Summary
يصف لنا طريقة استخدام بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد)-مغلف بأكسيد الحديد سوبيرباراماجنيتيك جسيمات نانوية الضامة ترانسفيكتينج مع siRNA. يمكن تقديم هذه الجسيمات النانوية كفاءة siRNA الضامة في المختبر و في فيفو والصمت في التعبير الجيني المستهدف.
Abstract
بسبب دورها الحاسم في تنظيم الاستجابات المناعية، الضامة خضعت بشكل مستمر من البحث المكثف، وتمثل هدفا علاجية واعدة في اضطرابات كثيرة، مثل أمراض المناعة الذاتية، وتصلب الشرايين، والسرطان. إسكات الجينات بوساطة [رني] نهج قيمة الاختيار للتحقيق والتعامل مع الدالة بلعم؛ ومع ذلك، تعداء الضامة مع siRNA ويعتبر غالباً ما تكون صعبة من الناحية التقنية، وفي الوقت الحاضر، تتوفر بعض المنهجيات مخصصة لنقل siRNA إلى الضامة. نقدم هنا، على بروتوكول لاستخدام جسيمات نانوية المغلفة بولييثيلينيميني أكسيد الحديد سوبيرباراماجنيتيك (بي-سبيونس) كوسيلة لإيصال siRNA المستهدفة إلى الضامة. بي-سبيونس قادرون على الملزمة والتكثيف siRNA تماما عندما تصل نسبة وزن الحديد: siRNA 4 وما فوقها. في المختبر، هذه الجسيمات النانوية يمكن أن كفاءة تسليم siRNA الضامة الأولية، وكذلك في خط الخلية 264.7 الخام مثل بلعم، دون تعريض بقاء الخلية في الجرعة المثلى تعداء،، وفي نهاية المطاف، أنها تحفز الهدف بوساطة siRNA إسكات الجينات. وبصرف النظر عن تستخدم في المختبر تعداء siRNA، بي-سبيونس أيضا أداة واعدة لتقديم siRNA الضامة في فيفو. وبالنظر إلى ميزاته مجتمعة الخاصية المغناطيسية والقدرة على إسكات الجينات، ينتظر تدار النظامية بي-جاسوس/siRNA الجسيمات تعدل الدالة بلعم بل أيضا لتمكين الضامة إلى تصويرها وتعقبها. في جوهرها، بي-سبيونس تمثل منبرا فاجيناليس بسيطة وآمنة وفعالة لإيصال siRNA إلى الضامة على حد سواء في المختبر و في فيفو.
Introduction
الضامة نوع من الخلايا المناعية الفطرية التي وزعت في جميع أنسجة الجسم، أن كان ذلك بمقادير مختلفة. بإنتاج مجموعة متنوعة من السيتوكينات والوسطاء الآخرين، أنها تلعب أدواراً حاسمة في الدفاع المضيف ضد غزو الجراثيم المسببة للأمراض وفي إصلاح الأنسجة بعد الإصابة، وفي الحفاظ على التوازن الأنسجة1. بسبب أهميتها، قد الضامة باستمرار موضوع البحث المكثف. ومع ذلك، على الرغم من انتشاره في تنظيم الجينات ودراسات مهمة، إسكات الجينات siRNA بوساطة أقل احتمالاً لينجح في الضامة لهذه الخلايا – خاصة، الضامة الأولية – غالباً ما تكون صعبة ترانسفيكت. وهذا يمكن أن يعزى إلى درجة عالية نسبيا من السمية المرتبطة بنهج تعداء الأكثر الراسخة التي يكون فيها غشاء الخلية كيميائيا (مثلاً، مع البوليمرات والدهون) أو ماديا (مثلاً، انهانسر و تعطل الجينات البنادق) للسماح siRNA الجزيئات عبر الغشاء، الحد بشكل كبير وبالتالي الضامة جدوى2،3. وعلاوة على ذلك، يتم الضامة الغنية في إنزيمات بوليمرات مخصصة البالعات. يمكن أن تتلف هذه الإنزيمات سلامة siRNA، إضعاف كفاءته إسكات حتى إذا تم تسليم siRNA الخاصة بالجينات في الخلية3،4. ولذلك، يحتاج نظام تسليم siRNA فعالة تستهدف بلعم لحماية سلامة واستقرار siRNA أثناء تسليم4.
من الواضح بصورة متزايدة أن الضامة مختلة متورطون في بدء وتطور بعض الاضطرابات السريرية الشائعة مثل أمراض المناعة الذاتية، وتصلب الشرايين والسرطان. ولهذا السبب، تحوير وظيفة بلعم مع، على سبيل المثال، siRNA، الناشئة بطريقة جذابة لعلاج هذه الاضطرابات5،،من67. على الرغم من أن قدرا كبيرا من التقدم قد أحرز، تحديا رئيسيا لاستراتيجية العلاج القائم على siRNA من خصوصية خلية الفقراء siRNA تدار النظامية وامتصاص siRNA غير كافية بالضامة، مما يؤدي بالتالي إلى آثار جانبية غير مرغوب فيها. بالمقارنة مع العلاجات مجاناً الحمض النووي التي تفتقر عادة إلى الانتقائية الخلية المثلى، وغالباً ما يؤدي إلى آثار سلبية، محملة بالمخدرات جسيمات نانوية (NPs)، سبب ميلها العفوي لإلقاء القبض عليه من قبل نظام شبكي، الهدف يمكن أن يكون إجراء هندسة عكسية لاستهداف السلبي إلى الضامة في فيفو، مما يسمح لتحسين الفعالية العلاجية مع الحد الأدنى من الآثار الجانبية8. وتشمل NPs الحالية استكشافها لإيصال جزيئات الحمض النووي الريبي نانوكاريرس غير العضوية والدهنية المختلفة والبوليمرات9. فيما بينها، بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد)، نوع من البوليمرات الموجبة قادرة على الربط والتكثيف الأحماض النووية إلى استقرار مصادر القدرة النووية، يظهر أعلى الجيش الملكي النيبالي تسليم9،قدرة10. برينس يحمي الأحماض النووية من تدهور الانزيمية ونونينزيماتيك ويتوسط نقلها عبر غشاء الخلية، ويعزز الإفراج عنهم داخل الخلايا. على الرغم من أن عرض في البداية ككاشف إيصال الحمض النووي، تجلى بي فيما بعد لتكون منصة جذابة في فيفو siRNA التسليم، أما محلياً أو عناصره9،10.
جسيمات نانوية أكسيد الحديد سوبيرباراماجنيتيك (سبيونس) وقد أظهرت وعدا كبيرا في الطب الحيوي، وسبب خصائص مغناطيسية، توافق مع الحياة، وحجم مماثلة إلى كائنات هامة بيولوجيا، وارتفاع نسبة مساحة السطح إلى حجم، ويمكن تكييفها بسهولة سطح بيواجينت المرفق11. على سبيل المثال، بسبب فائدتها المحتملة كعامل تباين وسرعة امتصاص الضامة، ظهرت سبيونس كأداة سريرية مفضلة لصورة الأنسجة الضامة12. بينما كما درست سبيونس على نطاق واسع الأحماض النووية تسليم المركبات11،13،14،15، على حد علمنا، الأدب يحتوي على عدد قليل من التقارير من سبيونس كناقل تسليم siRNA بلعم المستهدفة. لإيصال الجينات سبيونس، هي عادة مغلفة سطحها بطبقة من ماء البوليمرات الموجبة التي الأحماض النووية المشحونة سلبيا يمكن الكهربية الاستاتية جذبت والمربوطة. وهنا نقدم طريقة لتجميع سبيونس السطحية التي يتم تعديل مع منخفضة الوزن الجزيئي (كاتشين 10)، تشعبت بي (بي-سبيونس). ثم تستخدم هذه نانوبلاتفورمس المغناطيسي لاختصار siRNA، تشكيل مجمعات بي-جاسوس/siRNA تمكن siRNA النقل داخل الخلية. نحن السبب أن البلعمه عفوية من سبيونس من خلايا نظام شبكي16، مقترنة بقدرة قوية للربط والتكثيف الأحماض النووية بجزيرة الأمير إدوارد، يجعل بي--سبيونس مناسبة للنقل تتسم بالكفاءة ل siRNA في الضامة. دعم البيانات المقدمة هنا جدوى إسكات الجينات بي-جاسوس/siRNA-وساطة في الضامة في الثقافة، وكذلك في فيفو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
رعاية كافة الأساليب التي تشمل الحيوانات الحية وأجريت وفقا للحيوان واستخدام المبادئ التوجيهية لجامعة جنوب شرق الصين.
1-إعداد بي-سبيونس
-
إعداد تعديل لحمض الأولييك سبيونس
- حل فيكل3•6H2س وفيسو4•7H2س في الماء تحت حماية ن2.
- إضافة ز 28 فيكل3•6H2س و 20 غراما من فيسو4•7H2س إلى 80 مل مياه في كوب. إدخال N2 في المياه من خلال قناة زجاج ويقلب حتى قد حلت هذه المسألة الصلبة.
- حرارة الخليط رد فعل إلى 72 درجة مئوية بمعدل إثارة 800 لفة في الدقيقة، متبوعاً بالإضافة إلى 40 مل من الأمونيا المياه (28 في المائة). يحرك لمدة 5 دقائق.
- إضافة 9 مل حمض الأولييك دروبويسي إلى الحل المشار إليه أعلاه ويقلب عليه في 72 درجة مئوية ح 3.
- بارد الحل الناتج إلى درجة حرارة الغرفة (RT). يعجل بالحل عن طريق فصل المغناطيسية.
- أغسل متسرعا المحتوية على سبيونس 3 x مع الكحول الاثيلي المطلق وتفريق ثم، متسرعا في 100 مل الهكسين ن.
- حل فيكل3•6H2س وفيسو4•7H2س في الماء تحت حماية ن2.
-
إعداد تعديل لحمض ديميركابتوسوكسينيك سبيونس
- إضافة 800 ملغ حمض الأولييك (الزراعة العضوية)-تعديل سبيونس فرقت في 200 مل الهكسين ن، وفرَّقت 400 ملغ حمض ديميركابتوسوكسينيك (DMSA) في 200 مل الأسيتون، إلى قارورة ثلاثة-الرقبة في حمام مائي عند 60 درجة مئوية.
ملاحظة: لتحديد تركيز جاسوس تعديل الزراعة العضوية التي تم الحصول عليها من الخطوة السابقة، تأخذ كمية صغيرة (مثل 1 مل) من تشتت جاسوس وتطيير N-الهكسين، وتزن المسحوق الناتج. - إضافة 200 ميليلتر من إثيل دروبويسي إلى الحل المذكور أعلاه مع التحريك 1,000 لفة في الدقيقة وريفلوكسينج.
- بعد 5 ح للتحريك وريفلوكسينج، الحصول على ترسبات سوداء بالفصل المغناطيسي.
- تفريق سبيونس ماء في المياه البلوتينيوم بضبط الأس الهيدروجيني للحل باستخدام هيدروكسيد تيتراميثيلامونيوم.
- إضافة 800 ملغ حمض الأولييك (الزراعة العضوية)-تعديل سبيونس فرقت في 200 مل الهكسين ن، وفرَّقت 400 ملغ حمض ديميركابتوسوكسينيك (DMSA) في 200 مل الأسيتون، إلى قارورة ثلاثة-الرقبة في حمام مائي عند 60 درجة مئوية.
-
إعداد بي-سبيونس
- إضافة حل الغروية جاسوس تعديل DMSA dropwise إلى حل بي (كاتشين 10) في قارورة ثلاثة-الرقبة 500 مل تحت التحريك الميكانيكية 1,000 لفة في الدقيقة ح 2 (ثFe: ثبي = 1:3).
ملاحظة: التهمة وحجم سبيونس بي تختلف تبعاً لنسبة ثالحديد إلى دبليوبي. ثFe: ثبي نسبة 1:3 يمكن أن يكون نقطة انطلاق جيدة لتوليف بي--سبيونس مناسبة لإيصال siRNA. - إضافة حل الناتجة في أنبوب أولترافيلتراتيون بعد قطع وزن الجزيئي من 100 كاتشين ومحتوى من 15 مل؛ ثم الطرد المركزي في 5,400 س ز لمدة 10 دقيقة حتى يتم حل المتبقية 1 مل. إضافة المياه إلى الحل لجعل حجم 15 مل مرة أخرى وكرر العملية المذكورة أعلاه 10 x للحصول على المنتج النهائي. ثم قم بتصفية الحل من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وتخزين المنتج النهائي في 4 درجات مئوية.
- تحديد تركيز الحديد سبيونس بي بأن أسلوب قياس الألوان باستخدام فينانثروليني17. تمييع بي-سبيونس مع المياه المعقمة بتركيز 1 ملغ Fe/مل وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- تمييع 10 ميكروليتر من الحل بي-جاسوس (1 ملغم Fe/mL) إلى 1 مل بالمياه؛ ثم اختبار حجمها الهيدروديناميكي وزيتا المحتملة عن طريق جهاز نثر الضوء حيوي.
ملاحظة: إعداد سبيونس بي في المجموعة من حوالي 30-50 نانومتر. في هذا النطاق الحجم، لا تظهر أثر حجم NP على ربط siRNA وامتصاص الخلوية كبيرة. بي-سبيونس آخذا بإمكانيات زيتا متوسط أكثر من +37 أم يمكن أن تكون سامة في نطاق جرعة تعداء، وينبغي أن يقوم فحص سيتوتوكسيسيتي لضمان السلامة. يمكن التحكم بتهمة السطحية والحجم الهيدروديناميكي لجسيمات نانوية داخل نطاق المطلوب عن طريق ضبط محتوى بي.
- إضافة حل الغروية جاسوس تعديل DMSA dropwise إلى حل بي (كاتشين 10) في قارورة ثلاثة-الرقبة 500 مل تحت التحريك الميكانيكية 1,000 لفة في الدقيقة ح 2 (ثFe: ثبي = 1:3).
2-إعداد و [اغروس] هلام التفريد من NPs بي-جاسوس/siRNA
- SiRNA مخفف بالمياه خالية من رناسي تؤتي بتركيز نهائي من 20 ميكرومتر (0.26 ميكروغرام/ميكروليتر).
- إعداد خمس خالية رناسي ميكروسينتريفوجي الأنابيب المسماة 0، 1، 2، 4، و 8. التسميات تمثل نسب وزن الحديد: siRNA مختلفة. بيبيت 3 ميكروليتر حل siRNA لجميع الأنابيب (ميكروغرام ~0.8 siRNA/أنبوب).
- أضف 0، 0.8، 1.6، 3.2، والمسمى ميكروغرام 6.4 من الحديد في شكل بي-سبيونس للأنابيب 0، 1، 2، 4، و 8، على التوالي. إبقاء حجم العينة الإجمالية لكل أنبوب أقل من 20 ميكروليتر. المزيج بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
- احتضان الخلائط في RT لمدة 30 دقيقة للسماح بتشكيل بي-جاسوس/siRNA المعقدة. خلال هذه الفترة، جعل من 3% [اغروس] هلام مع [اغروس] عالية النقاء.
ملاحظة: يمكن إعداد مجمعات إضافية بي-جاسوس/siRNA مع نسب الحديد: siRNA أخرى (مثلاً، 5 أو 6) واختبارها. - إضافة ميكروليتر 1 من 6 × الحمض النووي-تحميل المخزن المؤقت كل عينة 5-ميكروليتر وتخلط بحذر. تحميل جميع العينات وتشغيل التفريد في الخامس 5/سم حتى الأزرق بروموفينول وترحيل قدر ثلثي طول الهلام. وصمة عار للهلام مع اثيديوم بروميد (المجلس التنفيذي) لمدة 15-20 دقيقة.
ملاحظة: ينبغي استخدام المخزن المؤقت التفريد الطازجة وحل المجلس التنفيذي. - تصور العصابات siRNA تحت الأشعة فوق البنفسجية نظام التصوير. التحقق من نسب الحديد: siRNA في فيها مجمعات أشكال siRNA مع بي--سبيونس، ونتيجة لذلك العصابات يمثلون siRNA الحرة المتخلفين أو لا يمكن كشفها.
3-تعداء من RAW264.7 الضامة في المختبر
- الثقافة الماوس مثل بلعم RAW264.7 الخلايا في طبق 10 سم باستخدام دميم إكمال المتوسطة التي تحتوي على 10% الجنين البقري المصل (FBS) كل 100 يو/مليلتر البنسلين كل 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5%.
- يوم واحد قبل تعداء، نضح المتوسطة من الخلايا وشطف لهم مع الفوسفات مخزنة المالحة (درجة الحموضة 7.4). أضف 1 مل من 0.25% التربسين للطبق 10 سم. تريبسينيزي الخلايا RAW264.7 لحوالي 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO 5%.
- عند فصل غالبية الخلايا (بعد 5-10 دقيقة)، إضافة 5 مل من دميم المتوسطة كاملة إلى الطبق لإلغاء تنشيط التربسين. بيبيت صعودا وهبوطاً لتفريق تجمعات الخلية إلى الخلايا المفردة.
- نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل عقيمة. الطرد المركزي أنه في 300 غرام x لمدة 3 دقائق في إزالة الرايت المادة طافية.
- ريسوسبيند الخلايا مع 5 مل من الطازجة المتوسطة كاملة دميم وحساب الخلايا.
- وكذلك في لوحة 6-جيدا مع 2 مل من إكمال دميم المتوسطة لوحة 9 × 104 خلايا كل احتضان عند 37 درجة مئوية في 5% CO2 حاضنة لحوالي 24 ساعة.
ملاحظة: إذا كان استخدام لوحة حجم مختلف، ضبط كثافة الخلية مطلي ما يتناسب مع المساحة السطحية النسبية حيث أن الخلايا تصل إلى 80% كونفلوينسي في وقت تعداء. - عندما تكون الخلية كونفلوينسي 80%، إزالة الوسيطة من الخلايا واستبدالها ب 1 مل من دميم المتوسطة كاملة كل بئر. العودة اللوحة إلى الحاضنة حتى مجمعات بي-جاسوس/siRNA وقد أعدت وجاهزة للاستعمال (حوالي 30 دقيقة).
- إعداد مجمعات بي-جاسوس/siRNA: حساب مقدار مجمعات بي-جاسوس/siRNA اللازمة لتجربة تعداء. في 1.5 مل خالية رناسي أنبوب ميكروسينتريفوجي، خلط مبلغ مناسب من سبيونس بي مع siRNA بنسبة معينة Fe: siRNA. على سبيل المثال، إضافة إلى إعداد NPs بي-جاسوس/siRNA التي تحتوي على 100 ميكروغرام من الحديد Fe: siRNA بنسبة 4، 100 ميليلتر (1 ملغم Fe/mL) من سبيونس بي إلى 96 ميكروليتر من siRNA (0.26 ميكروغرام/ميكروليتر)، متبوعاً بالمزج بلطف مع ميكروبيبيتي. احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
ملاحظة: إعداد حجم مجمع بي-جاسوس/siRNA هو 10% تزيد عن مجموع كتلة النهائية لحساب لأي خسائر عرضية. تجعل بي-جاسوس/siRNA المجمعات في نسب منخفضة Fe: siRNA، التي siRNA الجزيئات يتم تحميلها بالكامل على سبيونس بي و، وبالتالي، يمكن استخدام كميات صغيرة من سبيونس بي للتقليل من سيتوتوكسيسيتي المحتملة. تجارب رائدة (جل التخلف العقلي المقايسة) لتحسين نسبة الحديد: siRNA ضرورية. - إخراج لوحة 6-جيدا من الحاضنة (الخطوة 3، 7). إضافة وحدة تخزين مطلوب لمجمع بي-جاسوس/siRNA dropwise لكل بئر ودوامه اللوحة بحذر لضمان توزيع حتى. العودة اللوحة للحاضنة حتى تقييم الخلوية الامتصاص أو الجينات ضربة قاضية كفاءة (د 1-3).
ملاحظة: ترانسفيكتينج الضامة مع بي-جاسوس/siRNA بتركيز ~ 15 ميكروغرام Fe/mL قد تعظيم الكفاءة تعداء مع التقليل من سيتوتوكسيسيتي المحتملة.
4-منهجية تقديم siRNA إلى الضامة في الفئران "التهاب المفاصل التجريبية"
- الحصول على ويستار الذكور خالية من مسببات الأمراض المحددة التي 7 أسابيع من العمر. روض الفئران 7 د قبل الاستخدام، وتزويدهم بالغذاء الكافي والمياه. حمل التهاب المفاصل adjuvant (أإ) في الفئران كما هو موضح سابقا18.
- إعداد مجمعات بي-جاسوس/siRNA كما هو موضح في الخطوة 3، 8.
- حقن NPs بي-جاسوس/siRNA (0.3 ملغ siRNA/كغ) AA الفئران عن طريق الوريد الذيل. تقييم امتصاص الخلوية عن طريق، على سبيل المثال، التدفق الخلوي، الأنسجة بيوديستريبوشن عن طريق، على سبيل المثال، في الوقت الحقيقي fluorescence التصوير النظام، أو الآثار العلاجية على أساس، على سبيل المثال، سريرية ونسيجية والتصوير الإشعاعي وتشير التحليلات في الوقت المطلوب18.
ملاحظة: للدراسات بيوديستريبوتيون الخلايا والأنسجة وعلاج الفئران بحقنه واحدة من القدرة المطلوبة؛ الدراسات العلاجية، حقن الفئران بمصادر القدرة النووية أن يكون اختبار 1 x أسبوع لمدة ثلاثة أسابيع على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حجم وزيتا إمكانات بي-سبيونس أعد مع هذا البروتوكول كانت في حدود 29-48 نيوتن متر (polydispersity الفهرس: 0.12-0.23) والسيارات من 30-48، على التوالي. كانت مستقرة في الماء عند 4 درجة مئوية لأكثر من 12 شهرا دون تجميع واضحة. تقييم siRNA على ربط القدرة، كانت مختلطة بي-سبيونس مع siRNA في نسب وزن الحديد: siRNA مختلف. ويبين الشكل 1 أن عندما تصل نسبة وزن الحديد: siRNA 4 وما فوقها، فرقة siRNA مجاناً تماما في عداد المفقودين، يعني ملزمة siRNA الناجحة إلى سبيونس بي. هو مصدر قلق كبير لجزيرة الأمير إدوارد في التطبيقات الطبية الحيوية سميته، الذي نتيجة لهذه التهمة إيجابية قوية، ولا سيما في الأوزان الجزيئية العالية وجرعات عالية. كما هو مبين في الشكل 2 أ، بي-سبيونس مع زيتا المحتملة للا يحمل mV 30.5 و 37 سيتوتوكسيسيتي الظاهر بتركيزات تصل إلى 30 ميكروغرام Fe/مل، هي عبارة عن شقين أعلى من التركيز (15 ميكروغرام Fe/mL) تستخدم عادة تعداء الخلايا. ومع ذلك، سبيونس بي مع احتمال زيتا من 48 أم كانت سامة حتى في أدنى جرعة درست (10 ميكروغرام Fe/mL). ولذلك، تمتلك بي-سبيونس سمية تعتمد على التهمة. وبتهمة الموجبة ليست مهمة لاستيعاب NP الضامة19، فإننا نقترح أن بي-سبيونس مع بإمكانيات زيتا متوسط لا يزيد عن +37 أم تستخدم لنقل siRNA، على الرغم من أن الربط siRNA من شأنه أن يقلل هذا الاتهام إلى حد ما و تخفيف سيتوتوكسيسيتي18.
لاختبار إمكانية تطبيق بي-سبيونس للتسليم siRNA إلى الضامة، أنجز تعداء في المختبر مع خط خلية سنخية مورين 264.7 الخام. كما حلل بالتدفق الخلوي، تم transfected أكثر من 90% الخلايا مع مجمعات بي-جاسوس/siRNA المسمى فلوريسسينتلي في 15 ميكروغرام Fe/مليلتر (الشكل 2). فيما يتعلق بكفاءة تعداء، لم يكن هناك فعلا فرق بين NPs بي-جاسوس/siRNA شكلت في نسب وزن الحديد: siRNA من 4 و 8، وعلى الرغم من تحت الشرط الأخير، كانت مصادر القدرة النووية التي شكلت أصغر حجماً وأضعف في مقابل الإيجابية لأنه تم تحميله بمقدار أقل من siRNA كل الجسيمات. نحن أيضا بتقييم أثر بي-جاسوس/siRNA التركيز على استيعاب الخلوية تلطيخ الأزرق البروسي. كما هو مبين في الشكل 2، كانت بقع زرقاء داخل خلايا transfected الحد الأدنى لا يمكن اكتشافها في 7.5 ميكروغرام Fe/مل، لكن مرئية بوضوح في 15 ميكروغرام Fe/مل. من المثير للاهتمام، زيادة تركيز بي-جاسوس/siRNA إلى 32 ميكروغرام Fe/مل لم يزد كثافات المصبوغة، ربما لأن استيعاب بي-جاسوس/siRNA كان مشبعة بتركيزات حوالي 15 ميكروغرام Fe/مل. وباﻹضافة إلى ذلك، أكد قدرة بي-سبيونس للتوسط في نقل siRNA في الابتدائي الضامة18، والطريقة المعروضة هنا كان من كفاءة تعداء siRNA عالية في الفئران الضامة البريتوني، يعادل في RAW264.7 الخلايا. الضامة البريتوني transfected مع بي-سبيونس إيواء محددة siRNA وأظهرت انخفاضا كبيرا في مستوى الهدف مرناً بالمقارنة مع siRNA غير محدد (الشكل 2D)، مما يعني أن siRNA يمكن الهروب من الحويصلات الالتقام إلى السيتوبلازم والوصول الآلية [رني].
سابقا أننا أيضا التحقيق في فيفو الخلوية استيعاب مجمعات بي-جاسوس/siRNA النظامية التي تدار في الفئران التهاب المفاصل adjuvant18. قمنا بتحليل كفاءة تعداء بي-جاسوس/siRNA في الضامة متجولة والخلايا الليمفاوية T نونفاجوسيتيك. كما هو موضح في الشكل 3، أخذت CD11b + الخلايا حتى مجمعات بي-جاسوس/siRNA أكثر كفاءة من CD3 + الخلايا في أي وقت في جميع أجهزة فحص، مما يشير إلى أن NPs بي-جاسوس/siRNA الهدف تفضيلي الضامة18. جدير بالذكر أن لوحظ تراكم رفيع المستوى مصادر القدرة النووية في المفاصل الملتهبة18، مما يوحي بأن بي-جاسوس يمكن أن تكون منصة جذابة لإيصال siRNA المداواة في التهاب المفاصل المرضية التي ترتبط بمنهجية بلعم الخلل الوظيفي والإدارة التي siRNA المحلية ليس اختيار المفضل بسبب تورط أجهزة متعددة لهذا المرض.
رقم 1: [اغروس] هلام التفريد مجمعات بي-جاسوس/siRNA تشكلت في مختلف Fe: siRNA (w/w) نسب. ويمثل نسبة الحديد: siRNA 0 الدوبلكس siRNA الحرة دون سبيونس بي. وكان متوسط حجم وإمكانات زيتا سبيونس بي الحرة المستخدمة هنا 30 نانومتر و 45 mV. siRNA تماما ويمكن ربط بي-سبيونس عندما تصل نسبة الحديد: siRNA 4 وما فوقها، يتسق مع النتائج السابقة باستخدام بي-سبيونس مع متوسط بحجم 48 شمال البحر الأبيض المتوسط واحتمال زيتا 30.5 أم18. قد يعكس عدم وجود عصابات المتخلفين (مجمعات بي-جاسوس/siRNA) صعوبة الوصول إلى siRNA إلى المجلس التنفيذي خلال تلطيخ، مؤشرا على ربط siRNA قوية، و/أو قدرة التكثيف سبيونس بي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: توصيف البيولوجية بي-جاسوس ولأمان بي-جاسوس/siRNA. (أ) هذا الفريق يظهر مقايسة بقاء خلية. تم علاج الخلايا 264.7 الخام ح 16 مع جرعات بي-سبيونس تحمل إمكانات زيتا المختلفة المشار إليها، وبعد ذلك، أجريت فحص النظام التجاري المتعدد الأطراف. وكان تطبيع بقاء الخلية ضد عنصر التحكم (لا التعرض للجسيمات). البيانات هي ± يعني SD الآبار مكررة. (ب) هذا الفريق يظهر تحليل تدفق سيتوميتريك لاستيعاب بي-جاسوس/Cy3-siRNA من الخلايا 264.7 الخام. كانت الخلايا المحتضنة ح 24 مع 15 ميكروغرام Fe/مليلتر (اللوحة العلوية) أو 5 ميكروغرام Fe/مليلتر (أسفل اللوحة) من بي-سبيونس الرصاصية مع siRNA المسمى Cy3 بنسبة (w/w) Fe: siRNA 4 و 8، على التوالي. ويمثل غير محددة (NC) siRNA siRNA الفلورية غير–. M2: بوابات المنطقة؛ Cy3 pe-h: كثافة الأسفار. كفاءة تعداء siRNA بي-سبيونس المستخدمة هنا (37.8 نانومتر، 48 mV) مماثلة لدراسة سابقة باستخدام بي-سبيونس مع متوسط بحجم 48 شمال البحر الأبيض المتوسط واحتمال زيتا 30.5 أم18. (ج) هذا الفريق يبين تحليل لامتصاص بي-جاسوس/siRNA حسب تصور رواسب الحديد الخلوية. كانت المحتضنة الخلايا 264.7 الخام مع 7.5 و 15 و 32 ميكروغرام Fe/مل بي-سبيونس (48 شمال البحر الأبيض المتوسط، 30.5 mV) الرصاصية مع siRNA (Fe: siRNA = 8) والملون باللون الأزرق البروسي. أشرطة مقياس 20 ميكرومتر. (د) يظهر هذا الفريق في المختبر التحقق من كفاءة إسكات siRNA ألقاه سبيونس بي. فأر محددة تستهدف siRNA إيل-2-15 مستقبلات β سلسلة تم تحميلها على سبيونس بي (48 شمال البحر الأبيض المتوسط، 30.5 mV) في الحديد: siRNA = 8، وثم ترانسفيكتيد في الفئران الضامة البريتوني. SiRNA NC كعنصر التحكم. كان تقييم الجين إسكات تأثير PCR الكمي. كانت الخلايا المحتضنة مع المجمعات في 15 ميكروغرام Fe/مل. البيانات هي ± يعني SD ثلاث آبار. وقد تم تعديل لوحة د من دوان et al. 18 بإذن من الناشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: في فيفو امتصاص الخلوية من NPs بي-جاسوس/siRNA. تم حقن الفئران التهاب المفاصل الثلاثة عن طريق الوريد مع جرعة واحدة من 0.3 مغ/كغ Cy3-siRNA صياغتها مع بي-جاسوس (48 شمال البحر الأبيض المتوسط، 30.5 mV). واستخدمت كعنصر تحكم الفئران حقن مع برنامج تلفزيوني. وجمعت في 2 و 8 و 24 ساعة بعد الحقن الدم، والطحال، والكبد والكلى والتهاب المفاصل. تم تقييم استيعاب الخلوية NPs بي-جاسوس/Cy3-siRNA بالتدفق الخلوي استخدام المضادة-CD3 (A) و (ب) الأجسام المضادة CD11b المضادة. النسب المئوية لامتصاص Cy3-siRNA داخل بوابة CD3 + أو CD11b + الخلايا. النتائج المعروضة هنا هي الممثل لتجربتين مستقلة. وقد تم تعديل هذا الرقم من دوان et al. 18 بإذن من الناشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الضامة الصهر ترانسفيكت بنهج فاجيناليس شائعة الاستخدام، مثل انهانسر والدهنية الأيوني، وأنواع الدهن. هنا وصفت لنا طريقة موثوقة وفعالة ترانسفيكت الضامة مع siRNA. باستخدام هذا البروتوكول، ما يزيد على 90% من مثل بلعم 264.7 الخام الخلايا (الشكل 2B) والفئران الضامة البريتوني18 يمكن أن تكون transfected مع siRNA دون إعاقة كبيرة لبقاء الخلية. يعتمد هذا الأسلوب على منصة التسليم بي-جاسوس، الذي هو nanocarrier تتألف من مجموعة أساسية أكسيد الحديد وقذيفة من بي. لذا، الخطوة الرئيسية الأولى للبروتوكول هو تجميع بي--سبيونس مناسبة لإيصال siRNA. عادة، المغلفة بجزيرة الأمير إدوارد سبيونس وتعد من سبيونس المغلفة بحمض الأولييك أسلوب تبادل يجند فيها حمض الأولييك مباشرة تبادل من سطح سبيونس بي أو المشتقات15، توليد مصادر ماء مع إيجابيا يحمل السطح. في الحالة المعروضة هنا، تم استبدال حمض الأولييك توج على سطح سبيونس بحمض ديميركابتوسوكسينيك للذوبان في الماء، ومن ثم بي تم تحميلها على السطوح جاسوس من خلال التفاعل الالكتروستاتيكي. هذا الأسلوب لطيف وسهلة التحضير بكميات كبيرة، ولأمان تجميعي الاستقرار ممتازة في المياه20. فمن المعروف جيدا أن برينس السامة للخلايا، والسمية يرتبط بقوة بأن الوزن الجزيئي21. لضمان السلامة، هو أحد الاعتبارات هامة عند توليف بي-سبيونس أن هذه الجسيمات هي مغلفة بالوزن الجزيئي المنخفض برينس، الذي كاتشين 10 في هذا البروتوكول. التأثير السمي غير مرغوب فيها لجزيرة الأمير إدوارد هو أساسا بوساطة من الشحن الإيجابية؛ ولذلك، قياس إمكانات زيتا سبيونس بي ضروري، والقيمة التي لا ينبغي أن تكون أعلى من 37 mV. ويمكن تحقيق انخفاض رسوم الإيجابية ببساطة عن طريق تقليل محتوى بي. آخر خطوة حاسمة لنجاح تطبيق هذا النظام تسليم siRNA هي الأمثل لنسبة الحديد: siRNA من جل التخلف العقلي. يبدو من المعقول جعل مجمعات بي-جاسوس/siRNA في نسب منخفضة من الحديد: siRNA تحت أي siRNA الجزيئات لا تزال قادرة على الربط إلى سبيونس بي. في هذه الظروف، يمكن استخدام كميات صغيرة من سبيونس بي، وبالتالي التقليل إلى أدنى حد لها سيتوتوكسيسيتي المحتملة.
في حال لم ينتج الكفاءة المنشودة إسكات أو التأثير العلاجي، التحقق من كفاءة تعداء بالتدفق الخلوي أو الأسفار مجهرية استخدام الناقل محملة siRNA مسمى فلوريسسينتلي. وبدلاً من ذلك، يمكن دراسة استيعاب بي-جاسوس/siRNA تلطيخ الأزرق البروسي التقليدية، وهي حساسة بما يكفي للكشف عن حبيبات واحد من الحديد في الخلايا. إذا كانت كفاءة تعداء منخفضة في الواقع، فإنه قد يلزم لتحسين ظروف تعداء مثل كثافة الخلية والوقت تعداء والجرعة من الجسيمات بي-جاسوس/siRNA. عدد مرور الخلايا يمكن أن تؤثر أيضا على الكفاءة من تعداء22. في معظم الحالات، هو لا تأثير إسكات غير كافية الناجمة امتصاص بي-جاسوس/siRNA غير كافية، كما برهنت بي-جاسوس النظام الحالي لتسهيل نقل siRNA فعالة إلى الضامة. في بعض الأحيان، يمكن الجمع بين عدة سيرناس استهداف الجين نفسه استراتيجية جيدة لتعزيز كفاءة ضربة قاضية. جدير بالذكر أن، على الرغم من أن [رني] يحدث عادة خلال 24 ساعة تعداء، بداية ومدة لإسكات الجينات تعتمد على معدل الدوران للهدف ومعدل تمييع وطول عمر siRNA وحتى تركيز المصل في الأجل المتوسط. وهكذا، وقت دورة التجارب قد تكون ضرورية لدقة تحديد نقطة تأثير القصوى2،22مرة. للتطبيق في فيفو ، الفعالية العلاجية ويعتمد أيضا على ما إذا كان ينبغي، وإلى أي مدى يسهم الهدف siRNA تعمل المرض؛ وهكذا، اختيار هدفا siRNA المناسبة حاسم بالنسبة للنتائج المتوقعة.
وهناك العديد من المزايا لهذا البروتوكول لتقديم siRNA الضامة. (1) الطريقة سهلة لتنفيذ وهي طريقة رخيصة لإنتاج سبيونس بي بكميات كبيرة، ومصادر القدرة النووية المنتجة مستقرة في الماء لأكثر من 12 شهرا إذا كان يتم الاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية. (2) البلعمه عفوية من سبيونس التي الضامة يسهل عملية نقل siRNA بي-جاسوس-بوساطة فعالة، نتج عنه تعداء عالية الكفاءة. ومن المتوقع أن إلى جانب الخلايا 264.7 الخام والضامة البريتوني الجرذ، هذا النهج المنطبق على أخرى خطوط الخلايا بلعم والضامة الأولية، طالما الجرعة تعداء الأمثل. (3) siRNA تعداء سريعة وسهلة لإجراء مقارنة مع الأساليب تعداء بلعم الأخرى مثل نوكليوفيكشن، التي تستغرق وقتاً طويلاً ويتطلب جهاز نوكليوفيكتور2. (4) بي-جاسوس يمكن أن تكون وسيلة مثالية لإيصال استهدفت بلعم siRNA النظامية في بعض نماذج المرض. الضامة تلعب أدواراً حاسمة في تنمية وتطور مختلف الاضطرابات المزمنة التحريضية، فضلا عن الأورام؛ وميزة النسيجي بارز واحد من هذه الأمراض الأوعية الدموية الشاذة مع البطانة راشح. ومن ثم، بسبب زيادة نفاذية وأثر الاحتفاظ، تدار النظامية NPs محملة بالمخدرات تميل إلى التراكم في الأنسجة المريضة وسهولة يتم التقاطها بالضامة المحلية، مما يؤدي إلى تعزيز خصوصية، تخفيض الآثار الجانبية، وتحسين الفعالية العلاجية. في نموذج الفئران من التهاب المفاصل adjuvant، حقن الوريد بي-جاسوس/siRNA مجمعات تناولها ~ 40 ٪ الخلايا CD11b + خلال 24 ساعة الأولى بعد الحقن18. وفي المقابل، عندما استخدمت الحويصلية الموجبة كناقل لتسليم siRNA النظمية في الفئران، أقل من 5% الخلايا CD11b + في المفاصل التهاب المفاصل أكمنة ليبوبليكسيس siRNA23. وعلاوة على ذلك، نظراً لخواصها المغناطيسية، تطبيق حقل مغناطيسي خارجي قد كذلك تسهيل تراكم مجمعات بي-جاسوس/siRNA في الأنسجة المستهدفة وزيادة الإقبال على الهاتف الخلوي. الجدير بالذكر أيضا أن هذه NPs محملة siRNA يمكن استخدامها ليس فقط لتحوير وظيفة بلعم ولكن أيضا للتصوير بلعم لتوفير معلومات التشخيص، ورصد فعالية العلاج، والتنبؤ بالنتائج السريرية المرضى12.
ومع ذلك، توجد القيود المرتبطة بهذا البروتوكول. نظام بي-جاسوس معارض مجموعة ضيقة من الجرعة لتسليم siRNA. حدث استيعاب الحد الأقصى عند تعرض الخلايا RAW264.7 إلى جزيرة الأمير إدوارد-جاسوس/سيرناس بتركيز 15 ميكروغرام Fe/مليلتر (الشكل 2 و 2 ج). زيادة تركيز بي-جاسوس/siRNA إلى 32 ميكروغرام Fe/مل لم تسفر عن زيادة في امتصاص الخلوية (الشكل 2)، بل على العكس من ذلك، قد يؤدي إلى زيادة مخاطر استحثاث موت الخلايا بسبب جوهري سمية بي. من ناحية أخرى، تتناقص بي-جاسوس/siRNA إلى 5 أو 7.5 ميكروغرام Fe مليلتر من الواضح أن خفض في امتصاص الخلايا RAW264.7 (الشكل 2 و 2 ج). وهكذا، فإننا نقترح أن تركز بي-جاسوس/siRNA الأمثل في المختبر تعداء بلعم هو ~ 15 ميكروغرام Fe/مليلتر (التركيز النهائي في بئر). هو قيد آخر يجب أن يؤخذ في الاعتبار أثر بي-سبيونس المحتملة على نشاط بلعم. جسيمات نانوية قد يحرض الاستجابة المناعية24، تبعاً لتعديل السطح، وتهمة السطحية، وحجمها، والشكل، وحتى على المنهجية المستخدمة في تجميع لهم. آرياس مولينس et al. ذكرت مؤخرا أن سبيونس المغلفة بجزيرة الأمير إدوارد يؤدي التنشيط بلعم25. طريقة توليف بي-جاسوس المعروضة هنا يختلف كثيرا عن أن آرياس مولينس et al.، وما إذا كان إعداد سبيونس بي استناداً إلى ذلك، على الزناد البروتوكول الحالي تفعيل بلعم ينتظر المزيد من التحقيق. ومع ذلك، لا لبس فيه معالجة هذا القلق، نقترح، بالإضافة إلى الرصاصية مع siRNA التدافع، المركبة نفسها (بي-جاسوس فقط) بي-جاسوس يمكن أن تخدم كعنصر تحكم آخر عند استخدام هذا البروتوكول. وأخيراً، أن هذا البروتوكول ليست مناسبة لإيصال الحمض النووي نظراً لحجمه الكبير نسبيا.
وباختصار، قدمنا هنا طريقة استخدام سبيونس المغلفة بالمقاطعة كوسيلة تعداء siRNA في الضامة. هذه القدرة يمكن أن كفاءة تسليم siRNA في خطوط الخلايا بلعم مخلدة، وكذلك في الضامة الأولية في المختبر، ووظيفيا الحث على إسكات الجينات دون التأثير على بقاء الخلية في الجرعة المثلى تعداء. وعلاوة على ذلك، بي-سبيونس قد تستعمل في فيفو siRNA تسليم الضامة، مما يجعل من الممكن للصورة، كما تعدل، الضامة الخلل الوظيفي الذي يساهم في التنمية والتقدم للعديد من الاضطرابات المزمنة التحريضية و أنواع السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وكان يؤيد هذا العمل "مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية" (81772308) و "البحوث الرئيسية الوطنية" و "برنامج التنمية في الصين" (رقم 2017YFA0205502).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , Springer. 123-143 (2009).
- Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).
- Davignon, J. -L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
- Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
- Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).
- Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
- Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).
- Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).
- Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
- Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
- Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
- Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
- Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
- Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
- Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
- Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).
- Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
- Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).
- Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
- Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
- Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).
