Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Polyethyleneimine kaplı demir oksit nano tanecikleri küçük müdahale RNA makrofajlar için teslim için bir araç olarak Vitro ve In Vivo

Published: February 5, 2019 doi: 10.3791/58660
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 2, 2, 1
1Key Laboratory of Ministry of Education for Developmental Genes & Human Diseases, Institute of Life Sciences and School of Medicine, Southeast University, 2State Key Laboratory of Bioelectronics, Jiangsu Key Laboratory for Biomaterials & Devices, School of Biological Science & Medical Engineering, Southeast University
* These authors contributed equally

Summary

Biz polyethyleneimine (PEI) kullanarak bir yöntemi açıklamak-kaplı superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri siRNA ile transfecting makrofajlar için. Bu nano tanecikleri siRNA makrofajlar vitro ve in vivo ve sessizlik hedef gen ekspresyonu için verimli bir şekilde teslim edebilirsiniz.

Abstract

Bağışıklık yanıtı düzenlenmesinde önemli rolleri nedeniyle makrofajlar sürekli yoğun araştırma konu oldu ve otoimmün hastalıkları, ateroskleroz ve kanser gibi birçok hastalıklarda umut verici bir terapötik hedef temsil eder. RNAi aracılı gen susturmak yoklama ve makrofaj işlevi değiştirmek için seçim değerli bir yaklaşımdır; Ancak, makrofajlar siRNA ile transfection kez teknik olarak zor olabilir kabul edilir ve, makrofajlar siRNA aktarmak için adanmış birkaç metodolojileri mevcuttur. Burada, polyethyleneimine kaplı superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri (PEI-SPIONs) siRNA makrofajlar için hedeflenen teslim için bir araç olarak kullanarak bir iletişim kuralı mevcut. PEI-SPIONs bağlama ve Fe: siRNA ağırlık oranı 4 ulaştığında tamamen siRNA Yoğuşmalı ve üzeri yeteneğine sahiptirler. Vitro, bu nano tanecikleri verimli siRNA birincil makrofajlar içine yanı sıra olmadan ödün hücre canlılık transfection için en uygun doz, makrofaj gibi ham 264.7 hücre kültürünü içine teslim edebilir ve sonuçta, onlar neden siRNA aracılı hedef gen susturmak. Vitro siRNA transfection için kullanılan dışında PEI-SPIONs da siRNA makrofajlar içinde vivoiçin teslim etmek için umut verici bir araç vardır. İçinde görüş-in kombine özellikleri manyetik özelliği ve gen susturmak yeteneği, sistemik yönetilen PEI-casus/siRNA parçacıklar sadece makrofaj işlevi modüle için aynı zamanda yansıma ve izlenen makrofajlar etkinleştirmek için bekleniyor. Özünde, bir basit, güvenli ve etkili nonviral platform siRNA teslim edilmek üzere makrofajlar PEI-SPIONs temsil vitro ve içinde vivo.

Introduction

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık hücreleri tüm vücut dokuları içinde dağıtılmış bir türü farklı miktarlarda da olsa vardır. Çeşitli sitokinlerin ve diğer arabulucu üreterek, onlar mikrobiyal patojenler istila karşı ana savunma, yaralanma takip doku onarımı ve doku homeostazı1korumada önemli rol oynarlar. Önemleri nedeniyle makrofajlar sürekli yoğun araştırma konu oldu. Ancak, gen düzenlemesi ve işlev çalışmalar yaygınlık rağmen gen siRNA aracılı susturmak için makrofajlar başarılı olasılığı daha düşüktür bu hücreler — özellikle, birincil makrofajlar — çoğu kez transfect zor. Bu hücre zarı olan kimyasal olarak en köklü transfection yaklaşımlar ile ilişkili toksisite (Örneğin, polimerler ve lipidler) nispeten yüksek derecede atfedilen veya fiziksel olarak (Örneğin, Elektroporasyon tarafından ve Böylece büyük ölçüde azaltarak makrofajlar canlılığı2,3membran çapraz siRNA molekülleri izin gen silah) bozulur. Ayrıca, makrofajlar adanmış fagositler degradative enzimler zengin vardır. Bu enzimler siRNA, gene özgü siRNA hücre3,4teslim olsa bile silencing verimlilik zayıflaması bütünlüğünü zarar verebilir. Bu nedenle, bir etkili makrofaj hedefli siRNA teslim sistem bütünlüğü ve istikrarı siRNA teslim4sırasında korumak gerekiyor.

Disfonksiyonel makrofajlar başlatma ve otoimmün hastalıkları, ateroskleroz ve kanser gibi bazı ortak klinik bozukluklar ilerlemesini karıştığı giderek belirgin olduğu. Bu nedenle makrofaj işlevini kullanarak, örneğin, siRNA, oransal, bu bozuklukları5,6,7tedavisi için çekici bir metodoloji olarak ortaya çıkan olmuştur. Ne kadar çok ilerleme yaptı, sistemik yönetilen siRNA ve sonuç olarak istenmeyen yan etkilere neden makrofajlar tarafından yetersiz siRNA alımını zavallı hücre özgüllük siRNA dayalı tedavi stratejisinin büyük bir sorun olduğunu. Genellikle optimum hücre seçicilik eksikliği ve sık sık hedef kapalı yan etkiler, ilaç dolu nano tanecikleri (NPs), retiküloendotelyal sistem tarafından yakalanan spontan onların eğilimi nedeniyle yol ücretsiz nükleik asit tedavi ile karşılaştırıldığında, makrofajlar vivo içindebırakmak için en az yan etkileri8ile geliştirilmiş tedavi edici etkinliği, pasif hedefleme için tasarlanmış. Geçerli NPs RNA molekülleri teslimi için araştırdı inorganik nanocarriers, çeşitli lipozomlar ve polimerler9içerir. Bunlar arasında kapasitesi9,10teslim etmek yüksek RNA polyethyleneimine (PEI), Katyonik Polimerler bağlama ve nükleik asitler stabilize NPs yoğuşmalı yeteneğine sahip bir türünü gösterir. PEI nükleik asitler enzimatik ve nonenzymatic bozulma korur, transfer hücre zarı arasında aracılık eder ve onların hücre içi serbest teşvik etmektedir. Her ne kadar başlangıçta bir DNA teslim reaktifi tanıttı, PEI daha sonra vivo içinde siRNA teslimi, ya yerel olarak veya sistemik9,10çekici bir platform olacak şekilde gösterilmiştir.

Superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri (SPIONs) içinde biyomedikal, kendi manyetik özellikleri, biyouyumluluk, biyolojik olarak önemli nesnelerine, yüksek hacim için yüzey alanı oranı, karşılaştırılabilir boyutu nedeniyle büyük söz göstermiştir ve kolayca uyarlanabilir yüzey düşündüğümüzden Eki11. Örneğin, bir kontrast Ajan ve makrofajlar tarafından hızlı alımı olarak onların potansiyel yarar nedeniyle, SPIONs bir favori klinik araç görüntü doku makrofajlar12olarak ortaya çıkmıştır. SPIONs da yaygın nükleik asit teslimat Araçlar11,13,14,-15, bizim bilgi olarak incelenmiştir iken edebiyat bir taşıyıcı olarak SPIONs birkaç raporları içerir makrofaj hedefli siRNA teslim. SPIONs tarafından gen teslim için onların yüzey genellikle üzerine olumsuz ücret nükleik asitler elektrostatik çekti kaşif balonlu keşif ve hidrofilik Katyonik Polimerler bir tabaka ile kaplanır. Burada, SPIONs olan yüzey düşük moleküler ağırlıklı ile (10 kDa), dallı PEI (PEI-SPIONs) değiştirilir sentezleme yöntemi mevcut. Bu manyetik nanoplatforms sonra siRNA, hücre içine siRNA taşıma etkinleştirmek PEI-casus/siRNA kompleksleri şekillendirme yoğunlaşmak için istihdam edilmektedir. Retiküloendotelyal sistem16hücreleri tarafından SPIONs o kendiliğinden fagositoz nedeni, bağlama güçlü yeteneği ile birleştiğinde ve nükleik asitler tarafından PEI, yoğuşmalı PEI-SPIONs siRNA etkin taşıma için uygun işler makrofajlar. Burada sunulan veri PEI-casus/siRNA-aracılı gen kültür hem de vivo içindemakrofajlar içinde yalıtım fizibilite destekler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntemleri içeren canlı hayvan hayvan uygun olarak gerçekleştirilen bakım ve Güneydoğu Üniversitesi, Çin'in yönergeleri kullanın.

1. hazırlanması PEI-SPIONs

  1. Oleik asit-modified SPIONs hazırlanması
    1. FeCl3•6H2O ve FeSO4•7H2O N2koruması altında suda çözülür.
      1. FeCl3•6H2O 28 g ve 20 g FeSO4•7H2O 80 mL deiyonize su içine bir ölçek ekleyin. N2 cam boru ile su içine tanıtmak ve katı maddenin eriyene kadar karıştırın.
      2. 72 ° C de 800 devir/dakika, buna ek olarak 40 mL Amonyak su (% 28) tarafından takip, coşkulu bir oranda tepki karışıma ısı. 5 dakika karıştırın.
    2. Oleik asit 9 mL dropwise yukarıda belirtilen çözüm içine ekleyin ve 3 h için 72 ° C'de karıştırın.
    3. Oda sıcaklığında (RT) elde edilen çözüm ne yapıyorsun? Manyetik ayırma çözüm yolu ile çökelti.
    4. SPIONs 3 içeren çökelti yıkama x mutlak etil alkol ile ve o zaman, 100 ml N-hekzan çökelti dağıttı.
  2. Dimercaptosuccinic asit-modified SPIONs hazırlanması
    1. Oleik asit (OA) 800 mg eklemek-SPIONs 200 mL N-hekzan dağınık değiştiren ve dimercaptosuccinic asit (DMSA) 400 mg 60 ° C'de bir su banyosu bir üç-boyun şişesi içine 200 mL aseton, dağınık
      Not: OA-modified casus önceki adımda elde konsantrasyonu belirlemek için küçük hacimli (örneğin 1 mL) casus dispersiyon, N-hekzan volatilize tutup elde edilen toz tartmak.
    2. Trietilamin 200 µL dropwise 1000 devir / dakikada karıştırma ve refluxing ile yukarıda belirtilen çözüm içine ekleyin.
    3. Karıştırma ve refluxing 5 h sonra siyah bir çökelti manyetik ayırma tarafından elde etmek.
    4. Deiyonize su hidrofilik SPIONs homojen tetramethylammonium hidroksit kullanarak çözüm pH ayarlayarak dağıtmak.
  3. PEI-SPIONs hazırlanması
    1. DMSA-modified casus kolloidal çözüm dropwise PEI çözümde bir 500 mL üç-boyun şişesi için 2 h 1000 devirde mekanik karıştırma altında (10 kDa) içine ekleyin (WFe: WPEI = 1:3).
      Not: Şarj ve boyutunu PEI-SPIONs W WPEIFe oranı bağlı olarak değişiklik gösterebilir. WFe: 1:3 oranında WPEI PEI-SPIONs siRNA teslim edilmek üzere uygun sentezleme için iyi bir başlangıç noktası olabilir.
    2. Sonuç çözüm 100 kDa bir molekül ağırlığı kesme ve 15 mL bir içeriğe sahip bir Ultrafiltrasyon tüp içine ekleyin; sonra kalan çözüm 1 mL kadar 10 dk santrifüj 5400 x g de. Deiyonize su hacmi 15 mL tekrar yapmak ve yukarıdaki adımları tekrarlayın 10 ekleyin x nihai ürün elde etmek için. O zaman, çözüm 0,22-mikron filtre ile filtre ve nihai ürün 4 ° C'de depolayın
    3. PEI-SPIONs Fe konsantrasyon tarafından pH17kullanarak kolorimetrik yöntemi belirleyin. PEI-SPIONs konsantrasyonu 1 mg Fe/mL deiyonize steril suyla seyreltik ve 4 ° C'de saklayın
    4. 10 μL PEI-casus çözüm (1 mg Fe/mL) 1 ml deiyonize suyla seyreltik; hidrodinamik büyüklüğü ve zeta potansiyel tarafından dinamik bir ışık saçılım aygıtı sınayın.
      Not: PEI-SPIONs hakkında aralığında hazırlamak 30-50 nm. Bu boyut aralığında, NP boyutu siRNA bağlama ve hücresel alımını yaptığı etkisi anlamlı görünmüyor. PEI-SPIONs bir ortalama zeta potansiyeli üzerinde 37 derece taşıyan mV-ebilmek var olmak zehirli transfection doz aralığında ve sitotoksisite tahlil güvenliğini sağlamak için yapılmalıdır. Yüzey ücret ve hidrodinamik nano tanecikleri boyutunu istediğiniz aralığı içinde PEI içeriği ayarlayarak denetlenebilir.

2. hazırlık ve özel jel elektroforez PEI-casus/siRNA NPS'nin

  1. SiRNA suyla 20 mikron (0,26 μg/μL) son bir konsantrasyon vermeye RNase free sulandırmak.
  2. 0, 1, 2, 4 ve 8 etiketli beş RNase free microcentrifuge tüpleri hazırlayın. Etiketleri farklı Fe: siRNA ağırlık oranları temsil eder. Damlalıklı 3 μL siRNA çözüm için tüm tüpler (siRNA/tüp ~0.8 μg).
  3. 0, 0.8, 1.6, 3.2 ve Fe 6.4 μg PEI-SPIONs şeklinde 0, 1, 2, 4 ve 8, sırasıyla etiketli tüpler ekleyin. Her tüpün toplam örnek hacmi 20'den az μL tutun. Yavaşça yukarı ve aşağı pipetting karıştırın.
  4. RT 30 dk için PEI-casus/siRNA karmaşık oluşumu izin vermek için karışımları kuluçkaya. Bu dönemde, yüksek saflıkta özel ile jel % 3 özel olun.
    Not: Ek PEI-casus/siRNA kompleksleri (Örneğin, 5 veya 6) diğer Fe: siRNA oranları ile hazırlanan ve test.
  5. 6 x 5 μL örnek başına DNA-yükleme arabellek 1 μL ve dikkatli bir şekilde karıştırın. Tüm örneklerini yüklemek ve bromophenol mavi üçte bildiğim kadarıyla jel uzunluğu geçirir kadar 5 V/cm Elektroforez çalıştırmak. Jel etidyum bromür (EB) 15-20 dk ile leke.
    Not: Taze hazırlanmış Elektroforez tamponu ve EB çözüm kullanılmalıdır.
  6. SiRNA bantları bir UV görüntüleme sistemi altında görselleştirin. Hangi siRNA formları kompleksleri PEI-SPIONs ile Fe: siRNA oranlarıyla kontrol ve sonuç olarak, ücretsiz siRNA temsil eden grup geri zekalı ya da değil tespit.

3. RAW264.7 makrofajlar Vitro transfection

  1. Kültür fare makrofaj gibi RAW264.7 hücre DMEM kullanarak bir 10 cm tabak içinde orta içeren % 10 fetal Sığır serum (FBS) başına % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 100 μg/mL streptomisin başına 100 U/mL penisilin tamamlayın.
  2. Bir gün önce transfection, orta hücrelerden Aspire edin ve fosfat tamponlu tuz (pH 7,4) ile yıka. 1 mL % 0.25 tripsin 10 cm yemek için ekleyin. RAW264.7 hücreler için yaklaşık 5-10 dk 37 ° c % 5 CO2 kuluçka trypsinize.
  3. Hücreleri çoğunluğu (5-10 dakika sonra) bağlantısız, 5 mL DMEM tam orta tripsin devre dışı bırakabilirsiniz için yemek için ekleyin. Damlalıklı yukarı ve aşağı tek hücrelere hücre kümeleri dağıtmak için.
  4. Hücre süspansiyon steril bir 15 mL konik tüp aktarın. Bu 300 x g RT. Kaldır, 3 dk de süpernatant santrifüj kapasitesi.
  5. 5 mL taze DMEM tam orta de içeren hücreleri resuspend ve hücreleri saymak.
  6. Plaka 9 x 104 hücre başına bir 6-şey plaka tam DMEM Orta 2 mL ile iyi ve % 5 CO2 kuluçka için yaklaşık 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: böylece hücrelerin % 80 confluency transfection anda ulaşmak farklı bir boyutta bir tabak kullanıyorsanız, kaplama hücre yoğunluğu göreli yüzey alanı ile orantılı olarak ayarlayın.
  7. Hücre confluency % 80 olduğunda, orta hücrelerdeki kaldırmak ve 1 mL de başına DMEM tam orta yerine. PEI-casus/siRNA kompleksleri hazırlanmıştır ve (yaklaşık 30 dk) kullanıma hazır kadar plaka da kuluçka için dönmek.
  8. PEI-casus/siRNA kompleksleri hazırlamak: bir transfection deneme için gerekli PEI-casus/siRNA kompleksleri miktarını hesaplamak. Bir 1.5 mL RNase free microcentrifuge tüp içinde belirli Fe: siRNA oranında siRNA PEI-SPIONs uygun bir miktarda karıştırın. Örneğin, Fe 100 µg / 4 Fe: siRNA oranında içeren PEI-casus/siRNA NPs hazırlamak için 100 eklemek için siRNA (0,26 μg/μL), 96 μL PEI-SPIONs (1 mg Fe/mL) µL takip bir micropipette ile hafifçe karıştırarak. 30 dk RT. az için kuluçkaya
    Not: bir birim arızi zararlar için hesap son toplam ayine aşan % 10 PEI-casus/siRNA kompleks hazırlayın. PEI-casus/siRNA kompleksleri hangi siRNA molekülleri tamamen PEI-SPIONs yüklenir ve bu nedenle, PEI-SPIONs az miktarda potansiyel sitotoksisite en aza indirmek için kullanılabilir düşük Fe: siRNA oranlarıyla olun. Pilot deneyler (jel retardasyon tahlil) Fe: siRNA oranı optimizasyonu için gereklidir.
  9. İnkübatör (adım 3.7) 6-şey plaka çıkarmak. Gerekli birim PEI-casus/siRNA kompleks dropwise her şey için ekleme ve ihtiyatlı bir hatta dağıtım sağlamak için plaka girdap. Plaka da kuluçka için hücresel alımı veya gen devirme verimliliği (1-3 d) değerlendirme kadar dönün.
    Not: ~ 15 μg Fe/mL bir konsantrasyon, PEI-casus/siRNA ile Transfecting makrofajlar potansiyel sitotoksisite en aza indirerek transfection verimliliği maksimize etmek.

4. sistemik siRNA teslim makrofajlar sıçanlarda deneysel artrit ile

  1. 7 haftalık özel patojen-Alerjik erkek Wistar rats edinin. 7 kullanılmadan önce d sıçanlara alıştırmak ve yeterli yiyecek ve su ile sağlamak. Adjuvan artrit (AA) yukarıda açıklanan18fareler neden.
  2. 3.8. adımda açıklandığı gibi PEI-casus/siRNA kompleksleri hazırlayın.
  3. PEI-casus/siRNA NPs (0.3 mg siRNA/kg) AA fareler ile kuyruk ven enjekte et. Hücresel alımı yolu ileÖrneğin, akış sitometresi, doku biodistribution ileÖrneğin, gerçek zamanlı bir floresan görüntüleme sistemi, değerlendirmek veya tedavi edici etkileri, örneğin, klinik, histolojik ve radyografik dayalı olarak istenen zamanda analizleri18puan.
    Not: istediğiniz NPs tek bir enjeksiyon farelerle hücresel ve doku biodistribution araştırmaları için tedavi; terapötik çalışmaları için test edilmiş 1 haftada üç ardışık hafta x olarak NPs ile fareler enjekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Boyutu ve zeta potansiyel PEI-SPIONs bu iletişim kuralı ile hazırlanan edildi 29-48 nm aralığında (polydispersity Dizin: 0,12 - 0,23) ve 30-48 mV, anılan sıraya göre. Onlar için 12 ay boyunca açık toplama olmadan su 4 ° C'de kararlı idi. Yetenek bağlama onların siRNA değerlendirmek için PEI-SPIONs siRNA, çeşitli Fe: siRNA ağırlık oranları ile karıştırıldı. Şekil 1 gösterir Fe: siRNA ağırlık oranı 4 ulaştığında ve yukarıda, ücretsiz siRNA grup tamamen eksik, PEI-SPIONs başarılı siRNA bağlama ima. PEI önemli bir endişe Biyomedikal uygulamasında bir sonucu olarak güçlü pozitif, özellikle yüksek moleküler ağırlık ve yüksek dozlarda onun zehirlenmesi var. 30,5 ve 37 mV Şekil 2A, PEI-SPIONs ile bir zeta potansiyel gösterildiği gibi belirgin sitotoksisite kadar 30 μg yaklaşık iki kat daha yüksek konsantrasyon (15 μg Fe/mL) normal hücre transfection için kullanılan Fe/mL konsantrasyonlarda sergi değil. Ancak, PEI-SPIONs 48 bir zeta potansiyeli ile mV muayene bile en düşük doz (10 μg Fe/mL) toksik. Bu nedenle, PEI-SPIONs şarj bağlı toksisite sahip. Katyonik ücreti makrofajlar19tarafından NP alımı için önemli değildir beri öneririz PEI-SPIONs 37 derece değil daha yüksek bir ortalama zeta potansiyeli olan mV siRNA bağlama bir ölçüde giderlerini azaltmak, ancak siRNA transferi için kullanılır ve sitotoksisite18hafifletmek.

PEI-SPIONs potansiyel uygulama siRNA teslim edilmek üzere makrofajlar sınamak için vitro transfection fare makrofaj hücre kültürünü ham 264.7 ile gerçekleştirildi. Akış Sitometresi tarafından analiz gibi hücreleri fazla % 90 15 µg Fe/mL (Şekil 2B) adlı fluorescently etiketli PEI-casus/siRNA kompleksleri ile transfected. Transfection verimliliği ile ilgili olarak, aslında ikinci koşul altında kuruldu NPs olumlu yetkinin daha küçük ve zayıf olmasına rağmen 4 ve 8, Fe: siRNA oranları ağırlık oluşan PEI-casus/siRNA NPs arasında hiçbir fark yoktu Çünkü daha az miktarda siRNA parçacık yüklendi. Ayrıca hücresel içselleştirilmesi PEI-casus/siRNA konsantrasyon etkisi Prusya mavi boyama tarafından değerlendirildi. Şekil 2Ciçinde gösterildiği gibi transfected hücrelerin içindeki mavi noktalar en az 7,5 µg Fe/mL, ama 15 µg Fe/mL, açıkça görülebilir, tespit edildi. PEI-casus/siRNA alımını etrafında 15 µg Fe/mL konsantrasyonlarda doymuş çünkü İlginçtir, PEI-casus/siRNA konsantrasyon 32 µg Fe/mL için artan boyama yoğunluklarını, muhtemelen artmamıştır. Buna ek olarak, PEI-SPIONs yeteneği siRNA transfer arabuluculuk için birincil makrofajlar18' doğruladı ve fare peritoneal makrofajlar, içinde RAW264.7 için eşdeğer bir yüksek siRNA transfection verimliliği yöntemi burada sunulan vardı hücreleri. O siRNA endositoz veziküller kaçış ima ile PEI-SPIONs belirli siRNA hedef mRNA düzey nonspesifik siRNA (Şekil 2B), ile karşılaştırıldığında önemli bir azalma gösterdi yataklık transfected periton makrofajlar sitoplazma ve reach RNAi makine.

Biz daha önce sistemik yönetilen PEI-casus/siRNA kompleksleri ile adjuvan artrit18sıçanlarda vivo içinde hücresel alımını da araştırdık. PEI-casus/siRNA transfection verimliliği fagositik makrofajlar ve nonphagocytic T lenfositler analiz ettik. Şekil 3' te gösterildiği gibi CD11b + hücre PEI-casus/siRNA kompleksleri kadar hücrelerin CD3 + tüm organları incelenir, PEI-casus/siRNA NPs tercihen makrofajlar18hedef gösteren herhangi bir zaman noktasında daha verimli bir şekilde aldı. Özellikle, iltihaplı eklem18PEI-casus siRNA therapeutics kimin Patogenez bağlandığı Romatoid Artritte sistemik teslim etmek için çekici bir platform olabilir düşündüren, NPs üst düzey bir birikimi gözlenmiştir makrofaj disfonksiyon ve hangi yerel siRNA için yönetim hastalığın birden fazla organ tutulumu nedeniyle en sevdiğim bir seçim değil.

Figure 1
Şekil 1: özel jel elektroforez PEI-casus/siRNA kompleksleri, çeşitli Fe: siRNA (w/w) oranlarıyla kurdu. Fe: siRNA oranı 0 ücretsiz siRNA Dubleks PEI-SPIONS olmadan temsil eder. Burada kullanılan ücretsiz PEI SPIONs zeta potansiyeli ve ortalama boyutu 30 vardı nm ve 45 mV. siRNA-tamamen bağlamak PEI-SPIONs için Fe: siRNA oranı 4 ulaştığında ve yukarıda, PEI-SPIONs 48 ortalama büyüklüğü ile kullanarak önceki sonuçları ile tutarlı nm ve zeta potansiyel 30,5 mV18. Geri zekalı bantları (PEI-casus/siRNA kompleksleri) yokluğu siRNA EB için erişilememesi boyama sırasında güçlü siRNA bağlama belirtisi ve/veya PEI-SPIONs yoğuşmalı yeteneğini yansıtıyor olabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: PEI-casus ve PEI-casus/siRNA NPs biyolojik karakterizasyonu. (A) Bu panel bir hücre canlılığı tahlil gösterir. HAM 264.7 hücreleri PEI-SPIONs farklı zeta potansiyeli taşıyan belirtilen dozlarda 16 h için tedavi edildi ve daha sonra bir MTS tahlil gerçekleştirildi. Hücre canlılığı kontrol (parçacık maruz kalma) karşı normalleştirilmiş. Yinelenen wells ortalama ± SD verilerdir. (B) Bu panel PEI-casus/Cy3-siRNA alımını ham 264.7 hücreleri tarafından akış sitometrik analizini gösterir. Hücreleri 15 µg Fe/mL (üst paneli) veya 5 μg Fe/mL (alt paneli) PEI-SPIONs complexed ile Cy3 etiketli siRNA 4 ve 8, Fe: siRNA (w/w) oranında 24 h için sırasıyla inkübe. Ettiren (NC) siRNA sigara-floresan siRNA temsil eder. M2: bölge geçişli; PE-H: Cy3 floresan yoğunluğu. PEI-SPIONs burada kullanılan siRNA transfection verimliliğini (37.8 nm, 48 mV) PEI-SPIONs 48 ortalama büyüklüğü ile kullanarak bir önceki çalışma benzerdi nm ve zeta potansiyel 30,5 mV18. (C) Bu panel hücresel demir görselleştirme tarafından PEI-casus/siRNA alımını analizini gösterir. HAM 264.7 hücreleri 7.5, 15 ve 32 μg Fe/mL PEI-SPIONs ile inkübe (48 nm, 30.5 mV) siRNA ile complexed (Fe: siRNA = 8) ve Prusya Mavisi tarafından lekeli. Ölçek barlar 20 mikron vardır. (D) Bu panel PEI-SPIONs tarafından teslim siRNA silencing verimliliğini vitro doğrulanmasını gösterir. Belirli siRNA hedefleme sıçan IL-2 /-15 reseptör β zinciri PEI-SPIONs yüklenen (48 nm, 30.5 mV) Fe: siRNA 8 = ve sonra fare peritoneal makrofajlar transfected. Bir NC siRNA denetimi olarak kullanıldı. Etkisi susturmak gen kantitatif PCR tarafından değerlendirildi. Hücreleri 15 μg Fe/mL, kompleksleri ile inkübe. İneklemek wells ortalama ± SD verilerdir. Panel D Duan vd değiştirildi 18 yayıncının izni ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: In vivo hücresel alımını PEI-casus/siRNA NPs. Üç artritik fareler enjekte intravenöz 0.3 mg/kg Cy3-siRNA formüle PEI-casus ile tek bir doz ile (48 nm, 30.5 mV). PBS ile enjekte bir sıçan bir denetim olarak kullanıldı. Kan, dalak, karaciğer, böbrek ve iltihaplı eklem 2, 8 ve 24 h sonra enjeksiyon toplanmıştır. PEI-casus/Cy3-siRNA NPs hücresel alımını anti-CD3(a)ve (B) anti-CD11b monoklonal antikorları kullanarak akış sitometresi tarafından değerlendirildi. Cy3-siRNA Alım geçişli CD3 + veya CD11b + hücre içinde yüzdelerdir. Burada gösterilen iki bağımsız deney temsilcisi sonuçlarıdır. Bu rakam Duan vd değiştirildi 18 yayıncının izni ile. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Makrofajlar çoğalmasıyla, katyonik lipozomlar ve lipid türler gibi yaygın olarak kullanılan nonviral yaklaşımlarla transfect ateşe dayanıklı. Burada makrofajlar siRNA ile transfect için güvenilir ve etkin bir yöntem açıklanmıştır. Mevcut iletişim kuralını kullanarak, fazla makrofaj gibi ham 264.7 hücreleri (Şekil 2B) ve fare peritoneal makrofajlar%18 90 siRNA önemli hücre canlılığı bozulma olmadan ile transfected. Bu yöntem bir nanocarrier oluşan bir çekirdek demir oksit ve PEI bir kabuk teslim platformda PEI-casus, bağlı. Protokolü'nün önemli bir ilk adım PEI-SPIONs siRNA teslim edilmek üzere uygun sentezi demek. Genellikle, PEI kaplı SPIONs oleik asit kaplı SPIONs tarafından hangi oleik asit doğrudan SPIONs yüzeyinden PEI veya onun türevleri15, tarafından değiştirilen bir ligand-değişimi yöntemi ile pozitif yüklü hidrofilik NPs üreten hazırlanır yüzey. Burada sunulan durumda, SPIONs yüzeyinde şapkalı oleik asit suda çözünen dimercaptosuccinic asit tarafından değiştirildi ve sonra PEI casus yüzeyler elektrostatik etkileşimler yoluyla üzerine yüklendi. Bu yöntem nazik ve büyük miktarlarda hazırlamak kolay ve sentezlenmiş NPS'ye mükemmel istikrar su20dakika sonra sahip. PEI sitotoksik ve toksisite kuvvetle onun molekül ağırlığı21ile karşılıklı olarak ilişkilendirir iyi bilinmektedir. Güvenliğini sağlamak için an önemli dikkat ne zaman PEI-SPIONs sentezleme bu parçacıklar bu protokolündeki 10 kDa olan düşük moleküler ağırlıklı PEI ile kaplanmıştır. PEI istenmeyen toksik etkisi çoğunlukla olumlu býrakýldýðýnda tarafından aracılık ettiği; Bu nedenle, PEI-SPIONs zeta potansiyeli ölçümü önemlidir ve değeri 37 daha yüksek olmamalı mV. Pozitif şarj bir düşüş sadece PEI içerik azaltarak elde edilebilir. Bu siRNA iletim sistemi başarılı uygulanması için başka bir önemli adım jel retardasyon tarafından Fe: siRNA oranı optimizasyonu olduğunu. Düşük Fe: siRNA oranları altında hangi siRNA molekülleri hala PEI-SPIONs bağlama yeteneğine sahiptirler, PEI-casus/siRNA kompleksleri yapmak makul görünüyor. Bu durumda, PEI-SPIONs az miktarda, böylece onun potansiyel sitotoksisite en aza indirerek kullanabilirsiniz.

-Dibi takdirde istenilen verimi susturmak veya tedavi etkisi üretilen değil, transfection verimliliği akış sitometresi veya floresan mikroskobu ile fluorescently etiketli bir siRNA yüklü taşıyıcı ile kontrol edin. Alternatif olarak, PEI-casus/siRNA alımını geleneksel Prusya mavi boyama tarafından hücrelerinde demir tek granül algılamaya hassas olduğu incelenebilir. Transfection verimliliği gerçekten düşük ise, hücre yoğunluğu, transfection zaman ve PEI-casus/siRNA parçacıklar doz gibi transfection koşulları en iyi duruma getirmek için gerekebilir. Hücre geçit numarasını da transfection22verimliliğini etkileyebilir. Mevcut sistemin PEI-casus makrofajlar etkili siRNA aktarmak kolaylaştırmak için gösterildiği gibi çoğu zaman yetersiz bir PEI-casus/siRNA alımı tarafından yetersiz silencing efekt neden değildir. Bazen, birkaç çift aynı gen hedefleme birleştirerek devirme verimliliği artırmak için iyi bir strateji olabilir. RNAi genellikle transfection içinde 24 h oluşmakla birlikte, başlangıçlı ve gen damping süresi devir hızı hedef, seyreltme oranı ve uzun ömürlü siRNA, hatta orta serum konsantrasyonu bağlı, çekicidir. Böylece, deneyler doğru maksimal etkisi2,22saat noktası belirlemek için gerekli olabilir ders zamanı. Vivo uygulama için tedavi edici etkinliği de kaydedilip üzerinde bağlıdır ve ne ölçüde, siRNA hedef hastalığı fenotipleri için katkıda bulunur; Böylece, bir uygun siRNA hedef seçimi için beklenen sonuçları önemlidir.

Bu protokol siRNA makrofajlar için teslim etmek için çeşitli yararları vardır. (1 yöntemi gerçekleştirmek kolay ve PEI-SPIONs büyük miktarlarda üretmek için ucuz bir yoldur ve 4 ° C'de tutulursa üretilen NPs 12 ay boyunca suda istikrarlı (2) SPIONs spontan fagositoz makrofajlar tarafından yüksek transfection verimliliği kaynaklanan bir etkili PEI-casus-aracılı siRNA aktarma kolaylaştırır. Bu doz transfection için en iyi duruma getirilmiş sürece ham 264.7 hücreleri ve fare peritoneal makrofajlar yanı sıra, bu yaklaşım diğer makrofaj hücre satırları ve birincil makrofajlar, uygulanabilir olduğunu bekleniyor. (3) siRNA transfection hızlı ve kolay yapmak zaman alır ve bir Nucleofector aygıt2gerektirir nucleofection gibi diğer makrofaj transfection yöntemleri ile karşılaştırıldığında. (4) PEI-casus belli hastalık modelleri sistemik siRNA makrofaj hedefli teslimi için ideal bir araç olabilir. Makrofajlar gelişme ve ilerleme çeşitli kronik enflamatuar bozuklukları yanı sıra tümör kritik rol oynar; ve bu hastalıklara dikkat çekici histolojik özelliklerinden biri sızan endotel ile anormal kan damarları. Bu nedenle, gelişmiş geçirgenliği ve tutma etkisi nedeniyle sistemik yönetilen uyuşturucu yüklü NPs hastalıklı dokularda birikir eğilimindedir ve kolayca yerel makrofajlar tarafından geliştirilmiş özgüllük önde gelen yakalanır, yan etkileri azaltılmış ve iyileştirilmiş tedavi edici etkinliği. Adjuvan artrit bir sıçan modelinde, intravenöz enjekte PEI-casus/siRNA kompleksleri ~ 40 oranında CD11b + hücre sırasında ilk 24 saat sonra enjeksiyon18kapladığı. Buna ek olarak, katyonik lipozom farelerde sistemik siRNA teslimat için bir taşıyıcı olarak kullanıldığında, romatizmalı eklem CD11b + hücrelerde % 5'den az siRNA lipoplexes23entrapped. Ayrıca, manyetik özellikleri sayesinde, uygulama, dış bir manyetik alanın daha fazla PEI-casus/siRNA kompleksleri hedef dokulara birikimi kolaylaştırmak ve onların hücresel alımını artırmak. Ayrıca böyle siRNA yüklü NPs makrofaj işlevi oransal için hem de görüntüleme makrofaj için tanı bilgilerini, monitör tedavi etkinliği sağlamak için kullanılabilir ve hastaların klinik sonuçlar12tahmin dikkat çekicidir.

Ancak, bu iletişim kuralı ile ilgili sınırlamalar bulunmaktadır. PEI-casus sistem dozaj siRNA teslimat için dar bir dizi sergiler. RAW264.7 hücreleri 15 µg Fe/mL (Şekil 2B ve 2 C) bir konsantrasyon PEI - için casus/çift sinin en fazla alımı oluştu. PEI-casus/siRNA konsantrasyon Fe/mL hücresel alımı (Şekil 2C) bir artış sonuçlanmamıştır ancak aksine, hücre ölümü PEI içsel toksisite nedeniyle inducing riskini artırabilir 32 µg için artan. Öte yandan, PEI-casus/siRNA 5 veya 7.5 µg azalan Fe/mL belli ki onun alımını RAW264.7 hücreleri (Şekil 2B ve 2 C) tarafından sınırlı. Böylece, önerdiğimiz vitro makrofaj transfection için en uygun PEI-casus/siRNA yoğunlaşması ~ 15 µg Fe/mL (bir de final konsantrasyon) olduğunu. Göz önüne alınması gereken başka bir olası etkisi PEI-SPIONs makrofaj aktivitesi kısıtlamadır. Nano tanecikleri bağışıklık yanıtı24, hatta onları sentezlemek için kullanılan metodoloji ve yüzey modifikasyonu, yüzey ücret, büyüklük, şekil bağlı neden olabilir. Mulens-Arias ve ark. son zamanlarda PEI kaplı SPIONs makrofaj harekete geçirmek25tetiklemek bildirdi. Burada sunulan PEI-casus sentez yöntemi önemli ölçüde Mulens Arias ve ark.şirketinkinden ve bu nedenle, mevcut Protokolü tetiğe dayalı olup PEI-SPIONs hazırlanan makrofaj aktivasyon bekliyor daha fazla araştırma. Ancak, belirsizliğe yer bırakmadan bu endişe adrese, PEI-casus ile mücâdele siRNA, araç kendisi (sadece PEI-casus) complexed yanı sıra öneririz başka bir denetimi olarak mevcut protokolü kullanılırken hizmet edebilir. Son olarak, bu iletişim kuralı için DNA teslimat nispeten büyük boyutu nedeniyle uygun değildir.

Özetle, biz burada PEI kaplı SPIONs makrofajlar siRNA transfection için bir araç olarak kullanarak bir yöntem sundu. Bu NPs siRNA ölümsüzleştirdi makrofaj hücre hatları içine yanı sıra birincil makrofajlar vitroiçine verimli bir şekilde teslim etmek ve işlevsel olarak transfection için en uygun doz, hücre canlılığı etkilemeden gen susturmak teşvik. Ayrıca, PEI-SPIONs vivo siRNA teslim edilmek üzere makrofajlar, resim, sağlayarak kullanılabilir yanı sıra modüle, kimin disfonksiyon katkıda geliştirme ve birçok kronik enflamatuar bozuklukları ilerlemesini makrofajlar ve kanser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81772308) ve ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı of China (No. 2017YFA0205502) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco C11995500BT Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum Gibco A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml) Gibco 15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit Promega G3582 For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China TCM13
Tissue culture plates (6-well) Corning 3516
Tissue culture dishes (10 cm) Corning 430167
RNase-free tubes (1.5 ml) AXYGEN MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml) Corning 430791
Trypsin Gibco 25200-056
Wistar rats Shanghai Experimental Animal Center of Chinese
Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder National
Institutes for Food and Drug Control, China		 for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa) Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. E107079
Ammonia water Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. A112077
Oleic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. O108484
Dimethylsulfoxide Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D103272
FeSO4•7H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012118
FeCl3•6H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011918
Dimercaptosuccinic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D107254
ultrafiltration tube Millipore UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. T100882
Particle size and zeta potential analyzer Malvern, England Nano ZS90

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).
  2. Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
  3. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , Springer. 123-143 (2009).
  4. Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).
  5. Davignon, J. -L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
  6. Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
  7. Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).
  8. Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
  9. Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  10. Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).
  11. Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
  12. Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).
  13. Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
  14. Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
  15. Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
  16. Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
  17. Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
  18. Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
  19. Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
  20. Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).
  21. Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
  22. Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).
  23. Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
  24. Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
  25. Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).

Tags

Tıp sayı: 144 makrofaj transfection nanopartikül siRNA teslim polyethyleneimine araç gen susturmak
Polyethyleneimine kaplı demir oksit nano tanecikleri küçük müdahale RNA makrofajlar için teslim için bir araç olarak <em>Vitro</em> ve <em>In Vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jia, N., Wu, H., Duan, J., Wei, C.,… More

Jia, N., Wu, H., Duan, J., Wei, C., Wang, K., Zhang , Y., Mao, X. Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (144), e58660, doi:10.3791/58660 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter