRNAs asociados con EVs, ribonucleoproteínas y lipoproteínas. Para la preparación de biblioteca pequeña de RNA exRNAs derivados de 5 frascos confluentes de MSCs necesarias para activar la construcción de biblioteca.
- Lavar las células 3 x 20 ml de PBS por T175 frasco. Añadir 20 mL de medio de Colección EV cada frasco de T175 confluente de MSCs e incubar a 37 ° C con 5% CO2 durante 48 h.
- Recoger los medios de comunicación y centrifugue los medios de comunicación por 10 min a 300 x g a 4 ° C.
- Recoger el sobrenadante y centrifugue los medios de comunicación por 20 min a 2.000 x g a 4 ° C.
- Recoger el sobrenadante y centrifugue los medios de comunicación por 30 min a 15.500 x g a 4 ° C. Luego recoger el sobrenadante.
- Transferencia de los medios de comunicación a los tubos de la ultracentrífuga y pelotilla exRNAs min 90 a 100.000 x g a 4 ° C. Aquí se utiliza un rotor de ángulo fijo y la pelotilla es anclada al lado del tubo. Marcar el lado de la tapa y dibujar un círculo en el lado del tubo donde se espera la pelotilla.
- Eliminar el sobrenadante, seque el interior del tubo por inversión del tubo sobre un papel absorbente y utilizar pequeños trozos de papel absorbente para eliminar el líquido dentro del tubo sin tocar el fondo del tubo. Resuspender el pellet en 200 μL de PBS con un vórtex durante 30 s y pipeteo arriba y abajo de 20 x.
- Evaluar los EVs y biomoléculas con nanopartículas seguimiento análisis (NTA) (figura 2).
Nota: El EVs y biomoléculas pueden ser evaluadas con nanopartículas de seguimiento análisis (NTA), dispersión ligera dinámica (DLS) o microscopía de electrones (TEM) de transmisión12. - Almacenar los EVs y biomoléculas a-80 ° C hasta experimentos adicionales aguas abajo.
Nota: Si ve va a utilizarse para estudios funcionales, glicerol 20% debe añadirse para protegerlos de ruptura. Las células se pueden recoger usando procedimientos estándar si es necesario.
3. ve y colección de biomoléculas asociadas a RNA de las células diferenciadas
Nota: EVs y ARN asociaron biomoléculas también se pueden recoger de los medios de cultivo celular mientras que las células sufren diferenciación. El ejemplo descrito en el protocolo describe la diferenciación osteoblástica y exRNA recogida en el día 0 y 7 de la diferenciación. Si no hay diferenciación es necesaria, luego saltar la sección 3 y vaya a la sección 4.
- Preparar medios de diferenciación osteoblástica (DMEM con 10% FBS, 1% P/S, 10 mM β-glicerofosfato, dexametasona nM 10, ascorbato-2-fosfato de 50 μM y 10 mM 1.25-vitamina-D3) fresco cada vez.
- Una vez que las MSCs son 80% confluente, cambiar los medios de comunicación MSC a los medios de diferenciación osteoblástica.
- Reponer los medios de diferenciación osteoblástica después de 2-3 días.
- El día 5 de diferenciación, eliminar los medios de comunicación y lavar las células 3 x 20 ml de PBS por T175 frasco.
- Añadir 20 mL de EV Colección medios de comunicación que contiene β-glicerofosfato de 10 mM, 10 nM dexametasona, ascorbato-2-fosfato de 50 μM y 10 mM 1.25-vitamina-D3 por confluente T175 frasco de MSCs. Incubar las células a 37 ° C con 5% CO2 durante 48 h para asegurar la continuación diferenciación al mismo tiempo recoger los EVs y biomoléculas.
- Recoger los medios de comunicación el día 7 y proceder a aislar los EVs y biomoléculas como se describe en los pasos 2.2-2.6.
- Para control de calidad, siembra células de 96-pozos o 6 pozos para evaluar la diferenciación mediante un ensayo de actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) o con reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), respectivamente.
Nota: La figura 3 es un ejemplo que muestra Diferenciación osteogénica de las células.
4. RNA extracción y control de calidad
- Descongelar las muestras del paso 2.8 en hielo. Extracto de RNA usando un kit de aislamiento de RNA (Tabla de materiales).
- Eluir el RNA de la columna que se proporciona en el kit de aislamiento de RNA (Tabla de materiales) en 100 μL de agua libre de ARNasa.
- Concentran el ARN a través de la precipitación del etanol mediante la adición de 1 μL de glucógeno, 10 μL de acetato de sodio 5.5 de pH de 2 M y 250 μL de etanol al 99% previamente enfriada en 100 μL de ARN purificado.
- Incubar las muestras a-20 ° C durante la noche para precipitar el ARN. El ARN de pellets por centrifugación durante 20 min a 16.000 x g a 4 ° C.
Nota: La pastilla es blanca debido a la coprecipitación con glucógeno. - Quite el sobrenadante y lavar el pellet de RNA con 1 mL de etanol al 75%. Pelotilla del RNA nuevamente por 5 min a 16.000 x g a 4 ° C.
- Eliminar el etanol y dejar la tapa del tubo del RNA abierta durante 5-10 min al aire seco el pellet de RNA. Resuspender el precipitado de RNA en 7 μL de agua libre de ARNasa.
- Compruebe la calidad del RNA y la concentración usando una máquina basada en el chip de la electroforesis capilar para detectar el RNA según protocolo del fabricante antes de la construcción de la biblioteca.
Nota: Una distribución de tamaño representativo del ARN se muestra en la figura 4. - Extraer ARN celular usando un kit de purificación comerciales (Tabla de materiales) si es necesario.
5. Biblioteca construcción y control de calidad
Nota: Bibliotecas de ARN pequeño se construyen utilizando kits comerciales (Tabla de materiales) con ajustes debido al RNA bajo de entrada. Construcción de la biblioteca se realiza en el bloque frío.
- Enfriar el bloque de calentamiento para tubos PCR de 0,2 mL en hielo y pipeta de 5 μL del ARN desde el paso 4.6 en tubos PCR de 0,2 mL libre de ARNasas en un bloque frío.
- Diluir 3' adaptadores (1:10) en agua libre de ARNasa en un tubo PCR de 0,2 mL libre de Rnasa. Añadir 0,5 μL de adaptador diluido y mezclar con 5 μL de RNA mediante pipeteo arriba y abajo de 8 x y centrifugar brevemente para recoger todo el líquido en la parte inferior del tubo.
- Incubar la mezcla adaptador ARN y 3' a 70 ° C por 2 min en un termociclador precalentado y luego coloque la muestra en el bloque frío.
- Añadir 1 μL de tampón de ligadura, 0.5 μL de inhibidor de la Rnasa y 0,5 μL de ligasa de T4 RNA (mutante de eliminación) en la mezcla de ARN y 3' adaptador. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo de 8 x y centrifugar brevemente.
- Incubar el tubo a 28 ° C por 1 h en el termociclador precalentado.
- Añadir 0,5 μL de la solución en el tubo de muestra con el tubo en el termociclador, mezclar mediante pipeteo arriba y abajo de 8 x y continuar a incubar a 28 ° C durante 15 minutos.
- Diluir 5' adaptadores (1:10) en agua libre de ARNasa en un tubo PCR de 0,2 mL libre de Rnasa. Añada 0,5 μL de adaptador de 5' a independiente libre de Rnasa 0,2 mL PCR tubo, calor el adaptador de 5' a 70 ° C por 2 min en el termociclador precalentado y luego coloque la muestra en el bloque frío.
- Agregar 0,5 μL de 10 nM ATP, 0.5 μL de ligasa de T4 RNA al tubo adaptador 5', mezclar mediante pipeteo arriba y abajo de 8 x y centrifugar brevemente para recoger los líquidos en la parte inferior.
Nota: Mantenga el adaptador de 5' en bloque enfriado tanto como sea posible. - Añadir 1,5 μL de la mezcla de adaptador de 5' a la muestra del paso 5.6 y mezclar muy suavemente por pipeteo 8 x lentamente. Incubar la muestra a 28 ° C por 1 h en el termociclador precalentado.
- Diluir RT cartilla 1:10 en agua libre de ARNasa en un tubo PCR de 0.2 mL libre de Rnasa. Añadir 0,5 μL de primer RT diluido en la muestra del paso 5.9, mezcla muy suavemente por pipeteo lentamente arriba y abajo de 8 x y centrifugar brevemente.
- Incubar la muestra a 70 º C durante 2 minutos en el termociclador precalentado y luego coloque la muestra en un bloque frío.
- Añadir 1 μL de 5 x buffer strand primera, 0.5 μL de mezcla de dNTP de 12,5 mM, 0,5 μL de 100 mM Ditiotreitol (DTT), 0.5 μL de inhibidor de la Rnasa y 0,5 μL de transcriptasa reversa. Mezclar muy suavemente transfiriendo lentamente arriba y abajo de 8 x y centrifugar brevemente.
- Incubar la muestra a 50 ° C por 1 h en el termociclador precalentado para obtener cDNA.
- Añadir 4.25 μL de agua ultrapura, 12,5 μL de la mezcla PCR, 1 μL del primer índice y 1 μL de cebador universal en el cDNA. Mezclar mediante pipeteo arriba y abajo de 8 x y centrifugar brevemente.
- Colocar la muestra en un termociclador y configurar el cycler como sigue: 98 ° C por 30 s; 15 ciclos de 98 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 15 s; y al final del ciclo a 72 ° C durante 10 minutos.
Nota: La biblioteca preparada puede almacenarse a-20 ° C durante una semana. - Purificar la biblioteca de RNA por separar la biblioteca en un gel de ADN y cortar el gel (gel de extracción) entre 140 PB y 160 PB y liberador de la biblioteca del gel siguiendo el protocolo dado por el kit de construcción de la biblioteca.
Nota: En este estudio, preparada de paso 5.15 se carga la biblioteca en un gel comercial (Tabla de materiales) y la biblioteca entre 140 bp y 160 bp se purifica por un fraccionamiento automatizado de tamaño DNA (Tabla de materiales) según la Protocolo del fabricante. - Concentrar y lavar la biblioteca paso 5.16 utilizando un base de columna PCR kit de purificación (Tabla de materiales) y eluir la biblioteca en agua libre de ARNasa μL 10 finalmente.
- Carga de 1 μL de la biblioteca purificada en un chip de ADN (Tabla de materiales) para comprobar el tamaño de la biblioteca siguiendo el protocolo del fabricante.
- Diluir 1 μL de la biblioteca purificada (1: 1000) en pH 8.0 de 10 mM Tris-HCl con 0.05% polisorbato 20 y cuantificar la biblioteca por qPCR utilizando un kit de cuantificación de biblioteca comercial para cuantificar la concentración de la biblioteca utilizando los estándares de ADN en el kit.
- Cantidades iguales de la piscina de las bibliotecas de acuerdo a los requerimientos de la máquina de la secuencia y la secuencia en un sistema de secuenciación de alto rendimiento.
Nota: La construcción de la biblioteca de ARN celular se puede hacer usando los kits de la misma siguiendo el protocolo estándar de los kits.
6. bioinformática de la tubería
Nota: Se trata de una tubería interna y los programas que aquí se enumeran en la tabla de materiales.
- Recortar a Lee de baja calidad y quitar secuencias de adaptador de lecturas raws.
- Mapa de la limpia Lee diferentes tipos de RNAs.
- Anotar tRNAs permitiendo dos desajustes porque las secuencias de ARNt pesadamente modificado causan frecuente misincorporation base por el transcriptase reverso.
- Anotar miRNAs por asignación a miRNAs humanos de v21 miRBase permitiendo cero desajustes. Desde miRNAs están sujetas a y U explícita 3' adiciones finales, secuencias que no son 3' recortada de b o T hasta tres noches después de que lee se asigna a los miRNAs humanos y otros miRNAs de v21 miRBase permitiendo cero desajustes.
- Anotar a otros pertinentes RNAs pequeño (snRNA snoRNA, piRNA y Y RNAs) permitiendo un desajuste.
- Asignar la restante dice no asignada a largos conjuntos de RNA (rRNA, otros ARN de Rfam y mRNA) para evaluar la degradación.
- Anotar las secuencias en el genoma humano.
- Anotar las secuencias de genomas bacterianos.
- Normalizar la expresión de miRNA utilizando la siguiente fórmula: miRNA cuenta / el total de las cuentas de los miRNAs asignadas) x 106.
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Representative Results
El método descrito en el presente Protocolo está optimizado para recoger exRNA de cultura MSC para la siguiente secuencia de generación. El esquema general del flujo de trabajo está en la figura 1 a la izquierda y los puestos de control respectivos de control de calidad están a la derecha.
La morfología de las células en el día de la colección para indiferenciados (Figura 3A) y diferenciados (figura 3B) se muestran las células. Además, niveles normalizados representativos de la actividad de la fosfatasa alcalina de células inducida por 7 días también se muestran (figura 3). Aquí, actividad de la fosfatasa alcalina es aproximadamente 2.5 veces de las células uninduced.
Tres frascos de T175 de MSCs confluentes rendimiento 2-5 x 1010 partículas/mL (figura 2). Tamaño de partícula media es aproximadamente de 160-165 nm mientras que la mayoría de las partículas son de 130-140 nm. Había unos pequeños picos entre 200 y 500 nm, lo que indicaría grandes complejos o grandes agregados.
Puesto que el RNA puede ser degradado rápidamente, se adhieren estrictamente a las condiciones de extracción de RNA según el kit o protocolo utilizado. Libre de ARNasas condiciones de uso, en particular libre de Rnasa agua para Resuspender el RNA y RNA en el hielo siempre que sea posible. Después de la extracción, el RNA puede cuantificarse usando una máquina basada en el chip de la electroforesis capilar. Electropherograms representante del ARN después de ser analizados se muestran en la figura 4. Electroferograma de exRNAs incluye una gama amplia de RNAs (Figura 4A). En cambio, ARN celular tiene picos muy diferentes en alrededor de 70-120, 1800 y 3800 nt, que corresponden a tRNA/5S rRNA / 5.8S rRNA 18S rRNA y 28S rRNA, respectivamente (Figura 4B). El número de integridad del RNA (RIN) representa la calidad del ARN. Un buena RIN de ARN celular es > 8 (que indica casi ninguna degradación de RNA). El algoritmo en que se basa el RIN es la relación entre 28S y 18S. Esto significa que RIN no es un buen indicador de la calidad del RNA de exRNAs porque rRNAs larga duración generalmente no son detectables en exRNAs.
Después de extracción de RNA, se construyeron las bibliotecas miRNA y las bibliotecas de cDNA fueron separadas por electroforesis en gel. El cDNA de adaptador-ligarse de los miRNAs es por lo general entre 140 y 160 nt. La calidad de la biblioteca entonces fue visualizada en un equipo basado en el chip de la electroforesis capilar (figura 5). Figura 5A y figura 5B son las bibliotecas de ARN celular en el día 0 y día 7, respectivamente. Figura 5 y figura 5 son las bibliotecas de exRNA en el día 0 y día 7 respectivamente. Todas las muestras de cuatro tenían picos en alrededor de 140 nt, que indican la construcción de la biblioteca de miRNA exitosa. Se cuantificó la cantidad de cDNA en las bibliotecas por qPCR utilizando un kit de cuantificación de la biblioteca. El ciclo de cuantificación (Cq) de las normas fue trazado contra el registro de la concentración para obtener una curva estándar (figura 6). La ecuación de la curva estándar fue utilizada para calcular la concentración de las bibliotecas (tabla 1). En nuestra muestra, la concentración de las bibliotecas de exRNAs fue nM 5-8, que fue significativamente menor que las bibliotecas de RNAs celulares (8-30 nM). Las bibliotecas fueron agrupadas con la misma cantidad y enviadas para la secuencia.
Después de que las bibliotecas fueron ordenadas, la Lee de baja calidad fueron recortada a FASTX-Toolkit y la calidad resultante de la exRNAs de la biblioteca era alta y comparable a la de las bibliotecas de las células (Figura 7AB). La longitud de la secuencia de las bibliotecas de las células tenía un solo pico en alrededor de 22 nt (figura 7), que se correlaciona con los miRNAs. En cambio, las bibliotecas de exRNAs fueron más heterogéneas y contenía 3 picos importantes: 22 nt, 30 nt y 33 nt (figura 7). Similar a sus homólogos celulares, el pico a los 22 nt es el miRNAs. Una inspección más cercana reveló que los picos en 30 y 33 nt son mitades de tRNAs/fragmentos o piRNAs. Luego se trazaron las anotaciones de las lecturas asignadas. Mayoría de las lecturas (65,1%) de ARN celular asignado a miRNAs humanos y cada uno de los otros RNAs pequeños representaron una pequeña parte de las lecturas asignadas (figura 8A). En contraste, sólo el 8% de exRNAs asignados a miRNAs humanos (figura 8B). El pequeño arn más abundante a los que se asignan las lecturas eran tRNAs. La mayoría de las lecturas fueron "Lee incomparable" (43%). Más la examinación de la inigualable Lee de exRNAs a bases de datos globales llevó al hallazgo sorprendente de que la mayoría de ellos corresponde a secuencias bacterianas (74% y el 85% de exRNA D0 y D7, respectivamente; Tabla 2). En contraste, sólo el 0.9% del ARN celular era incomparable y, de ésos, sólo el 10% asignado a las bacterias. Una comparación el genoma bovino mostradas menos del 1% con lo que sugiere que los equipos no era una fuente de contaminación (tabla 2). Por lo tanto, exRNAs exhiben un perfil atípico en comparación con el ARN celular normal.
Figura 1: flujo de trabajo de análisis y secuenciación de exRNA. El flujo de trabajo se muestra a la izquierda en las cajas grises y asociado con cada paso de control de calidad es en los cuadros rojos de la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: distribución de partículas secretada por las células en el día 0 y día 7 de la diferenciación del tamaño. Resultados de NTA representante de partículas recogieron de 3 frascos de x T175 a (A) 0 y (B) el día 7 de diferenciación. Se tabula los respectivos tamaños medio y modo, así como la concentración de las partículas por debajo de los gráficos. SD: desviación de estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: la célula morfología y Diferenciación osteogénica antes de la obtención de RNA extracelular. (A) micrografía de BMSCs indiferenciados cultivados con medios de recogida el día de colección. (B) micrografía de BMSCs distinguido por 7 días con los medios de comunicación recogida en el día de colección. Barras de escala = 100 μm. (C) actividades de la fosfatasa alcalina de las células se normalizaron a sus viabilidades respectivas de la célula. Los valores graficados fueron de tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: electroferograma del representante de la integridad del RNA después de la extracción de RNA. Análisis del RNA del RNA extracelular (A) y ARN celular (B). El eje x es la longitud del ARN (nt) y el eje y es la fluorescencia. El primer pico es la escalera 25 nt. ARN ribosómico se muestran como de 18 años (1.800 nt) y 28S (3.800 nt). Número de integridad del RNA (RIN) es un indicador de calidad de RNA basado en la integridad del ARN ribosómico 18S y 28S. Números más altos de RIN igualan a mejor calidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: electroferograma representante de las bibliotecas de cDNA después de la construcción de la biblioteca. Análisis de la DNA de las bibliotecas de (A) células en el día 0, (B) en el día 7, RNA extracelular (C) desde el día 0 y RNA extracelular (D) del día 7. Números verdes y morados son las escalas en 35 nt y 10.380 nt, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: cDNA biblioteca cuantificación y cálculo. Las bibliotecas se diluyeron entre 500 - 1.000 veces por los de exRNA y entre 1.000 y 4.000 veces por RNA de la célula. Las bibliotecas fueron funcionadas junto a las normas del kit de cuantificación de la biblioteca. Los valores de Cq promedio de las normas de la DNA se trazaron contra la concentración de10 registro (pM) para generar una curva estándar, una ecuación para la curva estándar y un valor de R2 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: resultados de calidad y distribución de la longitud de las secuencias de. Baja calidad Lee y secuencias adaptador fueron recortadas con FASTX-kit de herramientas para las células (A) y (B) exRNAs. La distribución de longitud de limpieza Lee para las células (C) y (D) exRNAs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: anotación de ARNs pequeños después de la secuencia. Anotaciones representan porcentajes de Lee limpio para las células (A) y (B) exRNAs. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Muestra | Factor de dilución | Valor de CQ | log(PM) | Concentración (pM) | Media concentración (pM) | Promedio de concentración * (452/143) | Multiplicar por dillution factor (pM) |
| CMMo D0 exRNA | 500 | 7.72 | 0,702 | 5.036 | 5.276 | 16.678 | 8338.993 |
| CMMo D0 exRNA | 500 | 7.57 | 0,754 | 5.677 | |||
| CMMo D0 exRNA | 500 | 7.7 | 0.709 | 5.117 | |||
| CMMo D0 exRNA | 1000 | 8.64 | 0.383 | 2.416 | 2.365 | 7.477 | 7476.846 |
| CMMo D0 exRNA | 1000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| CMMo D0 exRNA | 1000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| ExRNA CMMo D7 | 500 | 8.52 | 0.425 | 2.659 | 3.221 | 10.182 | 5090.913 |
| ExRNA CMMo D7 | 500 | 8.42 | 0.459 | 2.880 | |||
| ExRNA CMMo D7 | 500 | 7.97 | 0.615 | 4.125 | |||
| ExRNA CMMo D7 | 1000 | 8.87 | 0.303 | 2.011 | 1.933 | 6.110 | 6110.391 |
| ExRNA CMMo D7 | 1000 | 8,92 | 0.286 | 1.932 | |||
| ExRNA CMMo D7 | 1000 | 8.97 | 0.269 | 1.857 | |||
| Célula de CMMo D0 | 1000 | 6.86 | 1.000 | 10.005 | 9.810 | 31.007 | 31006.974 |
| Célula de CMMo D0 | 1000 | 6.91 | 0.983 | 9.614 | |||
| Célula de CMMo D0 | 4000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | 2.398 | 7.581 | 30322.041 |
| Célula de CMMo D0 | 4000 | 8.59 | 0,400 | 2.514 | |||
| Célula de CMMo D0 | 4000 | 8.68 | 0.369 | 2.340 | |||
| Celda D7 CMMo | 1000 | 8,44 | 0.452 | 2.834 | 2.880 | 9.104 | 9104.439 |
| Celda D7 CMMo | 1000 | 8.43 | 0,456 | 2.857 | |||
| Celda D7 CMMo | 1000 | 8.39 | 0.470 | 2.950 | |||
| Celda D7 CMMo | 4000 | 10.36 | -0.213 | 0.612 | 0,702 | 2.218 | 8872.689 |
| Celda D7 CMMo | 4000 | 10,27 | -0.182 | 0.658 | |||
| Celda D7 CMMo | 4000 | 9.97 | -0.078 | 0.836 | |||
| Cálculos: | |||||||
| log(PM) =-0.3467 x (valor de Cq muestra) + 3.3786; Utilice la curva estándar y la fórmula | |||||||
| concentración (pM) = 10^log(pM) | |||||||
| Cálculo de ajuste de tamaño = estándar del tamaño de ADN (452 bp) dividido por la longitud del fragmento promedio (143 bp) | |||||||
Tabla 1: cuantificación de biblioteca de miRNA.
| Muestra: | # Lee no cartografía humana | # Lee a bacterias | Lee % bacteriana | # Lee a vaca | Lee % bovino |
| CMMo D0 celular | 131007 | 9858 | 8% | 99 | 0.08% |
| CMMo D7 celular | 169730 | 7935 | 5% | 188 | 0.11% |
| CMMo D0 exRNA | 6122833 | 4551477 | 74% | 891 | 0.01% |
| ExRNA CMMo D7 | 7046691 | 5970086 | 85% | 771 | 0.01% |
Tabla 2: Porcentaje de inigualable lee ese mapa a las bacterias y Lee bovina.
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Discussion
Aquí, describimos un protocolo para la siguiente secuencia de generación de exRNAs que permite el análisis de expresión diferencial de las muestras de entrada baja. Adhesión a un protocolo específico para el aislamiento de EV y exRNA es importante porque incluso pequeñas alteraciones (es decir, el paso de ultracentrifugación o un cambio en el tipo de rotor) pueden influir en el transcriptoma y miRNA niveles13,14. Así, independientemente de cómo la exRNA es aislada, es importante aplicar el mismo procedimiento experimental y bioinformática para todas las muestras en un experimento para poder comparar los resultados.
Integridad del RNA generalmente se evalúa en el equipo bioanalyzer. Sin embargo, desde exRNAs está desprovistos de integral rRNA, su valor RIN es muy baja, pero esto no refleja necesariamente las muestras de RNA de baja calidad. Además, la concentración de RNA de la exRNAs varía grandemente y es a menudo inexacta. Por lo tanto, en lugar de evaluar la calidad del RNA y cuantificar el RNA en el equipo bioanalyzer, use el mismo volumen de los medios de comunicación cada vez para su posterior procesamiento. Además, Resuspender el RNA extraído en el mismo volumen de buffer de resuspensión y utilizar el mismo volumen para la construcción de la biblioteca.
Construcción de biblioteca de RNA pequeño fue optimizado por reducir la cantidad de adaptadores a un décimo del protocolo estándar y utilizando la mitad de los otros reactivos. No sólo reducir los adaptadores previene dímeros de adaptador, también previene la intramolecular de circularización de RNA15. La reducción de los reactivos está optimizada para los Illumina TruSeq pequeños ARN muestra Kit de preparación. Pueden usarse otros equipos, se recomienda bajar también el adaptador y reactivos por lo tanto, a menos que el kit especifica que es las muestras de entrada a medida que baja. Por último, el ciclo de la polimerización en cadena para la construcción de la biblioteca se incrementó de 12 a 15 ciclos en este protocolo para tener en cuenta la baja concentración de exRNAs. Hemos encontrado este es el ajuste óptimo sin ver amplificación sesgos15.
Varias métricas de control de calidad pueden ser evaluadas incluyendo partituras de calidad base y leer perfil longitud. Al hacer el análisis de la bioinformática, la calidad base de Lee en celular ARN y exRNAs fueron similares; sin embargo, la distribución de la longitud y el origen anotado de secuencias eran completamente diferentes. La mayoría de las lecturas de ARN celular asignado a miRNAs humanos, sin embargo, una gran proporción de la exRNA Lee eran Lee inigualable. Sobre una inspección más cercana, el inigualable Lee resultó para ser bacteriana Lee (tabla 2). Esto fue sorprendente porque los antibióticos se utilizan habitualmente en nuestra cultura. Nuestro resultado se alinea bien con otros informes que también demostraron gran parte de la inigualable Lee cuando secuencia cultivos celulares derivados de exRNA16. Una de las razones de estos contaminantes es que las bacterias se superponen en tamaño con complejos extracelulares o EVs y por lo tanto Co purifican durante el paso de ultracentrifugación17. Publicaciones anteriores han identificado una amplia contaminación de ciertas bacterias en medios de cultivo que no normal de la célula de procedimientos de laboratorio18. Hasta la fecha, este problema ha sido ignorado en gran medida pero debe tenerse en cuenta a la hora de la purificación y análisis de exRNAs.
Este protocolo detalla a una guía completa de cosecha exRNAs de medios de cultivo, optimizando pequeños preparación de biblioteca de RNA y procesamiento de los datos crudos de la biblioteca. Este protocolo destaca específicamente los diversos puestos de control de control de calidad durante todo el proceso para demostrar cómo bajo muestras de entrada (como exRNAs) pueden diferir de preparaciones de la muestra normal para que otras personas que trabajan con las muestras de entrada baja pueden saber qué esperar.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al Sr. Claus Bus y Sra. Rita Rosendahl en iNANO su asistencia técnica. Agradecimiento especial a Dr. Daniel Otzen para permitir el uso frecuente de su ultracentrífuga. Este estudio fue apoyado por el fondo de innovación de Dinamarca (proyecto MUSTER).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
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