Summary
אנו מתארים שיטה של שימוש polyethyleneimine (פיי)-מצופה חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי עבור מקרופאגים transfecting עם siRNA. חלקיקים אלה יכולים להעביר ביעילות siRNA מקרופאגים במבחנה , ויוו , שתיקה ביטוי גנים היעד.
Abstract
בגלל תפקידם קריטי בוויסות תגובות חיסוניות, מקרופאגים ברציפות כבר הנושא של מחקר אינטנסיבי ומייצגות מטרה טיפולית מבטיחה בהפרעות רבות, כגון מחלות אוטואימוניות, טרשת עורקים, סרטן. מציאה RNAi בתיווך ג'ין להחרשת היא גישה יקר של בחירה כדי לחקור ולטפל מקרופאג פונקציה; עם זאת, תרביות תאים של מקרופאגים עם siRNA נחשב לעתים קרובות להיות מאתגר מבחינה טכנית,, בזמן הנוכחי, כמה מתודולוגיות המוקדש את העברת siRNA מקרופאגים הינם זמינים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול של שימוש חלקיקי תחמוצת ברזל מצופה polyethyleneimine פאראמגנטי (פיי-SPIONs) כרכב למסירה יישוב של siRNA מקרופאגים. פיי-SPIONs מסוגלים של האיגוד לבין לחלוטין עיבוי siRNA כאשר היחס בין משקל Fe: siRNA מגיע 4 ומעלה. במבחנה, חלקיקים אלה יכול ביעילות לספק siRNA לתוך מקרופאגים הראשי, כמו גם לתוך הקו תא 264.7 גלם כמו macrophage, מבלי להתפשר על הכדאיות תא למינון האופטימלי עבור תרביות תאים, ו, בסופו של דבר, הם זירוז היעד בתיווך siRNA ג'ין להחרשת. מלבד בשימוש עבור במבחנה siRNA תרביות תאים, פיי-SPIONs הם גם כלי מבטיח להעברת siRNA מקרופאגים ויוו. לאור התכונות שלו משולב של המאפיין מגנטי ויכולת ג'ין להחרשת, חלקיקים פיי-SPION/siRNA מערכתית בניהול צפויים לא רק כדי לווסת את הפונקציה macrophage, אלא גם כדי לאפשר מקרופאגים עם תמונה ולהיות במעקב. בעיקרו של דבר, פיי-SPIONs מייצגים פלטפורמה nonviral פשוט, בטוח ויעיל למסירה siRNA המקרופאגים גם במבחנה וגם בתוך vivo.
Introduction
המקרופאגים הם סוג של תאים חיסוניים מולדת מופץ בכל רקמות הגוף, אם כי בכמויות שונות. על ידי ייצור מגוון רחב של ציטוקינים ומתווכים, הם ממלאים תפקידים חיוניים ההגנה מארח נגד הפולשים חיידקים פתוגנים, תיקון רקמות בעקבות פגיעה, בשמירה על הומאוסטזיס הרקמה1. בשל חשיבותם, מקרופאגים ברציפות כבר הנושא של מחקר אינטנסיבי. עם זאת, למרות השכיחות שלה הכונה ולימודים פונקציה, בתיווך siRNA ג'ין להחרשת סביר פחות להצליח מקרופאגים כי תאים אלה — במיוחד, מקרופאגים הראשי — הם לעתים קרובות קשה transfect. זה יכול להיות מיוחסות רמה גבוהה יחסית של רעילות הקשורים ביותר ומבוססת תקנים גישות שבו הוא קרום התא מבחינה כימית (למשל, עם פולימרים ושומנים) או פיזית (למשל, על ידי אלקטרופורציה ו ג'ין רובים) משובשות לתת מולקולות siRNA חוצה הממברנה, ובכך באופן דרסטי הפחתת של מקרופאגים הכדאיות2,3. יתר על כן, המקרופאגים הם עשירים degradative אנזימים ייעודי phagocytes. אנזימים אלה יכול להזיק לתקינות של siRNA, היחלשות ביעילותה שתיקה גם אם גנים ספציפיים siRNA נמסרה לתוך התא3,4. לכן, מערכת משלוח siRNA ממוקדות מקרופאג יעיל צריך להגן את תקינות והיציבות של siRNA במהלך משלוח4.
זה ברור יותר ויותר כי מקרופאגים לקוי הם מעורבים החניכה, התקדמות של הפרעות מסוימות קליניים נפוצים כמו מחלות אוטואימוניות, טרשת עורקים, סרטן. מסיבה זו, להתכוונן מקרופאג פונקציה עם, למשל, siRNA, יש כבר מתעוררים כמו מתודולוגיה אטרקטיבי לטיפול אלה הפרעות5,6,7. למרות התקדמות רבה נעשתה, האתגר העיקרי של הטיפול מבוססת siRNA האסטרטגיה היא יחודיות תא המסכן של siRNA מערכתית בניהול, תפיסה siRNA לא מספיקות על ידי מקרופאגים, אשר כתוצאה מכך להוביל לתופעות לוואי לא רצויות. לעומת הרפוי חומצת גרעין חינם בדרך כלל חוסר תא אופטימלית סלקטיביות, לעיתים קרובות להוביל תופעות לוואי, טעון-סמים חלקיקים (NPs), בשל שלהם נטיה ספונטנית של בשבי על ידי מערכת reticuloendothelial, את המטרה . ניתן לתכנן עבור מיקוד פסיבי מקרופאגים ויוו, המאפשר שיפור יעילות טיפולית עם תופעות לוואי מינימליות8 NPs הנוכחי חקר למסירה של מולקולות RNA כוללים nanocarriers אורגניים, ליפוזומים שונים פולימרים9. ביניהם, polyethyleneimine (פיי), סוג של יכולת של איגוד וכן עיבוי חומצות גרעין לתוך NPs מיוצב, cationic פולימרים מציג את הרנ א הגבוהה אספקת קיבולת9,10. פיי מגן חומצות גרעין השפלה אנזימטיות, nonenzymatic, ומתווך העברה שלהם על פני קרום התא, ומקדם שחרורם תאיים. אמנם בתחילה הציג ריאגנט משלוח ה-DNA, פיי הודגם לאחר מכן להיות פלטפורמה מושכת ויוו siRNA משלוח, או באופן מקומי או מערכתית9,10.
חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי (SPIONs) הראו הבטחה גדולה וההתערבות, בשל שלהם תכונות מגנטיות, כימי, גודל דומה אובייקטים חשובים מבחינה ביולוגית, יחס פני-שטח-כדי-נפח גבוה, וניתנת להתאמה בקלות השטח עבור הקובץ המצורף גורם המחלה. אלים11. למשל, בשל פוטנציאל ניגוד הסוכן, ספיגה מהירה על ידי מקרופאגים, SPIONs הופיעו ככלי קליני האהוב תמונה רקמה מקרופאגים12. בעוד SPIONs גם נחקרו בהרחבה חומצת גרעין משלוח רכב11,13,14,15, לידע שלנו, הספרות מכיל כמה דיווחים SPIONs כנשא של משלוח, ממוקדות מקרופאג siRNA. למסירה גן מאת SPIONs, פני השטח שלהם בדרך כלל מצופה בשכבה של פולימרים cationic הידרופילית שעליו חומצות גרעין טעונים שלילית יכול להיות electrostatically נמשכת ולא קשורה. כאן, אנו מציגים את שיטת סינתזה SPIONs של מי פני השטח משתנה עם נמוך משקל מולקולרי (10 kDa), מסועף פיי (פיי-SPIONs). אלה nanoplatforms מגנטי מועסקים ואז לתמצת siRNA, הקמת מתחמי פיי-SPION/siRNA המאפשרים תחבורה siRNA לתוך התא. אנחנו הסיבה הזאת phagocytosis ספונטנית של SPIONs על ידי תאים המערכת reticuloendothelial16, בשילוב עם יכולת חזקה של האיגוד, עיבוי חומצות גרעין על ידי פיי, למתאימה פיי-SPIONs תעבורה יעילה של siRNA לתוך מקרופאגים. הנתונים המוצגים כאן לתמוך את הכדאיות של פיי-SPION/siRNA-מתווכת ג'ין להחרשת ב מקרופאגים תרבות וכן ויוו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות מעורבים בעלי חיים בוצעו על פי החיה רבה ושימוש להנחיות של אוניברסיטת דרום-מזרח, סין.
1. הכנת פיי-SPIONs
-
הכנת SPIONs חומצה אולאית-השתנה
- להמיס FeCl3•6H2O ו מכל4•7H2O במים תחת ההגנה של N2.
- להוסיף 28 גרם של FeCl3•6H2O ו- 20 גר' מכל4•7H2O לתוך 80 מ של מים יונים גביע. להציג את N2 לתוך המים דרך צינור זכוכית ומערבבים עד פיזר חומר מוצק.
- מחממים את התערובת תגובה 72 ° C בקצב מלהיב של 800 סל ד, ואחריו תוספת של 40 מ ל מים אמוניה (28%). מערבבים במשך 5 דקות.
- מוסיפים 9 מ ל חומצה אולאית dropwise לתוך הפתרון הנ ל ומערבבים אותו ב-72 מעלות במשך 3 שעות.
- מגניב הפתרון שיתקבל לטמפרטורת החדר (RT). לזרז פתרון באמצעות הפרדה מגנטית.
- לשטוף את התמיסה המכילה SPIONs 3 x עם ספירט אתיל מוחלט, ואז לפזר את התמיסה ב- 100 מ של N-הקסאן.
- להמיס FeCl3•6H2O ו מכל4•7H2O במים תחת ההגנה של N2.
-
הכנת dimercaptosuccinic חומצה-השתנה SPIONs
- להוסיף 800 מ ג של חומצה אולאית (OA)-שונה SPIONs התפזרו 200 מ של N-הקסאן, והוא 400 מ ג של חומצה dimercaptosuccinic (DMSA) התפזרו 200 מ של אצטון, לתוך בקבוקון 3-צוואר באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס.
הערה: כדי לקבוע את הריכוז של OA-השתנה SPION שהתקבל מן השלב הקודם, לקחת אמצעי אחסון קטן (למשל 1 מ"ל) של פיזור SPION, התנדפות של N-הקסאן ולשקול את האבקה המתקבלת. - להוסיף 200 µL של triethylamine dropwise לתוך הפתרון הנ עם זע ב 1,000 סל ד ו- refluxing.
- לאחר 5 שעות של ערבוב, refluxing, לקבל את התמיסה שחור על-ידי הפרדה מגנטית.
- לפזר את SPIONs הידרופיליות במים יונים homogeneously על-ידי התאמת רמת ה-pH של התמיסה באמצעות tetramethylammonium הידרוקסיד.
- להוסיף 800 מ ג של חומצה אולאית (OA)-שונה SPIONs התפזרו 200 מ של N-הקסאן, והוא 400 מ ג של חומצה dimercaptosuccinic (DMSA) התפזרו 200 מ של אצטון, לתוך בקבוקון 3-צוואר באמבט מים ב 60 מעלות צלזיוס.
-
הכנה של פיי-SPIONs
- הוספת פתרון colloidal DMSA-השתנה SPION dropwise פתרון פיי (10 kDa) בבקבוקון שלוש-צוואר 500-mL תחת ערבוב מכני ב- 1,000 סל ד כבר שעתיים (WFe: Wפיי = 1:3).
הערה: המטען והגודל של פיי-SPIONs משתנים בהתאם היחס של WFe ל Wפיי. WFe: Wפיי יחס של 1:3 יכול להיות נקודת התחלה טובה עבור סינתזה פיי-SPIONs מתאים למשלוח siRNA. - בוזקים את הפתרון תוצאות שפופרת אולטראפילטרציה שיש ניתוק משקל מולקולרי של 100 kDa ותוכן של 15 מ"ל; לאחר מכן, צנטריפוגה ב 5,400 x g למשך 10 דקות עד הפתרון הנותרים הוא 1 מ"ל. להוסיף מים יונים הפתרון כדי להפוך את אמצעי האחסון 15 מ"ל שוב וחזור על התהליך הנ ל 10 x כדי לקבל את המוצר הסופי. לאחר מכן, לסנן את הפתרון דרך מסנן 0.22-μm ולאחסן את המוצר הסופי-4 מעלות צלזיוס.
- לקבוע ריכוז Fe פיי-SPIONs בשיטת ערכי צבע מוחלטים באמצעות phenanthroline17. לדלל פיי-SPIONs עם יונים במים סטריליים כדי ריכוז של 1 מ"ג למ"ל Fe ואחסן אותו ב 4 º C.
- לדלל 10 μL של הפתרון פיי-SPION (1 מ"ג למ"ל Fe) עד 1 מ"ל מים יונים; לאחר מכן, מבחן שלה פוטנציאל זטה ובגודל hydrodynamic על ידי מכשיר אור-פיזור דינמי.
הערה: להכין פיי-SPIONs בטווח של בערך 30-50 ננומטר. בטווח זה גודל ', ההשפעה של גודל NP על siRNA מחייבים, ספיגת הסלולר לא מופיע כדי להיות משמעותי. פיי-SPIONs הנושאת פוטנציאל זטה ממוצע של מעל +37 mV יכול להיות רעיל בטווח מינון עבור תרביות תאים, ואת וזמינותו cytotoxicity יש לבצע על מנת להבטיח בטיחות. יכול להיות נשלט את משטח הטעינה ואת hydrodynamic גודל של חלקיקים בטווח הרצוי על-ידי התאמת התוכן פיי.
- הוספת פתרון colloidal DMSA-השתנה SPION dropwise פתרון פיי (10 kDa) בבקבוקון שלוש-צוואר 500-mL תחת ערבוב מכני ב- 1,000 סל ד כבר שעתיים (WFe: Wפיי = 1:3).
2. Agarose בג'ל של פיי-SPION/siRNA NPs והכנה
- לדלל siRNA במים נטולי RNase להניב ריכוז סופי של 20 μM (0.26 μg/μL).
- מכינים חמש ללא RNase microcentrifuge צינורות בתווית 0, 1, 2, 4 ו 8. התוויות מייצגים Fe שונים: siRNA פרופורציה. Pipet 3 μL siRNA לפתרון כל צינורות (~0.8 μg siRNA/צינור).
- להוסיף 0, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4 μg של Fe בצורה של פיי-SPIONs על הצינורות שכותרתו 0, 1, 2, 4 ו 8, בהתאמה. שמור עוצמת הקול של המדגם של כל שפופרת μL פחות מ-20. מערבבים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה.
- דגירה של תערובות ב RT למשך 30 דקות כדי לאפשר היווצרות מורכבות פיי-SPION/siRNA. במהלך תקופה זו, הפוך agarose 3% ג'ל עם טוהר גבוהה agarose.
הערה: מתחמים נוספים פיי-SPION/siRNA עם אחרים של Fe: siRNA יחס (למשל, 5 או 6) יכול להיות מוכן ונבדק. - מוסיפים 1 μL של 6 x מאגר DNA-טעינה 5-μL לדגימה ומערבבים בזהירות. לטעון כל דוגמאות ולהפעיל אלקטרופורזה של 5 V/ס מ עד הכחול bromophenol נודד עד שני שליש מאורכו של הג'ל. מכתים את הג'ל עם אתידיום ברומיד (EB) למשך 15-20 דקות.
הערה: מאגר אלקטרופורזה הטרי והפתרון EB צריך לשמש. - דמיינו siRNA להקות תחת אולטרה מערכת הדמיה. בדוק את יחס Fe: siRNA-אילו מתחמי טפסים siRNA עם פיי-SPIONs בנוסף, כתוצאה מכך, הלהקות המייצג siRNA חינם הם מפגר או לא לזיהוי.
3. תרביות תאים של RAW264.7 מקרופאגים במבחנה
- תרבות העכבר מקרופאג דמוי RAW264.7 בתאים מנה ס מ-10 באמצעות DMEM השלם בינוני המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS) לכל 100 פניצילין U/mL לכל סטרפטומיצין μg/mL 100 ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5%.
- יום אחד לפני תרביות תאים, תשאף בינוני מתאי ולשטוף אותם עם באגירה פוספט תמיסת מלח (pH 7.4). להוסיף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין המנה ס מ-10. Trypsinize RAW264.7 תאים בערך 5-10 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5%.
- כאשר הרוב המכריע של התאים יש תלושים (לאחר 5-10 דקות), הוסף 5 מ של בינוני מלא DMEM המנה כדי להשבית את טריפסין. Pipet למעלה ולמטה כדי לפזר את התא אשכולות לתוך תאים בודדים.
- העברה התליה תא צינור חרוטי סטרילי 15-mL. . Centrifuge זה ב g x 300 למשך 3 דקות ב RT. להסיר את תגובת שיקוע
- Resuspend התאים עם 5 מ של טרי DMEM בינוני מלא ולספור את התאים.
- צלחת 9 x 10 תאים4 לכל טוב בצלחת. ובכן 6 מ ל 2 בינוני DMEM מלאה, דגירה-37 מעלות צלזיוס ב חממה2 CO 5% עבור 24 שעות.
הערה: אם באמצעות צלחת של גודל שונה, להתאים את צפיפות תא מצופה בפרופורציה פני השטח היחסי כך התאים להגיע 80% confluency בזמנו של תרביות תאים. - כאשר תא confluency 80%, להסיר את המדיום מתאי ולהחליף אותו עם 1 מ"ל DMEM בינוני מלא בכל טוב. להחזיר את הצלחת החממה עד פיי-SPION/siRNA מתחמי הוכנו והם מוכנים לשימוש (בערך 30 דקות).
- הכנת קומפלקסים פיי-SPION/siRNA: לחשב את הסכום של פיי-SPION/siRNA מתחמי לצורך ניסוי תרביות תאים. 1.5-mL ללא RNase microcentrifuge צינור, מערבבים כמות מספקת של פיי-SPIONs עם siRNA ביחס של Fe נתון: siRNA. לדוגמה, כדי להכין NPs פיי-SPION/siRNA המכיל 100 µg של Fe-Fe: siRNA יחס של 4, להוסיף 100 µL (1 מ"ג למ"ל Fe) של פיי-SPIONs כדי μL 96 של siRNA (0.26 μg/μL), ואחריו לערבב אותו בעדינות עם micropipette. תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
הערה: להכין אמצעי אחסון של פיי-SPION/siRNA קומפלקס זה 10% מעל המסה הסופית הכוללת לחשבון בשל ההפסדים הנלווים. הופך פיי-SPION/siRNA מתחמי-Fe נמוך: siRNA יחסי, תחת אשר siRNA שמולקולות טעון לחלוטין על פיי-SPIONs, לפיכך, כמויות קטנות של פיי-SPIONs יכול לשמש כדי למזער את cytotoxicity פוטנציאליים. טייס הניסויים (ג'ל פיגור assay) עבור אופטימיזציה של היחס Fe: siRNA נחוצים. - להוציא לצלחת 6-ובכן מן החממה (שלב 3.7). להוסיף נפח הנדרשת של פיי-SPION/siRNA מתחם dropwise מכל קידוח ו מערבולת את הצלחת בזהירות כדי להבטיח ריפודי כתופיים. להחזיר את הצלחת החממה עד ההערכה הסלולר ספיגת או ג'ין תמונות ציפורים ליעילות (ד 1-3).
הערה: המקרופאגים Transfecting עם פיי-SPION/siRNA-ריכוז של ~ 15 μg Fe/mL עשוי למקסם יעילות תרביות תאים תוך מזעור פוטנציאלי cytotoxicity.
4. מערכתית מסירת siRNA מקרופאגים בחולדות עם דלקת מפרקים ניסיוני
- להשיג ספציפי חולדות Wistar נטולת הפתוגן זכר כי הם בן 7 שבועות. Habituate העכברושים 7 d לפני השימוש, לספק להם מים ואוכל נאותה. זירוז אדג'וונט דלקת מפרקים (AA) בחולדות שתואר לעיל18.
- להכין את מתחמי פיי-SPION/siRNA כפי שמתואר בשלב 3.8.
- להזריק את פיי-SPION/siRNA NPs (0.3 מ"ג לק"ג siRNA) לתוך AA חולדות דרך הווריד של הזנב. להעריך את ספיגת הסלולר באמצעות, למשל, cytometry זרימה, רקמת biodistribution באמצעות, למשל, בזמן אמת פלורסצנטיות מערכת, הדמיה או השפעות טיפוליות בהתבסס על, למשל, קלינית, היסטולוגית, רדיוגרפי ניתוחים בזמן הרצוי נקודות18.
הערה: ללימודים biodistribution הסלולר ורקמות, מתייחסים החולדות עם זריקה אחת של NPs הרצוי; ללימודים טיפולית, להחדיר את החולדות NPs להיות נבדק 1 x בשבוע במשך שלושה שבועות רצופים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זטא וגודל הפוטנציאל של פיי-SPIONs מוכן עם פרוטוקול זה היו בטווח של 29-48 nm (אינדקס polydispersity: 0.12 - 0.23) ו- 30-48 mV, בהתאמה. הם היו יציבים במים ב 4 ° C מעל 12 חודשים ללא צבירת ברור. כדי להעריך שלהם siRNA היכולת מחייב, פיי-SPIONs היו מעורבים עם siRNA-Fe: siRNA שונים פרופורציה. איור 1 מראה כי כאשר היחס בין משקל Fe: siRNA מגיע 4 ומעלה, הלהקה של siRNA חינם לגמרי חסר, רומז siRNA מוצלח מחייב פיי-SPIONs. הדאגה העיקרית של פיי ביישום ביו הוא שלה רעילות, אשר היא תוצאה של המטען החיובי חזקה, במיוחד ב משקולות מולקולרית גבוהה, מינונים גבוהים. כפי שמוצג באיור 2A, פיי-SPIONs עם זטה פוטנציאלי של mV 30.5 ו 37 לא התערוכה נראית לעין cytotoxicity בריכוזים עד 30 μg Fe/mL, שזה בערך כפולה גבוה יותר מאשר הריכוז (15 μg Fe/mL) כלל משתמשים בו תאים תקנים. עם זאת, פיי-SPIONs עם פוטנציאל זטה של 48 mV היו רעילים אפילו במינון הנמוך בחן (10 μg Fe/mL). לכן, פיי-SPIONs בעלי רעילות תלויי-תשלום. מאז תשלום cationic אינה חשובה הקליטה NP מקרופאגים19, אנו ממליצים כי פיי-SPIONs עם פוטנציאל זטה הממוצע לא גבוה יותר +37 mV משמשים להעברת siRNA, למרות siRNA איגוד ויקטין את המטען במידה מסוימת, להקל cytotoxicity18.
כדי לבדוק את פוטנציאל היישום של פיי-SPIONs למסירה siRNA מקרופאגים, תקנים במבחנה בוצעה עם הקו תאי מקרופאג מאתר RAW 264.7. כפי נותחו על ידי cytometry זרימה, למעלה מ-90% של התאים היו transfected עם מתחמי פיי-SPION/siRNA שכותרתו fluorescently ב 15 µg Fe/mL (איור 2B). לגבי יעילות תרביות תאים, היה למעשה אין הבדל בין פיי-SPION/siRNA NPs הקים-Fe: siRNA פרופורציה של 4 ו 8, למרות, תחת התנאי האחרון, NPs שנוצרו היו קטנים בגודלם וחלשים האחראי חיובי כי כמות פחותה של siRNA נטען לכל החלקיקים. אנחנו גם העריכו את ההשפעה של פיי-SPION/siRNA התרכזות הפנמה הסלולר על ידי צביעת הכחול הפרוסי. כפי שמוצג באיור 2C, המקומות כחול בתוך התאים transfected היו מינימלית לזיהוי-7.5 µg Fe/mL, אבל נראה בבירור ב 15 µg Fe/mL. מעניין, הגדלת ריכוז פיי-SPION/siRNA כדי µg 32 Fe/mL לא גדלה עוצמות מוכתמים, כנראה בגלל תפיסה פיי-SPION/siRNA היה רווי בריכוזים סביב 15 µg Fe/mL. בנוסף, היכולת של פיי-SPIONs על תיווכה ההעברה siRNA דברים אלה מקרופאגים ראשי18, והיה השיטה המובאת כאן יעילות תרביות תאים siRNA גבוהה מקרופאגים הצפק החולדה, מקבילה לזו ב- RAW264.7 תאים. המקרופאגים הצפק transfected עם פיי-SPIONs מחסה מסוים siRNA הראו ירידה משמעותית ברמת mRNA היעד לעומת siRNA לא ספציפית (איור דו-ממדי), רומז siRNA הזה יכול לברוח מן שלפוחית אנדוציטוזה לתוך הציטופלסמה ולהגיע המכונות RNAi.
בעבר גם חקרנו ויוו הסלולר תפיסה של מתחמי פיי-SPION/siRNA מערכתית בניהול בחולדות עם דלקת מפרקים אדג'וונט18. ניתחנו את פיי-SPION/siRNA היעילות תרביות תאים מקרופאגים phagocytic ו- nonphagocytic T לימפוציטים. כפי שמוצג באיור3, CD11b + תאים לקח את פיי-SPION/siRNA מתחמי ביעילות רבה יותר מאשר תאי CD3 + בכל נקודת זמן בכל האברים בחן, המציין NPs פיי-SPION/siRNA. המטרה מעדיפים את המקרופאגים18. ראוי לציין, הצטברות ברמה גבוהה של NPs נצפתה ב המפרקים מודלקים18, רומז כי פיי-SPION יכול להיות פלטפורמה מושכת למסירה מערכתית של siRNA therapeutics מפרקים שגרונית הפתוגנזה של מי מקושר מקרופאג בתפקוד עבור אילו siRNA המקומי הניהול אינה בחירה בשל המעורבות של איברים מרובים של המחלה.
איור 1: Agarose בג'ל של פיי-SPION/siRNA מתחמי שהוקמה ב יחסי Fe: siRNA (w/w) שונים- יחס Fe: siRNA 0 מייצג דופלקסים siRNA חינם בלי פיי-SPIONS. גודל ממוצע ופוטנציאל זטה של פיי-SPIONs חינם המשמש כאן היו 30 nm ו-45 mV. siRNA יכול לחלוטין לאגד פיי-SPIONs כאשר היחס Fe: siRNA מגיע 4 ומעלה, בקנה אחד עם התוצאות הקודמות באמצעות פיי-SPIONs עם גודל ממוצע של 48 nm ופוטנציאל זטה mV 30.518. העדר של להקות מפגר (פיי-SPION/siRNA מתחמי) עשוי לשקף הנגישות siRNA ל EB במהלך צביעת, אינדיקציה חזקה siRNA מחייב, ו/או היכולת עיבוי של פיי-SPIONs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: אפיון ביולוגי של פיי-SPION ו- NPs פיי-SPION/siRNA. (א) לוח זה מציג assay הכדאיות של התא. תאים 264.7 גלם טופלו במשך 16 קמ"ש עם המנות המצוין של פיי-SPIONs הנושאת פוטנציאל זטה שונים ו, אז בוצעה וזמינותו MTS. הכדאיות תא היה מנורמל נגד הפקד (אין חשיפה של חלקיקים). הנתונים הם זאת אומרת ± SD של בארות כפולים. (B) לוח זה מציג ניתוח cytometric זרימה של תפיסה פיי-SPION/Cy3-siRNA על ידי תאים RAW 264.7. התאים היו הדגירה במשך 24 שעות ביממה עם 15 µg Fe/mL (החלונית העליונה) או 5 μg Fe/mL (החלונית התחתונה) של פיי-SPIONs ומורכבת עם התווית על-ידי Cy3 siRNA ביחס (w/w) Fe: siRNA של 4 ו- 8, בהתאמה. SiRNA ספציפי (NC) מייצג siRNA פלורסנט שאינן–. M2: מגודרת באזור; עוצמת קרינה פלואורסצנטית pe-ח': Cy3. היעילות של תרביות תאים siRNA של פיי-SPIONs המשמש כאן (37.8 nm, 48 mV) היה דומה מחקר קודם באמצעות פיי-SPIONs עם גודל ממוצע של 48 nm ופוטנציאל זטה mV 30.518. (ג) לוח זה מציג ניתוח של פיי-SPION/siRNA ספיגת דמיין מרבצי ברזל הסלולר. תאים 264.7 גלם היו מודגרות עם 7.5, 15 ו- 32 μg Fe/mL פיי-SPIONs (48 nm, 30.5 mV) ומורכבת עם siRNA (Fe: siRNA = 8) ו מוכתמת כחול פרוסי. פסי בקנה מידה הם 20 μm. (ד) לוח זה מראה של אימות במבחנה של יעילות שתיקה siRNA מועברים על ידי פיי-SPIONs. ספציפית פילוח siRNA חולדה שרשרת β /-15 לקולטן il-2 היה טעון על גבי פיי-SPIONs (48 nm, 30.5 mV) ב Fe: siRNA = 8, לאחר מכן, transfected לתוך מקרופאגים הצפק החולדה. SiRNA NC שימש שליטה. הגן להשתיק אפקט הוערכה על ידי ה-PCR כמותי. התאים היו מודגרות עם מתחמי ב 15 μg Fe/mL. זאת אומרת ± הגרמנים של בארות triplicate נמצאים הנתונים. לוח ד שונתה מ דואן. et al. 18 באישור המוציא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: In vivo הסלולר ספיגת של NPs פיי-SPION/siRNA. שלושה עכברים הניווניים הוזרקו לווריד מנה אחת של Cy3-siRNA ניסח עם פיי-SPION 0.3 מ"ג/ק"ג (48 nm, 30.5 mV). חולדה הזריק PBS שימש פקד. דם הטחול, הכבד, הכליה, המפרקים מודלקים נאספו ב 2, 8 ו- 24 שעות לאחר ההזרקה. ספיגת הסלולר של פיי-SPION/Cy3-siRNA NPs הוערכה על ידי cytometry זרימה באמצעות (A) אנטי CD3 ונוגדנים חד-שבטיים אנטי-CD11b (B). האחוזים הם Cy3-siRNA ספיגת בתוך מגודרת CD3 + או CD11b + תאים. התוצאות המוצגות כאן הן נציג של שני ניסויים עצמאית. איור זה שונה מדואן. et al. 18 באישור המוציא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המקרופאגים הם דברים מעוותים transfect על ידי גישות nonviral בשימוש נפוץ, כגון אלקטרופורציה, ליפוזומים cationic השומנים מינים. כאן אנחנו תיאר שיטה אמינה ויעילה כדי transfect מקרופאגים עם siRNA. משתמש בפרוטוקול הנוכחי, מעל 90% של תאים 264.7 גלם כמו מקרופאג (איור 2B) ו מקרופאגים הצפק החולדה18 יכול להיות transfected עם siRNA ללא לקות משמעותית של הכדאיות התא. שיטה זו תלויה פלטפורמת משלוח פיי-SPION, וזה nanocarrier מורכב של גרעין של תחמוצת ברזל פגז של פיי. לכן, הצעד הראשון מפתח של הפרוטוקול היא הסינתזה של פיי-SPIONs מתאים למשלוח siRNA. בדרך כלל, מצופים פיי SPIONs מוכנים מן SPIONs מצופים חומצה אולאית בשיטה החלפת ליגנד שבו חומצה אולאית ישירות חילופי מפני השטח של SPIONs על ידי פיי או נגזרות שלו15, יצירת NPs הידרופילית עם הטעון חיובית השטח. במקרה המוצג כאן, חומצה אולאית כתרים על פני השטח של SPIONs הוחלף על ידי חומצה dimercaptosuccinic מסיסים במים ולאחר מכן פיי היה טעון על משטחי SPION דרך אלקטרוסטאטיות. שיטה זו היא עדין וקל להכין בכמויות גדולות, ויש NPs מסונתזת יציבות מעולה מים20. זה ידוע כי פיי ציטוטוקסיות, הרעילות חריפה להרכב שלו משקל מולקולרי21. כדי להבטיח בטיחות, הוא שיקול חשוב כאשר סינתזה פיי-SPIONs החלקיקים הם מצופים פיי נמוך משקל מולקולרי, אשר kDa 10 ב פרוטוקול זה. השפעת רעיל בלתי רצויה פיי בעיקר מתווך על ידי מטען חיובי שלה; לכן, המדידה של הפוטנציאל זטא של פיי-SPIONs הוא חיוני, הערך צריך להיות לא יותר מאשר 37 mV. ניתן להשיג ירידה מטען חיובי פשוט על-ידי הפחתת תכולת פיי. צעד קריטי נוסף ליישום מוצלח של מערכת משלוח זו siRNA הוא אופטימיזציה של היחס Fe: siRNA על ידי ג'ל פיגור. . נראה סביר פיי-SPION/siRNA מתחמי-Fe נמוך: siRNA יחסי תחת siRNA אילו מולקולות הן עדיין מסוגל מחייב פיי-SPIONs. בנסיבות האלו, כמויות קטנות של פיי-SPIONs יכול לשמש, ובכך לחסוך cytotoxicity הפוטנציאלי שלה.
במקרה יעילות שתיקה הרצוי או האפקט הטיפולי אינו מיוצר, לבדוק את היעילות של תרביות תאים על-ידי לזרום cytometry או קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ באמצעות המוביל עמוסה של siRNA fluorescently שכותרתו. לחלופין, תפיסה פיי-SPION/siRNA יכולים להיבדק על ידי צביעת כחול פרוסי קונבנציונאלי, אשר רגישה מספיק כדי לזהות בגרגרים יחיד של ברזל בתאים. אם היעילות תרביות תאים אכן נמוכה, זה עשוי להידרש כדי למטב את התנאים תרביות תאים כגון צפיפות התאים, תרביות תאים הזמן המינון של פיי-SPION/siRNA חלקיקים. המספר מעבר התא יכול להשפיע גם את היעילות של תרביות תאים22. ברוב המקרים, אפקט שתיקה אין די אינה נגרמת בשל ספיגה פיי-SPION/siRNA לא מספיקות, כל המערכת הנוכחית של פיי-SPION הוכח כדי להקל על העברת siRNA יעיל של מקרופאגים. לפעמים, המשלב מספר siRNAs מיקוד אותו גן יכול להיות אסטרטגיה טובה כדי לשפר את יעילות תמונות ציפורים. ראוי לציין, כי למרות RNAi מתבצע בדרך כלל בתוך 24 שעות של תרביות תאים, הופעת ומשך הזמן של ג'ין להחרשת תלויים שיעור תחלופה של המטרה, הקצב של דילול ואריכות ימיהם של siRNA, אפילו את הריכוז של סרום במדיום. לכן, זמן הקורס ניסויים עשוי להיות נחוץ כדי לקבוע באופן מדויק את נקודת הזמן של אפקט מקסימלי2,22. ליישום אין ויוו , היעילות הטיפולית תלוי גם, ותורמת ובאיזו מידה, המטרה siRNA פנוטיפים המחלה; לכן, הבחירה של מטרה siRNA המתאים הוא קריטי עבור התוצאות הצפויות.
ישנם מספר יתרונות של פרוטוקול זה עבור אספקת siRNA מקרופאגים. (1) השיטה הוא קל לביצוע דרך זולה כדי לייצר פיי-SPIONs בכמויות גדולות, ונמצא NPs המיוצר יציבים במים במהלך 12 חודשים, אם הם שמרו ב 4 º C. (2) ספונטנית phagocytosis של SPIONs על ידי מקרופאגים מקלה על העברה יעילה siRNA פיי SPION-בתיווך, והתוצאה היא יעילות גבוהה תרביות תאים. הוא צפוי כי מלבד תאים RAW 264.7, המקרופאגים הצפק החולדה, גישה זו ישימה על אחרים קווי macrophage התא, מקרופאגים העיקרי, כל עוד המינון על תרביות תאים ממוטבת. (3) תרביות תאים siRNA מהיר, קל לנהל לעומת שיטות אחרות תרביות תאים מקרופאג כגון nucleofection, אשר הוא זמן רב ודורש מכשיר Nucleofector2. (4) פיי-SPION יכול להיות כלי רכב אידיאלי למסירה, ממוקדות מקרופאג siRNA מערכתית במודלים מסוימים המחלה. מקרופאגים לשחק תפקידים חיוניים בתחום הפיתוח ההתקדמות של מגוון הפרעות דלקתיות כרוניות, כמו גם גידולים; תכונה אחת בולטת היסטולוגית של מחלות אלו כלי דם נורמלי עם אנדותל דולפים. לפיכך, בשל חדירות משופרת ותוצאה השמירה, NPs שנטענו סמים מערכתית בניהול נוטים להצטבר לרקמות החולות בקלות בשבי על ידי מקרופאגים מקומיים, המוביל אל ירידה לפרטים משופרת, להפחית תופעות לוואי ואת משופרת יעילות טיפולית. במודל של עכברים של דלקת מפרקים אדג'וונט, מתחמי פיי-SPION/siRNA מוזרק לווריד צולמו ~ 40% של תאים CD11b + במהלך 24 השעות הראשונות לאחר הזרקת18. לעומת זאת, כאשר ליפוזום cationic שימש כנשא למסירה siRNA מערכתית בעכברים, פחות מ-5% של תאים CD11b + במפרקים הניווניים לכודים siRNA lipoplexes23. יתר על כן, בשל תכונותיהם מגנטי, היישום של שדה מגנטי חיצוני עשוי נוסף להקל על ההצטברות של פיי-SPION/siRNA מתחמי ברקמות היעד ולהגדיל את ספיגת הסלולר שלהם. גם ראוי לציון היא NPs siRNA טעון כזה יכול לשמש לא רק עבור להתכוונן מקרופאג פונקציה, אלא גם עבור הדמיה מקרופאג לספק מידע אבחוני, צג יעילות הטיפול, לחזות את התוצאות הקליניות של המטופלים12.
עם זאת, קיימים מגבלות הקשורים עם פרוטוקול זה. מערכת פיי-SPION תערוכות לטווח קצר של המינון למסירה siRNA. תפיסה מקסימלית אירעה כאשר RAW264.7 תאים נחשפו על פיי - SPION/siRNAs-ריכוז של µg 15 Fe/mL (איור 2B ו- 2 C). הגדלת ריכוז פיי-SPION/siRNA כדי µg 32 Fe/mL לא לגרום לעלייה ספיגת הסלולר (איור 2C) אבל, להפך, עשויה להגביר את הסיכון של גרימת מות תאים בשל רעילות מהותי של פיי. מצד שני, הפחתת פיי-SPION/siRNA כדי µg 5 או 7.5 Fe/mL ברור מופחתת ספיגת שלה על ידי תאים RAW264.7 (איור 2B ו- 2 C). לכן, אנו מציעים כי ריכוז פיי-SPION/siRNA אופטימלית עבור במבחנה מקרופאג תרביות תאים הוא µg ~ 15 Fe/mL (הריכוז הסופי לבאר). מגבלה נוספת שצריך לקחת בחשבון הוא להשפעה אפשרית של פיי-SPIONs על פעילות מקרופאג. חלקיקי עלול לגרום את התגובה החיסונית24, בהתאם שינוי פני השטח שלהם, משטח הטעינה, גודל, צורה, אפילו על המתודולוגיה בשימוש לסנתז אותם. Mulens-אריאס. et al. דיווח לאחרונה SPIONs מצופים פיי להפעיל הפעלה מקרופאג25. השיטה של סינתזה פיי-SPION המובאת כאן משתנה באופן משמעותי מזו של Mulens-אריאס. et al., לכן, אם פיי-SPIONs מוכן המבוסס על ההדק בפרוטוקול הנוכחי מקרופאג ההפעלה מחכה בהמשך החקירה. עם זאת, כדי לטפל חד משמעית חשש זה, אנו ממליצים כי, בנוסף פיי-SPION ומורכבת עם לטרוף siRNA, הרכב עצמו (פיי-SPION בלבד) יכול לשמש פקד אחר בעת שימוש בפרוטוקול הנוכחי. לבסוף, פרוטוקול זה אינו מתאים המשלוח של ה-DNA בגלל הגודל שלה גדול יחסית.
לסיכום, הצגנו כאן שיטה של שימוש SPIONs מצופים פיי כרכב עבור תרביות תאים siRNA ב מקרופאגים. NPs אלה יכולים לספק ביעילות siRNA לתוך קווי macrophage מונצחים התא, כמו גם לתוך מקרופאגים הראשית in vitro לקשרי, פונקציונלית זירוז ג'ין להחרשת מבלי להשפיע על יכולת הקיום תא למינון האופטימלי עבור תרביות תאים. יתר על כן, פיי-SPIONs עשוי לשמש למסירה ויוו siRNA מקרופאגים, כך שניתן התמונה, כמו גם לווסת, מקרופאגים בתפקוד של מי תורם התפתחות והתקדמות של הפרעות דלקתיות כרוניות רבות, סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (81772308) ואת המחקר הלאומי מפתח תוכנית הפיתוח של סין (מספר 2017YFA0205502).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , Springer. 123-143 (2009).
- Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).
- Davignon, J. -L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
- Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
- Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).
- Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
- Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).
- Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).
- Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
- Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
- Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
- Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
- Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
- Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
- Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
- Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).
- Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
- Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).
- Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
- Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
- Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).
