Summary
Detta protokoll visar hur att rena extracellulära mikroRNA från cell Odlingsmedier för små RNA bibliotek konstruktion och nästa generations sekvensering. Olika kvalitetskontroll kontrollpunkter beskrivs att låta läsarna att förstå vad som väntar när du arbetar med låg input prover som exRNAs.
Abstract
Extracellulära och cirkulerande RNAs (exRNA) produceras av många celltyper i kroppen och finns i ett flertal kroppsvätskor som saliv, urin, mjölk, plasma och serum. En delmängd av dessa RNAs är de från tillsynsmyndigheterna – mikroRNA (Mirna). För att avgränsa den microRNA produceras av specifika celltyper, in vitro-kultur system kan användas för att skörda och profil exRNAs härrör från en delmängd av celler. De utsöndrade faktorerna av mesenkymala stamceller är inblandade i att lindra många sjukdomar och används som in vitro-modell systemet här. Detta dokument beskriver processen för insamling, rening av små RNA och bibliotek generation till sekvens extracellulära microRNA. ExRNAs från kultur media skiljer sig från cellulära RNA genom att vara låg RNA input prover, som uppmanar till optimerad förfaranden. Detta protokoll ger en omfattande guide till små exRNA sekvensering från kultur media, visar kvalitetskontroll kontrollpunkter vid varje steg under exRNA rening och sekvensering.
Introduction
Extracellulära och cirkulerande RNAs (exRNAs) är närvarande i olika kroppsvätskor och är resistenta mot Rnaser1,2. Deras höga överflöd, stabilitet och enkel tillgänglighet är attraktiva för kliniska bedömning som diagnostiska och prognostiska markörer3. Transportsätt för exRNAs inkluderar extracellulära blåsor (EVs), association med lipoproteiner (såsom high-density lipoprotein; HDL) och ribonukleoprotein komplex (såsom med Argonaute2 komplex)4.
En delmängd av exRNAs är mikroRNA (Mirna), som är små icke-kodande RNAs av cirka 22 nt som reglerar postttransskriptionell genuttryck. Ex-microRNA har varit inblandade i cell-cell kommunikation och reglering av cell homeostas5. Till exempel HDL levererar ex-miR-223 till endotelceller att förtränga intercellulära vidhäftning molekylen 1 (ICAM-1) och inflammation6. Intressant, ses miR-223 också transporteras av extracellulära blåsor från leukocyter till lungcancerceller, programmering dem att ta på en mer invasiv fenotyp7. Således kommer att transkriptom av ex-microRNA från olika kroppsvätskor och cellodlingsmedium kraftigt förbättra vår förståelse av ex-miRNA signalering.
Små RNA sekvensering (små RNA seq) är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att förstå transkriptomik av små RNAs. Inte bara kan jämföra olika prover bland Differentiellt uttryckta kända RNAs, men romanen små RNAs kan också upptäckas och karakteriseras. Det är följaktligen också en robust metod att identifiera Differentiellt uttryckta microRNA under olika förhållanden. En av hindren av små RNA seq är dock svårigheten att generera små RNA seq bibliotek från låg exRNA ingående vätskor som cerebrospinala vätskor, saliv, urin, mjölk, serum och kultur media. TruSeq små RNA bibliotek Prep protokollet från Illumina kräver ungefär 1 µg av hög kvalitet total-RNA och NEBNext små RNA bibliotek Prep ange protokollet från New England Biolabs kräver 100 ng-1 µg RNA8,9. Ofta, total-RNA från dessa prover är nedanför detektionsgränsen för konventionella UV-vis spektrofotometrar.
Ex-microRNA härrör från kroppsvätskor är potentiellt bra Prognostiska och diagnostiska markörer. Men, för att studera de funktionella effekterna eller för att fastställa ursprunget på specifika ex-microRNA, cell kultur system används ofta istället. Mesenkymala stamceller (MSC) har studerats ingående eftersom deras EVs har varit inblandade i att lindra många sjukdomar inklusive hjärtinfarkt, Alzheimers sjukdom och graft versus host-sjukdom10. Här visar vi rening av ex-microRNA från benmärgen-derived MSCs (BMSCs) och de specifika steg som används för att optimera små RNA bibliotek konstruktion, sekvensering och dataanalys (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Odlingsmedium för mesenkymala stamceller (MSC media) är förberett i förväg som anges i Tabellen för material.
1. cell kultur
Obs: Humana mesenkymala stamceller kan erhållas från benmärgen, fettvävnad eller andra källor11. Alternativt kan hMSCs köpas genom en leverantör. De BMSCs som används i detta protokoll var härrör från benmärgen hos patienter och köpte från ett företag.
- Tina 1 x 106 BMSCs i en T175 kolv som innehåller 20 mL MSC media. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 och ersätta media var 2-3 dagar tills 80% konfluens.
- Tvätta cellerna med 5 mL 1 x PBS och kassera PBS.
- Lossa cellerna genom att tillsätta 5 mL 0,05% Trypsin-EDTA och ruvning cellerna för 5 min vid 37 ° C. Tryck på sidorna av kolven att underlätta avlossning.
- Tillsätt 15 mL MSC media att inaktivera trypsin, lossa cellerna från ytan och pipett upp och ner för att få enda cellsuspensioner.
- Samla in cellerna i en 50 mL tub och spinn ner för 5 min vid 300 x g till pellet cellerna.
- Att resuspendera cellerna i 1 mL av MSC media och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
Obs: Primär mänsklig benmärg MSCs på 80% konfluens i en T175 kolv är cirka 2 x 106 celler. - Platta hMSCs på 2 000 celler/cm2 i färska MSC media i 5 T175 kolvar. Odla cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 och ersätta media var 2-3 dagar tills 5 flaskor 90% konfluenta T175 mätkolvar erhålls.
2. EVs och RNA-associerade biomolekyler samling
Obs: EV samling media är förberett i förväg (Dulbeccos modifierade örnens Medium [DMEM] med 10% fetalt bovint serum [FBS] och 1% penicillin/streptomycin [P/S]). EV samling media är normala MSC media, men beredd med kommersiella EV-utarmat FBS (Tabell för material). Detta är att undvika bovin exRNA kontaminering från FBS, som normalt innehåller exRNAs som är associerad med EVs, ribonucleoproteins och lipoproteiner. För små RNA bibliotek förberedelse krävs exRNAs härrör från 5 konfluenta kolvar av MSCs för att aktivera bibliotek konstruktion.
- Tvätta cellerna 3 x med 20 mL PBS per T175 kolv. Tillsätt 20 mL EV samling media per konfluenta T175 kolv av MSCs och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2 för 48 h.
- Samla in media och centrifugera media för 10 min vid 300 x g och 4 ° C.
- Samla in supernatanten och centrifugera media för 20 min vid 2000 x g och 4 ° C.
- Samla in supernatanten och centrifugera media för 30 min vid 15.500 x g och 4 ° C. Sedan samla supernatanten.
- Överför media till ultracentrifugen rör och pellet exRNAs för 90 min 100 000 x g och 4 ° C. En fast vinkel rotor används här och pelleten är förankrad vid sidan av röret. Markera sidan av locket och rita en cirkel på sidan av röret där pelleten förväntas.
- Ta bort supernatanten, torka insidan av röret genom att Invertera röret på absorberande papper och använda små bitar av absorberande papper att ta bort vätskan inuti röret utan att röra botten av röret. Återsuspendera pelleten i 200 μL av PBS av vortexa för 30 s och pipettering upp och ner 20 x.
- Bedöma EVs och biomolekyler med nanopartiklar spårning analys (NTA) (figur 2).
Obs: De EVs och biomolekyler kan bedömas med nanopartiklar spårning analys (NTA), dynamisk ljusspridning (DLS) eller överföring elektronmikroskopi (TEM)12. - Lagra EVs och biomolekyler vid-80 ° C tills vidare nedströms experiment.
Obs: Om EVs ska användas för funktionella studier, 20% glycerol måste läggas till skydda dem från spricker. Cellerna kan samlas med standardförfaranden om det behövs.
3. EVs och RNA-associerade biomolekyler samling differentierade celler
Obs: EVs och RNA associerade biomolekyler kan också hämtas från cell kultur media medan cellerna genomgår differentiering. I exempel som skildras i protokollet beskrivs osteoblastiska differentiering och exRNA samlingen på dag 0 och 7 av differentiering. Om ingen differentiering krävs, sedan hoppa över punkt 3 och gå till avsnitt 4.
- Förbered osteoblastiska differentiering (DMEM med 10% FBS, 1% P/S, 10 mM β-glycerofosfat, 10 nM dexametason, 50 μM askorbat-2-fosfat och 10 mM 1.25-vitamin-D3) färska varje gång.
- När MSCs är 80% konfluenta, ändra MSC media till osteoblastiska differentiering media.
- Fylla på osteoblastiska differentiering media efter 2-3 dagar.
- På dag 5 av differentiering, ta bort media och tvätta cellerna 3 x med 20 mL PBS per T175 kolv.
- Tillsätt 20 mL av EV samling media som innehåller 10 mM β-glycerofosfat, 10 nM dexametason, 50 μM askorbat-2-fosfat och 10 mM 1.25-vitamin-D3 per konfluenta T175 kolv av MSCs. Inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2 för 48 h att säkerställa fortsatt differentiering och samla de EVs och biomolekyler.
- Samla in media på dag 7 och fortsätt att isolera EVs och biomolekyler som beskrivs i steg 2.2-2.6.
- För kvalitetskontroll, utsäde celler i 96-brunnar eller 6-wells att bedöma differentiering genom ett alkaliskt fosfatas (ALP) aktivitet assay eller med kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR), respektive.
Obs: Figur 3 är ett exempel som visar osteogent differentiering av celler.
4. RNA-extraktion och kvalitetskontroll
- Tina prover från steg 2,8 på is. Extrahera RNA med en RNA isolering kit (Tabell för material).
- Eluera RNA från kolumnen i RNA isolering kit (Tabell för material) i 100 μL RNase-gratis vatten.
- Koncentrera sig RNA genom etanol nederbörd genom att lägga 1 μL av glykogen, 10 μL av 2 M pH 5,5 natriumacetat och 250 μL före kylda 99% etanol i 100 μL av renat RNA.
- Inkubera proverna vid-20 ° C över natten för att fälla ut RNA. Pellet RNA genom centrifugering för 20 min på 16 000 x g och 4 ° C.
Obs: Pelleten är vita på grund av samfällning med glykogen. - Avlägsna supernatanten och tvätta RNA pelleten med 1 mL 75% etanol. Pellet RNA igen för 5 min vid 16 000 x g och 4 ° C.
- Ta bort etanol och lämna locket av RNA röret öppen för 5-10 min till luft torr RNA pelleten. Återsuspendera pelleten RNA i 7 μL RNase-gratis vatten.
- Kontrollera RNA kvalitet och koncentration med en chip-baserade kapillärelektrofores maskin för att upptäcka RNA enligt tillverkarens protokoll före bibliotek konstruktion.
Obs: En representativ storlek distribution av RNA visas i figur 4. - Extrahera cellulära RNA med en kommersiell rening kit (Tabell för material) om det behövs.
5. bibliotek konstruktion och kvalitetskontroll
Obs: Små RNA bibliotek är konstruerade med kommersiella Kit (Tabell för material) med justeringar på grund av den låga RNA ingång. Bibliotek konstruktion utförs på kylda blocket.
- Chill värmeblocket för 0,2 mL PCR-rören på is och Pipettera 5 μL av RNA från steg 4,6 till 0,2 mL RNase-fri PCR-rören på en kyld block.
- Späd 3' adaptrar (1:10) i RNase-fritt vatten i en 0,2 mL RNase-fri PCR-röret. Tillsätt 0,5 μL av utspädda adapter och blanda med 5 μL av RNA genom pipettering upp och ner 8 x och centrifugera kort för att samla all vätska på botten av röret.
- Inkubera RNA och 3' adapter mixen vid 70 ° C i 2 min i en förvärmd termocykel och sedan placera provet tillbaka på kylda blocket.
- Tillsätt 1 μL av ligering buffert, 0,5 μL av RNase inhibitor och 0,5 μL av T4 RNA ligase (radering mutant) i RNA och 3' adapter blandningen. Blanda genom pipettering upp och ner 8 x och centrifugera kort.
- Inkubera röret vid 28 ° C för 1 h i den förvärmd termocykel.
- Tillsätt 0,5 μL stopplösning i provet röret med röret i termocykel, blanda genom pipettering upp och ner 8 x och fortsätta att Inkubera vid 28 ° C under 15 minuter.
- Späd 5' adaptrar (1:10) i RNase-fritt vatten i en 0,2 mL RNase-fri PCR-röret. Tillsätt 0,5 μL av 5' adapter i ett separat RNase-fri 0,2 mL PCR-rör, värme 5' adaptern vid 70 ° C i 2 min i en förvärmd termocykel, och sedan placera provet på kylda blocket.
- Tillsätt 0,5 μL 10 nM ATP, 0,5 μL av T4 RNA ligase till 5' adapter röret, blanda genom pipettering upp och ner 8 x och centrifugera kort för att samla in alla vätskorna i botten.
Obs: Håll adaptern 5' på kylda block så mycket som möjligt. - Tillsätt 1,5 μL av 5' adapter blandningen från steg 5,6 och blanda mycket försiktigt genom pipettering 8 x långsamt. Inkubera provet vid 28 ° C för 1 h i den förvärmd termocykel.
- Späd RT primer 1:10 i RNase-fritt vatten i ett RNase-fri 0,2 mL PCR-rör. Tillsätt 0,5 μL av utspädda RT primer i provet från steg 5.9, mixen mycket försiktigt genom pipettering upp och ner 8 x långsamt och centrifugera kort.
- Inkubera provet vid 70 ° C i 2 min i en förvärmd termocykel och sedan placera provet på en kyld block.
- Tillsätt 1 μL av 5 x första strand buffert, 0,5 μL av 12,5 mM dNTP mix, 0,5 μL av 100 mM Ditiotreitol (DTT), 0,5 μL av RNase inhibitor, och 0,5 μL av omvänt transkriptas. Blanda mycket försiktigt genom pipettering upp och ner 8 x långsamt och centrifugera kort.
- Inkubera provet vid 50 ° C för 1 h i den förvärmd termocykel att erhålla cDNA.
- Lägg till 4.25 μL av ultrarent vatten, 12,5 μl av PCR-mix, 1 μL av index primer och 1 μL av universal primer till cDNA. Blanda genom pipettering upp och ner 8 x och centrifugera kort.
- Placera provet i en termocykel och Ställ apparat enligt följande: 98 ° C i 30 s; 15 cykler av 98 ° C för 10 s, 60 ° C under 30 s och 72 ° C under 15 s; och avsluta cykeln med 72 ° C i 10 min.
Obs: Beredda biblioteket kan förvaras vid-20 ° C under en vecka. - Rena RNA biblioteket genom att separera biblioteket på en DNA-gel och skära gelen (gel extraktion) mellan 140 bp och 160 bp och eluering biblioteket från gelen efter protokollet ges av bibliotek byggsats.
Obs: I denna studie är beredda biblioteket från steg 5.15 laddad på en kommersiell gel (Tabell av material) och biblioteket mellan 140 bp och 160 bp renas ut genom en automatiserad DNA storlek naftafraktioneringskolonn (Tabell för material) enligt den tillverkarens protokollet. - Koncentrera sig och tvätta biblioteket från steg 5.16 använder ett kolumnbaserade PCR rening kit (Tabell av material) och eluera biblioteket i 10 μL RNase-fritt vatten slutligen.
- Ladda 1 μL av renat biblioteket på en DNA chip (Tabell för material) för att kontrollera storleken på biblioteket efter tillverkarens protokollet.
- Späd 1 μL av renat bibliotek (1: 1000) 10 mM pH 8,0 i Tris-HCl med 0,05% polysorbat 20 och kvantifiera biblioteket av qPCR med en kommersiell bibliotek kvantifiering kit för att kvantifiera bibliotek koncentrationen med hjälp av DNA-standarder i kit.
- Poolen lika mängder biblioteken enligt kraven i den sekvensering maskinen och sekvens på en hög genomströmning sekvensering system.
Obs: Biblioteket byggandet av cellulära RNA kan göras med samma kit Följ standardprotokoll av byggsatser.
6. bioinformatik pipeline
Obs: Detta är en intern pipeline och de program som används här är listade i den tabell för material.
- Trimma bort låg kvalitet läsningar och ta bort adaptern sekvenser från de raw-läsningar.
- Mappa den rena läser till olika sorters RNAs.
- Kommentera tRNAs genom att låta två missmatchningar eftersom den kraftigt modifierade tRNA-sekvenser orsaka täta bas misinkorporering av omvänt transkriptas.
- Kommentera microRNA genom att mappa till mänskliga microRNA från miRBase v21 ger noll mismatches. Eftersom microRNA är föremål för A och U nontemplated 3' slutet tillägg, sekvenser som inte mappas är 3' trimmas av upp till tre A eller T nts varefter läsningar är mappade till mänskliga microRNA och andra microRNA från miRBase v21 ger noll mismatches.
- Kommentera att andra relevanta små RNAs (snRNA, snoRNA, piRNA och Y RNAs) genom att låta en obalans.
- Mappa den återstående omappade läser till lång RNA datamängder (rRNA, andra RNA från Rfam och mRNA) för att bedöma nedbrytning.
- Kommentera sekvenserna till det mänskliga genomet.
- Kommentera sekvenserna till bakteriella genomet.
- Normalisera miRNA uttryck med hjälp av följande formel: miRNA räknas / summan räknas av alla mappade microRNA) x 106.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den metod som beskrivs i detta protokoll är optimerad för att samla in exRNA från MSC kultur för nästa generations sekvensering. Det övergripande systemet av arbetsflödet är i figur 1 till vänster och respektive kvalitetskontroll kontrollpunkterna är till höger.
Morfologi av celler med samma dag som uppsamlingen för odifferentierade (figur 3A) och differentierade (figur 3B) celler visas. Dessutom visas också representativ normaliserade nivåer av ALP aktiviteten hos celler som induceras i 7 dagar (figur 3 c). Här, är ALP aktivitet ungefär 2,5 gånger de uninduced cellerna.
Tre T175 kolvar av konfluenta MSCs kapacitet 2-5 x 1010 partiklar/mL (figur 2). Aerosolens är ungefär 160-165 nm medan de flesta av partiklarna är 130-140 nm. Det fanns ett par mindre toppar mellan 200 och 500 nm, vilket tyder på stora komplex eller stora aggregat.
Eftersom RNA kan brytas ned snabbt, strikt följa villkoren för RNA-extraktion enligt i kit eller protokoll som används. RNase-fri användningsförhållanden, särskilt RNase-fritt vatten för att resuspendera RNA och hålla RNA på isen när det är möjligt. Efter extraktion, kan RNA kvantifieras med en chip-baserade kapillärelektrofores maskin. Representant elektroferogrammen av RNA efter analyseras visas i figur 4. Elektroferogram av exRNAs omfattar ett brett utbud av RNAs (figur 4A). Däremot cellulära RNA har mycket distinkta toppar på runt 70-120, 1800, och 3800 nt, som motsvarar tRNA/5S rRNA / 5.8S rRNA, 18S rRNA och 28S rRNA, respektive (figur 4B). RNA integritet numret (RIN) representerar kvaliteten på RNA. En bra RIN cellulära RNA är > 8 (indikerar nästan inga RNA nedbrytning). Algoritmen som RIN bygger är förhållandet mellan 28S och 18S. Detta innebär att RIN inte är en bra indikator på RNA kvaliteten på exRNAs eftersom fullängds rRNAs inte kan vanligtvis påvisas i exRNAs.
Efter RNA-extraktion, miRNA biblioteken konstruerades och cDNA biblioteken var separerade med gelelektrofores. Den adapter-sammanskrivna cDNA av microRNA är vanligtvis mellan 140 och 160 nt. Kvaliteten på biblioteket var sedan visualiseras på en chip-baserade kapillärelektrofores maskin (figur 5). Figur 5A och figur 5B är biblioteken från cellulära RNA vid dag 0 och dag 7, respektive. Figur 5 c och figur 5 d är exRNA biblioteken vid dag 0 och dag 7 respektive. Alla fyra prover hade toppar på runt 140 nt, som indikerar framgångsrika miRNA bibliotek konstruktion. Mängden cDNA i biblioteken kvantifierades av qPCR med hjälp av ett bibliotek kvantifiering kit. Cykelns kvantifiering (Cq) standarder var plottas mot stocken av koncentrationen att få en standardkurva (figur 6). Ekvationen för standardkurvan användes sedan för att beräkna koncentrationen av biblioteken (tabell 1). I vår prov var koncentrationen av biblioteken från exRNAs 5-8 nM, vilket betydligt lägre än bibliotek från cellulära RNAs (8-30 nM). Biblioteken var sedan samman med motsvarande belopp och sände för sekvensering.
När biblioteken var sekvenserade, den låg kvalité läser var putsade bort med FASTX-Toolkit och resulterande kvaliteten på de bibliotek exRNAs var hög och jämförbar med biblioteken från cellerna (figur 7AB). Sekvens längden på biblioteken från celler hade en enkel topp runt 22 nt (figur 7 c), som korrelerar microRNA. Däremot biblioteken från exRNAs mer heterogena och innehöll 3 stora toppar: 22 nt, 30 nt och 33 nt (figur 7 d). Liknar deras cellulära motsvarigheter, toppen vid 22 nt är microRNA. Närmare inspektion visade att topparna på 30 och 33 nt är tRNAs halvor/fragment eller piRNAs. Anteckningarna av den mappade läser var sedan plottas. De flesta av läser (65,1%) från cellulära RNA mappas till mänskliga microRNA och alla andra små RNASEN stod för en liten del av den mappade läser (figur 8A). Contrastingly, endast 8% av exRNAs mappas till mänskliga microRNA (figur 8B). Den vanligast förekommande små RNA som läser mappad var tRNAs. De flesta av läser var ”oöverträffad läser” (43%). Ytterligare undersökning av oöverträffad läser från exRNAs till globala databaser ledde till överraskande slutsatsen att de flesta av dem motsvarar bakteriell sekvenser (74% och 85% för D0 och D7 exRNA, respektive; (Se tabell 2). Däremot endast 0,9 procent av cellulära RNA var oöverträffad och av dessa är endast 10% mappas till bakterier. En jämförelse med nötkreatur genomet visade mindre än 1% matcha tyder på att FBS inte var en källa till kontaminering (tabell 2). Därför uppvisar exRNAs en atypisk profil jämfört med normala cellulära RNA.
Figur 1: arbetsflöde för exRNA sekvensering och analys. Hela arbetsflödet är avbildad till vänster i grå rutor och kvalitetskontroll är associerad med varje steg i de röda rutorna till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: storlek partiklarnas utsöndras av celler på dag 0 och dag 7 av differentiering. Representant NTA resultatet av partiklar som samlats in från 3 x T175 kolvar på (en) dag 0 och (B) dag 7 av differentiering. De respektive medelvärde och läge storlekarna samt koncentrationen av partiklar är i tabellform under diagrammen. SD: standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Cell morfologi och osteogent differentiering före extracellulära RNA samlingen. (A) Mikrograf av odifferentierade BMSCs odlade med samling media på dag då uppsamlingen. (B) Mikrograf av BMSCs göras åtskillnad mellan i 7 dagar med samling media på dag då uppsamlingen. Skala barer = 100 µm. (C) ALP aktiviteter av cellerna var normaliserade till deras respektive cell förmåga. De värden som ritas var det av tre oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representant elektroferogram RNA integritet efter RNA-extraktion. RNA analyser av extracellulära RNA (A) och cellulära RNA (B). X-axeln är längden av RNA (nt) och y-axeln är fluorescensen. Den första toppen är stegen 25 nt. ribosomalt RNA visas som 18S (1.800 nt) och 28S (3 800 nt). RNA är integritet (RIN) en indikator på RNA kvalitet baserat på 18S och 28S ribosomalt RNA integritet. Högre RIN nummer lika med bättre kvalitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representant elektroferogram cDNA bibliotek efter bibliotek konstruktion. DNA-analyser av biblioteken från (A) celler på dag 0, (B) celler på dag 7, (C) extracellulära RNA från dag 0 och (D) extracellulära RNA från dag 7. Gröna och lila siffror är stegarna på 35 nt och 10.380 nt, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: cDNA bibliotek kvantifiering och beräkningen. Bibliotek späddes mellan 500 - 1 000 gånger för dem från exRNA och mellan 1 000 och 4 000 gånger för cell RNA. Biblioteken var köra tillsammans med standarderna från biblioteket kvantifiering kit. Cq genomsnittsvärdena för de DNA-standarderna var plottas mot log10 koncentrationen (pM) till generera en standardkurva, en ekvation för standardkurvan och ett R2 -värde. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: kvalitetsresultat och längd distribution av sekvenser. Låg kvalitet läser och adapter sekvenser var kantad med FASTX-Toolkit för (A) celler och (B) exRNAs. Längd distribution av rena läser för (C) celler och (D) exRNAs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: annotering av små RNAs efter sekvensering. Anteckningar representerar procentandelar av ren läsningar för (A) celler och (B) exRNAs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Prov | Utspädningsfaktor | CQ värde | log(pM) | Koncentration (pM) | Koncentrationen innebär (pM) | Koncentrationen innebär * (452/143) | Multiplicera med utspädning faktor (pM) |
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7,72 | 0.702 | 5.036 | 5.276 | 16.678 | 8338.993 |
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7,57 | 0.754 | 5.677 | |||
| BMSC D0 exRNA | 500 | 7,7 | 0.709 | 5.117 | |||
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8,64 | 0.383 | 2.416 | 2.365 | 7.477 | 7476.846 |
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8,68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D0 exRNA | 1000 | 8,68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D7 exRNA | 500 | 8,52 | 0.425 | 2.659 | 3.221 | 10.182 | 5090.913 |
| BMSC D7 exRNA | 500 | 8,42 | 0.459 | 2.880 | |||
| BMSC D7 exRNA | 500 | 7,97 | 0.615 | 4.125 | |||
| BMSC D7 exRNA | 1000 | 8,87 | 0.303 | 2,011 | 1.933 | 6.110 | 6110.391 |
| BMSC D7 exRNA | 1000 | 8.92 | 0,286 | 1.932 | |||
| BMSC D7 exRNA | 1000 | 8,97 | 0.269 | 1.857 | |||
| BMSC D0 cell | 1000 | 6,86 | 1.000 | 10.005 | 9.810 | 31.007 | 31006.974 |
| BMSC D0 cell | 1000 | 6,91 | 0.983 | 9.614 | |||
| BMSC D0 cell | 4000 | 8,68 | 0.369 | 2.340 | 2.398 | 7.581 | 30322.041 |
| BMSC D0 cell | 4000 | 8,59 | 0.400 | 2.514 | |||
| BMSC D0 cell | 4000 | 8,68 | 0.369 | 2.340 | |||
| BMSC D7 cell | 1000 | 8,44 | 0.452 | 2.834 | 2.880 | 9.104 | 9104.439 |
| BMSC D7 cell | 1000 | 8,43 | 0.456 | 2.857 | |||
| BMSC D7 cell | 1000 | 8.39 | 0.470 | 2.950 | |||
| BMSC D7 cell | 4000 | 10,36 | -0.213 | 0,612 | 0.702 | 2,218 | 8872.689 |
| BMSC D7 cell | 4000 | 10.27 | -0.182 | 0,658 | |||
| BMSC D7 cell | 4000 | 9,97 | -0.078 | 0,836 | |||
| Beräkningar: | |||||||
| log(pM) =-0.3467 x (prov Cq värde) + 3.3786; använda standardkurva och formel | |||||||
| koncentration (pM) = 10^log(pM) | |||||||
| Storlek justering beräkning = storlek av DNA standard (452 bp) dividerat med genomsnittliga fragment längden (143 bp) | |||||||
Tabell 1: miRNA bibliotek kvantifiering.
| Prov: | # läser inte att kartlägga mänskliga | # läser mappning till bakterier | % bakteriell läsningar | # läser mappning till Ko | % bovint läsningar |
| BMSC D0 Cell | 131007 | 9858 | 8% | 99 | 0,08% |
| BMSC D7 Cell | 169730 | 7935 | 5% | 188 | 0,11% |
| BMSC D0 exRNA | 6122833 | 4551477 | 74% | 891 | 0,01% |
| BMSC D7 exRNA | 7046691 | 5970086 | 85% | 771 | 0,01% |
Tabell 2: Procentandelen av oöverträffad läser kartan till bakterier och bovin läsningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett protokoll för nästa generations sekvensering av exRNAs som möjliggör differentiell uttryck analyser från låg input prover. Det är viktigt att följa ett visst protokoll för EV och exRNA isolering eftersom även små förändringar (dvs steget ultracentrifugering eller en förändring i rotorn typ) kan påverka transkriptom och miRNA nivåer13,14. Således, oavsett hur exRNA är isolerade, är det viktigt att tillämpa samma experimentella och bioinformatiska procedur på alla prover i ett experiment för att kunna jämföra resultaten.
RNA integritet bedöms vanligtvis på bioanalyzer. Eftersom exRNAs är saknar full längd rRNA, deras RIN värde är mycket låg, men detta avspeglar inte nödvändigtvis låg kvalitet RNA-prover. Dessutom den RNA-koncentrationen av exRNAs varierade kraftigt och är ofta felaktig. Därför, i stället för att bedöma RNA kvalitet och kvantifiera RNA på bioanalyzer, använda samma volym av media varje gång för vidare bearbetning. Även Återsuspendera extraherade RNA i samma volym av resuspension buffert och använda samma volym för bibliotek konstruktion.
Små RNA bibliotek konstruktion har optimerats genom att minska mängden adaptrar till en tiondel av standardprotokollet och använda hälften av andra reagenser. Inte bara att minska adaptrar förhindrar adapter dimerer, det förhindrar också intramolekylära RNA circularization15. Minskningen av reagenser är optimerad för Illumina TruSeq små RNA prov Prep Kit. Andra kit kan användas, rekommenderas också lägre adapter och reagenser med detta, såvida inte satsen anger att det är anpassat till låg input prover. Slutligen, PCR-cykeln för bibliotek konstruktion ökade från 12 till 15 cykler i detta protokoll att ta hänsyn till den låga koncentrationen av exRNAs. Vi har funnit detta vara den optimal justeringen utan att se förstärkning fördomar15.
Olika kvalitetskontroll mätvärden kan bedömas inklusive bas kvalitetsresultat och läsa längd profil. När du gör bioinformatik analyser, bas kvaliteten av läser i cellulära RNA och exRNAs var likartade. längd distribution och sekvenser kommenterad ursprung var dock helt olika. De flesta av läser från cellulära RNA mappas till mänskliga microRNA, dock en stor andel av exRNA läser var oöverträffad läsningar. Vid närmare inspektion läser den oöverträffade läser visade sig vara bakteriell (tabell 2). Detta var förvånande eftersom antibiotika rutinmässigt används i vår kultur. Vårt resultat justerar väl med andra rapporter som visade också stor del av oöverträffad läser när sekvensering cellkultur härrör exRNA16. En av orsakerna till dessa föroreningar är att bakterier överlappar i storlek med extracellulära komplex eller EVs och därmed samtidig rena under den ultracentrifugering steg17. Tidigare publikationer har identifierat utbredd kontaminering av vissa bakterier i kultur media som förblir oupptäckta under normal cell lab förfaranden18. Hittills har detta problem har till stor del ignorerats men bör beaktas när renande och analysera exRNAs.
Detta protokoll Detaljer en komplett guide till skörd exRNAs från kultur media, optimera små RNA bibliotek förberedelse och bearbetning raw bibliotek data. Detta protokoll belyser specifikt de olika kvalitetskontroll kontrollpunkterna i hela processen för att demonstrera hur lågt input prover (som exRNAs) kan avvika från normala prov preparat så att andra som arbetar med låg input prover kan vet vad som förväntar oss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma att Mr Claus buss och Ms. Rita Rosendahl på iNANO för deras tekniskt bistånd. Speciellt tack till Dr. Daniel Otzen för att låta våra frekventa användningen av hans ultracentrifugen. Denna studie stöddes av Danmarks Innovationsfonden (SAMLINGS-projektet).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells | ATCC | PCS-500-012 | Cells used in this protocol was bought from ATCC |
| MSCGM BulletKit | Lonza | PT-3001 | Termed as Mesenchymal Stem Cell Growth Medium (MSC media) |
| Exosome-depleted FBS | Gibco | A2720801 | |
| ExRNA collecting media: MSCGM but with the FBS replaced by exosome-depleted FBS | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| T175 Flask | Sarstedt | 833,912 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 806552 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter | 355618 | |
| Beckman Coulter Type 60 Ti | Rotor used here | ||
| NucleoCounter | Chemometec | NC-3000 | Cell Counter |
| β-glycerophosphate | Calbiochem | 35675 | Components of the osteogenic differentiation media |
| Dexamethasone | Sigma | D4902-25MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| 2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma | 49752-10G | Components of the osteogenic differentiation media |
| 1α,25-Dihydroxyvitamin D3 | Sigma | D1530-1MG | Components of the osteogenic differentiation media |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | miRNA and total RNA purification kit for step 4.8 |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1514 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939BA | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | Chip-based capillary electrophoresis machine and chips for RNA and DNA analysis |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche | KK4824 | Library quantification kit used here |
| TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A (24 rxns) (Set A: indexes 1-12) | Illumina | RS-200-0012 | Small RNA library prepartion kit used in this protocol - used in step 5 |
| Pippin Prep | Sage Science | Automated DNA gel extractor used in this protocol; manual extraction can be done too | |
| MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | PCR purification in step 5.17 |
| FASTX_Toolkit | Cold Spring Harbor Lab | Trimming low-quality reads in step 6 | |
| cutadapt | Adaptor removal in step 6 | ||
| Bowtie | Mapping of clean reads in step 6 | ||
| Samtools | To make the expression profile in step 6 | ||
| Bedtools | To make the expression profile in step 6 |
References
- Etheridge, A., Gomes, C. P., Pereira, R. W., Galas, D., Wang, K. The complexity, function and applications of RNA in circulation. Frontiers in Genetics. 4, 115 (2013).
- Koberle, V., et al. Differential Stability of Cell-Free Circulating microRNAs: Implications for Their Utilization as Biomarkers. Plos One. 8 (9), e75184 (2013).
- Anfossi, S., Babayan, A., Pantel, K., Calin, G. A. Clinical utility of circulating non-coding RNAs - an update. Nature Reviews Clinical Oncology. , (2018).
- Li, K., et al. Advances, challenges, and opportunities in extracellular RNA biology: insights from the NIH exRNA Strategic Workshop. JCI Insight. 3 (7), (2018).
- Turchinovich, A., Samatov, T. R., Tonevitsky, A. G., Burwinkel, B. Circulating miRNAs: cell-cell communication function. Frontiers in Genetics. 4, 119 (2013).
- Tabet, F., et al. HDL-transferred microRNA-223 regulates ICAM-1 expression in endothelial cells. Nature Communications. 5, 3292 (2014).
- Zangari, J., et al. Rapid decay of engulfed extracellular miRNA by XRN1 exonuclease promotes transient epithelial-mesenchymal transition. Nucleic Acids Research. 45 (7), 4131-4141 (2017).
- Illumina. TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support Input Requirements. , Available from: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v2/input_req.html (2018).
- NEB. NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina Set 1, Set 2, Index Primers 1–48 and Multiplex Compatible Instruction Manual. , Available from: https://www.neb.com/-/media/catalog/datacards-or-manuals/manuale7300_e7330_e7560_e7580.pdf (2018).
- Heldring, N., Mager, I., Wood, M. J. A., Le Blanc, K., Andaloussi, S. E. L. Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cells and Their Extracellular Vesicles. Human Gene Therapy. 26 (8), 506-517 (2015).
- Ullah, I., Subbarao, R. B., Rho, G. J. Human mesenchymal stem cells - current trends and future prospective. Bioscience Reports. 35 (2), (2015).
- Szatanek, R., et al. The Methods of Choice for Extracellular Vesicles (EVs) Characterization. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).
- Van Deun, J., et al. EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research. Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).
- Raabe, C. A., Tang, T. H., Brosius, J., Rozhdestvensky, T. S. Biases in small RNA deep sequencing data. Nucleic Acids Research. 42 (3), 1414-1426 (2014).
- Reza, A. M., Choi, Y. J., Yasuda, H., Kim, J. H. Human adipose mesenchymal stem cell-derived exosomal-miRNAs are critical factors for inducing anti-proliferation signalling to A2780 and SKOV-3 ovarian cancer cells. Scientific Reports. 6, 38498 (2016).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Asghar, M. T., et al. Sphingomonas sp is a Novel Cell Culture Contaminant. Journal of Cellular Biochemistry. 116 (6), 934-942 (2015).
