Summary
Polyethyleneimine (페이)를 사용 하는 방법 설명-siRNA와 transfecting 세포에 대 한 superparamagnetic 산화 철 나노 입자를 코팅. 이러한 나노 입자 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서 및 침묵 대상 유전자 발현을 효율적으로 siRNA를 제공할 수 있습니다.
Abstract
면역 반응 조절에 그들의 중요 한 역할 때문에 세포 지속적으로 집중적인 연구의 대상이 되고있다 하 고 자가 면역 질환, 동맥 경화, 암 등 여러 질환에 유망한 치료 대상 대표. 프로브; 대 식 세포 기능을 조작 하는 선택의 귀중 한 접근은 RNAi 중재 한 유전자 침묵 그러나, siRNA와 대 식 세포의 transfection 종종 기술적으로 도전으로 간주 하 고, 현재, 대 식 세포를 siRNA 전송에 전념 하는 몇 가지 방법론을 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 siRNA의 세포 타겟된 배달에 대 한 차량으로 polyethyleneimine 코팅 superparamagnetic 철 산화물 나노 입자 (페이-SPIONs)를 사용 하 여 프로토콜을 제시. PEI SPIONs 바인딩 및 Fe: siRNA 무게 비율에 도달 하면 4 완전히 siRNA를 콘 덴 싱의 고 위에 할 수 있다. 생체 외에서이러한 나노 수 효율적으로 제공 siRNA transfection에 대 한 최적의 복용량에서 손상 세포 생존 능력 없이 대 식 세포와 같은 RAW 264.7 세포 라인에 뿐만 아니라 기본 세포로 하 고, 궁극적으로, 그들은 유도 siRNA 중재 대상 유전자 침묵입니다. SiRNA transfection 생체 외에서 사용 되 고, 떨어져 페이 SPIONs 세포에서 vivo에서를 siRNA를 제공 하기 위한 유망한 도구 있습니다. 자기적 성질 및 유전자 침묵 능력의 결합된 기능에 비추어 체계적으로 관리 페이-스파이/siRNA 입자 뿐만 아니라 대 식 세포 기능 조절 뿐만 아니라 몇 군데를 추적 세포 활성화 예상 된다. 페이-SPIONs 대 식 세포를 siRNA 전달, 안전, 간단 하 고 효과적인 nonviral 플랫폼을 대표 하는 본질적으로, 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서.
Introduction
대 식 세포는 다른 금액에도 불구 하 고 모든 신체 조직에 배포 하는 타고 난 면역 세포의 유형입니다. 생산 함으로써 다양 한 cytokines 및 다른 중재자, 그들은 중요 한 역할을 재생 하는 미생물 병원 체 침입에 대 한 호스트 방어, 다음 부상, 조직 복구 및 조직의 항상성1를 유지 하. 그들의 중요성 때문에 세포 지속적으로 집중적인 연구의 주제 되었습니다 합니다. 그러나, 유전자 조절 및 기능 연구에 있는 그것의 보급에도 불구 하 고 중재 하는 siRNA 유전자 침묵은 대 식 세포 때문에 성공 가능성이 이러한 셀-특히, 주 대 식 세포-는 종종 transfect 어렵다. 이 독성 연관 있는 세포 막 화학은 가장 잘 설립 transfection 접근 (예를 들면, 고분자와 지질)의 상대적으로 높은 수준의 관찰 작용 수 있다 또는 육체적으로 (예를 들어, electroporation 여 고 유전자 총) 교차 하는 그로 인하여 크게 줄이고 세포의 생존2,3막 siRNA 분자를 방해 합니다. 또한, 대 식 세포는 전용된 phagocytes degradative 효소 풍부. 이러한 효소 siRNA, 유전자 특정 siRNA의 셀3,4로 전달 하는 경우에 그 입을 효율성 약화의 무결성을 손상 수 있습니다. 따라서, 효과적인 macrophage 대상으로 siRNA 전달 시스템 납품4siRNA의 안정성과 무결성을 보호 하기 위해 필요 합니다.
역 기능 세포 개시와 자가 면역 질환, 동맥 경화, 고 암 같은 특정 일반적인 임상 질환의 진행에 연루는 점점 더 분명 하다. 이러한 이유로, 대 식 세포 기능을, 예를 들어, siRNA, 변조 치료 이러한 장애5,,67에 대 한 매력적인 방법론으로 신흥 되었습니다. 많은 진행 했다, siRNA 기반 치료 전략의 주요 과제는 체계적으로 관리 siRNA와 대 식 세포, 따라서 원치 않는 부작용으로 이어질에 의해 부족 한 siRNA 통풍 관의 불 쌍 한 세포 특이성. 일반적으로 최적의 셀 선택도 부족 하 고 종종 오프 대상 부작용, 약물 로드 (NPs), 나노의 reticuloendothelial 시스템에 의해 점령 되 고 그들의 자발적인 성향 때문으로 이어질 무료 핵 산 치료제와 비교 수동 타겟팅 세포에 vivo에서, 최소한의 부작용8향상 된 치료 효능에 대 한 수 있도록 설계 될 수 있다. 현재 NPs RNA 분자의 배달에 대 한 탐험 등 무기 nanocarriers, 다양 한 리, 고분자9. 그 중 polyethyleneimine (페이), 양이온 고분자 바인딩 및 안정된 NPs로 집 광 하는 핵 산의 종류 용량9,10를 제공 하는 가장 높은 RNA를 보여줍니다. 페이, 세포 막에 걸쳐 그들의 전송을 중재 및 그들의 세포내 방출 촉진 효소와 nonenzymatic 저하에서 핵 산을 보호 한다. 비록 처음 DNA 배달 시 약으로 도입, 페이 이후에 로컬 하나 siRNA 전달 vivo에서 또는 체계적으로9,10매력적인 플랫폼으로 시연 했다.
Superparamagnetic 산화 철 나노 입자 (SPIONs) 생물의 약, 그들의 자기 특성, 생체 적합성, 생물학으로 중요 한 개체, 높은 표면 지역에 양 비율에 비해 크기 때문에 큰 약속을 보여왔다 고 쉽게 적응 표면 bioagent 첨부 파일11. 예를 들어, 그들의 잠재적인 유틸리티 대조 대리인 및 대 식 세포에 의해 급속 한 통풍 관으로, 때문에 SPIONs 이미지 조직 대 식 세포12좋아하는 임상 도구로 떠오르고 있다. 문학에 대 한 캐리어로 SPIONs의 몇 가지 보고서가 포함 되어 동안 SPIONs 또한 광범위 하 게 연구 핵 산 배달 차량11,13,,1415, 우리의 지식, 대 식 세포를 대상으로 siRNA 전달입니다. SPIONs에 의해 유전자 배달에 대 한 그들의 표면은 일반적으로 친수성 양이온 폴리머는 부정적으로 위탁 된 핵 산 정전 끌었다 고 수 곁의 층으로 입힌 다. 여기, 우리가 그 표면 낮은 분자-무게 (10 kDa), 분기 페이 (PEI SPIONs) 수정 됩니다 SPIONs을 합성 하는 방법을 제시. 이러한 자기 nanoplatforms 다음 셀에 siRNA 전송 수 있도록 페이-스파이/siRNA 복합물을 형성 하는 siRNA를 압축 하는 채택 된다. 우리 reticuloendothelial 시스템16의 세포에 의해 SPIONs의 자발적인 먹어서 그 이유, 바인딩의 강한 능력이 함께 하 고 페이 SPIONs를 siRNA에의 효율적인 전송에 적합 렌더링 응축 핵 산 페이, 여 대 식 세포입니다. 여기에 제시 된 데이터 지원으로 문화 뿐만 아니라 vivo에서세포에 페이 스파이/siRNA-중재 된 유전자 침묵의 타당성.
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Protocol
관련 된 동물 동물에 따라 수행한 모든 방법을 조심 하 고 동남 대학, 중국의 지침을 사용 하 여.
1입니다. 페이 SPIONs의 준비
-
올레산 수정 SPIONs의 준비
- FeCl3•6H2O와 FeSO4•7H2O N2의 보호 아래 물에 용 해.
- 비 커에 FeCl3•6H2O의 28 g와 FeSO4•7H2O 이온된 물 80 mL에 20 g을 추가 합니다. 유리 도관을 통해 물에 N2 를 소개 하 고 고체 물질 해산 했다 때까지 저 어.
- 반응 혼합물 암모니아 물 (28%)의 40 mL의 추가 의해 따라 800 rpm의 교 반 속도로 72 ° C에가 열. 5 분 동안 저 어.
- 위에서 언급 한 솔루션에 dropwise 올레산의 9 mL를 추가 하 고 3 h 72 ° C에서 그것을 저 어.
- 차가운 실내 온도 (RT) 결과 솔루션. 자력 분리를 통해 솔루션을 침전.
- SPIONs 3를 포함 하는 침전 물은 세척 절대 에틸 알코올로 x, N-헥 산 100 mL에 침전을 분산 하는 고.
- FeCl3•6H2O와 FeSO4•7H2O N2의 보호 아래 물에 용 해.
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산 수정 dimercaptosuccinic SPIONs의 준비
- 올레산 (OA)의 800 밀리 그램을 추가-수정 SPIONs N-헥 산, 200 mL에 분산 및 dimercaptosuccinic 산 (DMSA)의 400 밀리 그램 60 ° c.에 물 욕조에 3 목 플라스 크에 아세톤, 200 mL에 분산
참고: 이전 단계에서 얻은 OA 수정 스파이의 농도 결정 하기 위해 스파이 분산의 작은 볼륨 (예: 1 mL)을 받아, N-헥 산 volatilize와 무게 결과 분말. - 1000 rpm으로 교 반 환류와 위에서 언급 한 솔루션에 dropwise triethylamine의 200 µ L를 추가 합니다.
- 5 h 교 반 및 환류, 후 자력 분리 하 여 검은 침전을 얻을.
- 균질 하거나 수산화를 사용 하 여 솔루션의 pH를 조정 하 여 이온을 제거 된 물에서 친수성 SPIONs를 분산.
- 올레산 (OA)의 800 밀리 그램을 추가-수정 SPIONs N-헥 산, 200 mL에 분산 및 dimercaptosuccinic 산 (DMSA)의 400 밀리 그램 60 ° c.에 물 욕조에 3 목 플라스 크에 아세톤, 200 mL에 분산
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페이-SPIONs의 준비
- 기계적 교 반 2 h 1000 rpm에서 500 mL 3 목 플라스 크에서 페이 솔루션 (10 kDa)에 dropwise DMSA 수정 스파이 콜 로이드 솔루션을 추가 (승철: W페이 = 1:3).
참고: 충전 및 페이 SPIONs의 크기 W W페이Fe 의 비율에 따라 다릅니다. 승철: W페이 비율 1: 3의 합성 siRNA 전달에 적합 페이 SPIONs에 대 한 좋은 출발점이 될 수 있습니다. - 100 kDa의 분자량 컷오프 및 15 mL;의 콘텐츠는 한 튜브에 결과 솔루션 추가 다음, 원심 분리기 5400 x g에서 10 분 때까지 나머지 솔루션은 1 mL. 이온된 수 볼륨 15 mL를 다시 만들고 10 위의 과정을 반복을 솔루션에 추가 최종 제품을 얻기 위해 x. 그런 다음, 솔루션 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 고 4 ° c.에서 최종 제품을 저장
- Phenanthroline17를 사용 하 여 색도계 방법으로 페이-SPIONs의 Fe 농도 결정 합니다. 페이-SPIONs 1mg Fe/mL의 농도에 이온된 살 균 수 희석 및 4 ° c.에 그것을 저장합니다
- 10 μ 페이 스파이 솔루션 (1 mg Fe/mL)의 이온을 제거 된 물; 1 mL를 희석 그런 다음 동적 빛 산란 장치에 의해 유체역학 크기와 제타 잠재적인 테스트.
참고:에 대 한의 범위에서 페이 SPIONs 준비 30-50 nm. 이 크기 범위에 siRNA 바인딩 및 세포질 통풍 관에 NP 크기의 효과 중요 하다 표시 되지 않습니다. 페이 SPIONs 베어링 평균 제타 잠재력 이상 +37 mV transfection, 복용량 범위에 유독 할 수 있다 그리고 세포 독성 분석 실험 안전을 보장 하기 위해 수행 되어야 합니다. 표면 충전 및 유체역학 크기는 나노 입자의 페이 콘텐츠를 조정 하 여 원하는 범위 내에서 제어할 수 있습니다.
- 기계적 교 반 2 h 1000 rpm에서 500 mL 3 목 플라스 크에서 페이 솔루션 (10 kDa)에 dropwise DMSA 수정 스파이 콜 로이드 솔루션을 추가 (승철: W페이 = 1:3).
2. 준비 및 페이-스파이/siRNA NPs의 Agarose 젤 전기 이동 법
- SiRNA RNase 무료 20 μ M (0.26 μ g/μ)의 최종 농도를 물으로 희석.
- 5 RNase 무료 microcentrifuge 튜브 0, 1, 2, 4, 및 8 개를 준비 합니다. 레이블을 다른 Fe: siRNA 무게 비율을 나타냅니다. 피펫으로 3 모든 튜브 (~0.8 μ g siRNA/튜브)에 siRNA 솔루션의 μ.
- 3.2, 1.6, 0.8, 0을 추가 하 고 관에 페이-SPIONs의 형태로 Fe의 6.4 μ g 표시 0, 1, 2, 4, 및 8, 각각. 20 μ 각 튜브의 전체 샘플 볼륨을 유지. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 혼합.
- 페이-스파이/siRNA 복잡 한 형성 수 있도록 30 분 RT에 혼합물을 품 어. 이 기간 동안 3 %agarose 젤 높은 순도 agarose로 확인 합니다.
참고: 추가 페이-스파이/siRNA 단지 다른 Fe: siRNA 비율 (예를 들어, 5 또는 6) 준비 및 테스트 될 수 있습니다. - 6 x 5 μ 샘플 당 DNA 로딩 버퍼 1 μ를 추가 하 고 신중 하 게 혼합. 모든 샘플을 로드 하 고 bromophenol 블루 젤의 길이의 2/3까지 마이그레이션합니다 때까지 5 V/cm에서 전기 이동 법을 실행 합니다. Ethidium 평범한 사람 (EB) 15-20 분와 젤 얼룩.
참고: 갓된 전기 이동 법 버퍼와 EB 솔루션 사용 되어야 한다. - 자외선 이미징 시스템에서 siRNA 밴드를 시각화 합니다. 페이-SPIONs와는 siRNA 양식 단지에 Fe: siRNA 비율을 확인 하 고, 그 결과, 무료 siRNA를 대표 하는 밴드는 저 능 아 또는 하지 감지.
3. transfection RAW264.7 세포에서 생체 외에서 의
- DMEM을 사용 하 여 10 cm 접시에 문화 마우스 대 식 세포와 같은 RAW264.7 세포 완료 중간 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 100 U/mL 페니실린 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 100 μ g/mL 스 당 당 합니다.
- 한 전날 transfection, 세포에서 중간 발음 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (pH 7.4)와 함께 그들을 씻어. 10 cm 접시에 0.25 %trypsin 1 mL를 추가 합니다. 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 약 5-10 분 RAW264.7 세포 trypsinize
- 세포의 대부분은 (5-10 분) 후 분리 했으면 때 비활성화 된 트립 신을 접시 DMEM 완전 한 매체의 5 mL를 추가 합니다. 단일 셀에 셀 클러스터 분산을 위아래로 피펫으로.
- 살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 원심은 실시간 제거에서 3 분에 대 한 300 x g에는 상쾌한.
- Resuspend 신선한 DMEM 완전 한 매체의 5 mL와 셀과 셀.
- 접시 9 x 104 셀 당 완전 한 DMEM 매체의 2 mL와 함께 6 잘 플레이트에 고 약 24 시간 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어.
참고: 서로 다른 크기의 접시를 사용 하는 경우 세포 transfection 시 80 %confluency 도달 되도록 상대 면적에 비례하여 도금된 셀 밀도 조정 합니다. - 셀 confluency 80% 이면 세포에서 매체를 제거 하 고 잘 당 DMEM 완전 한 매체의 1 mL와 함께 그것을 대체. 페이-스파이/siRNA 단지 준비 된 사용 (약 30 분)에 대 한 준비가 될 때까지 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
- 페이-스파이/siRNA 단지 준비: 페이-스파이/siRNA 단지 transfection 실험에 필요한 금액을 계산. 1.5 mL RNase 무료 microcentrifuge 튜브, 주어진된 Fe: siRNA 비율로 siRNA와 페이-SPIONs의 적절 한 금액을 믹스. 예를 들어, 4의 Fe: siRNA 비율로 Fe의 100 µ g를 포함 하는 페이-스파이/siRNA NPs를 준비 하려면 추가 100 µ L (1 mg Fe/mL) 페이-SPIONs의 siRNA (0.26 μ g/μ)의 96 μ에는 micropipette 부드럽게 그것을 혼합 하 여 다음. 실시간에서 30 분 동안 품 어
참고: 페이-스파이/siRNA 복잡 한 부수적 손해에 대 한 계정 총 최종 질량 초과 10%의 볼륨을 준비 합니다. 낮은 철: siRNA 비율는 siRNA 분자는 페이 SPIONs에 완전히 로드 된 및, 따라서, 적은 양의 페이 SPIONs 잠재적인 세포 독성을 최소화 하기 위해 사용할 수 있습니다에서 페이-스파이/siRNA 단지를 확인 합니다. Fe: siRNA 비율의 최적화에 대 한 파일럿 실험 (젤 지체 분석 결과)가 필요 합니다. - 인큐베이터 (단계 3.7)에서 6-잘 접시를 꺼내. 각 우물에 dropwise 페이-스파이/siRNA 복합물의 필요한 볼륨을 추가 하 고 동등한 배급을 보장 하기 위해 신중 하 게 접시에 소용돌이. 세포질 통풍 관 또는 유전자 최저 효율 (1-3 d)의 평가까지 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.
참고: ~ 15 μ g Fe/mL의 농도에서 페이-스파이/siRNA와 Transfecting 세포 잠재적인 세포 독성을 최소화 하면서 transfection 효율을 극대화할 수 있습니다.
4. 조직 배달 siRNA의 쥐 실험 관절염 세포
- 특정 병원 체-무료 남성 Wistar 쥐 7 주 오래 된 얻을. 7 사용 전에 d 쥐를 길 들 하 고 충분 한 음식과 물을 함께 그들을 제공 합니다. 앞에서 설명한18로 쥐에서 보조 관절염 (AA)를 유도.
- 페이-스파이/siRNA 단지 3.8 단계에서 설명한 대로 준비 합니다.
- 페이-스파이/siRNA NPs (siRNA/kg의 0.3 m g)는 AA 쥐를 통해 꼬리 정 맥에 주사. 평가는 세포질 통풍 관을 통해, 예를 들어, cytometry, 조직 biodistribution 통해, 예를 들어, 이미징 시스템, 실시간 형광 또는 치료 효과에 따라, 예를 들어, 임상, 조직학, 방사선 원하는 시간에 분석18점.
참고: 휴대 및 조직 biodistribution 연구, 치료 원하는 NPs;의 단일 주사와 쥐 치료 연구, 세 연속 주 동안 일주일에 x 테스트 1 nps 쥐를 주사.
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Representative Results
크기와 제타 페이-SPIONs이이 프로토콜을 사용 하 여 준비의 잠재력 29-48 nm의 범위에 있었다 (증가할수록 인덱스: 0.12-0.23) 및 30-48 mV, 각각. 그들은 분명 집계 없이 12 개월 동안 4 ° C에 물에서 안정 되어 있었다. 능력을 바인딩 그들의 siRNA를 평가 하려면 페이 SPIONs 다양 한 Fe: siRNA 무게 비율에 siRNA와 혼합 했다. 그림 1 는 Fe: siRNA 무게 비율에 도달 하면 4 그리고 위에, 무료 siRNA의 밴드 완전히 누락, 암시 하는 페이 SPIONs 성공적인 siRNA 바인딩을 보여 줍니다. 생물 의학 응용 프로그램에서 PEI의 주요 관심사는 그것의 독성, 높은 분자 무게와 높은 복용량에서 특히 강한 긍정적인 책임의 결과 이다. 같이 그림 2A, 페이-SPIONs는 제타와의 잠재적인 30.5 37 mV 30 μ g Fe/mL, 두 가지 농도 (15 μ g Fe/mL) 보다 더 높은 세포 transfection를 위해 일반적으로 사용에 대 한 최대 농도에서 명백한 세포 독성을 전시 하지 않았다. 그러나, 48의 zeta 잠재력와 PEI SPIONs mV 독성 검사는 가장 낮은 복용량 (10 μ g Fe/mL)에 했다. 따라서, 페이 SPIONs 충전 종속 독성을 소유한 다. 양이온 충전 세포19NP 통풍 관에 대 한 중요 한 이므로, 우리는 제안 페이-SPIONs 하지 +37 보다 높은 평균 제타 잠재력 mV는 전송에 사용 되는 siRNA, siRNA 바인딩 어느 정도 요금을 줄일 것 이라고 하지만, 세포 독성18완화.
대 식 세포를 siRNA 전달에 대 한 페이-SPIONs의 잠재적인 응용 프로그램을 테스트 하기 위해 생체 외에서 transfection murine macrophage 셀 라인 RAW 264.7 수행 되었다. Cytometry에 의해 분석, 세포의 90% 이상 15 µ g Fe/mL (그림 2B)에 붙일 라벨된 페이-스파이/siRNA 단지와 페 했다. Transfection 효율에 관하여 실제로 차이가 페이-스파이/siRNA NPs 했지만, 후자의 조건 하에서 형성 된 NPs 크기에 작고 약한 포지티브 차지에 4와 8, Fe: siRNA 무게 비율에 형성 했다 때문에 siRNA의 낮은 금액을 입자 당 로드 했습니다. 우리는 또한 프러시안 파란 얼룩에 의해 셀룰러 국제화에 페이-스파이/siRNA의 농도의 효과 평가. 그림 2C같이 transfected 세포 내에서 푸른 반점 최소 15 µ g Fe/mL에서 명확 하 게 표시 하지만 7.5 µ g Fe/mL에 감지 했다. 흥미롭게도, 32 µ g Fe/mL에 페이-스파이/siRNA의 농도 증가 증가 하지 않았다 얼룩 농도 아마 때문에 페이-스파이/siRNA 통풍 관 주위 15 µ g Fe/mL 농도에서 포화 되었다. 또한, 중재 siRNA 전송에 대 한 페이-SPIONs의 능력은 기본 세포18, 뒷받침 했으며 여기에 제시 된 방법 높은 siRNA transfection 효율 쥐 복 막 대 식 세포, RAW264.7에 그 해당에 셀입니다. 복 막 대 식 세포 페이-SPIONs 일반적인 siRNA (그림 2D), 비교 대상 mRNA 수준에서 상당한 감소를 보여주었다 특정 siRNA를 품고와 페는 siRNA에 endocytosis 소포에서 탈출 수 있는 암시를 세포질 그리고 도달 RNAi 기계입니다.
우리 이전 또한 조사 vivo에서 세포의 통풍 관 보조 관절염18와 쥐에서 체계적으로 관리 페이-스파이/siRNA 단지. 우리 phagocytic 세포와 nonphagocytic T 림프 톨에 페이-스파이/siRNA transfection 효율 분석. 그림 3에서 보듯이 CD11b + 셀 CD3 + 세포 기관의 검사, 페이-스파이/siRNA NPs 우선적으로 세포18대상 나타내는 모든 시간 언제 든 지 보다 더 효율적으로 페이-스파이/siRNA 단지까지 했다. 특히, NPs의 높은 수준의 축적 염증이 관절18, 페이-스파이 류 마티스 관절염의 병 인에 연결에 siRNA 치료제의 체계적 납품을 위한 매력적인 플랫폼 수 제안에서 관찰 되었다 대 식 세포 기능 장애는 로컬 siRNA에 대 한 관리는 질병의 여러 기관의 개입으로 인해 마음에 드는 선택.
그림 1: 다양 한 Fe: siRNA (w/w) 비율에서 형성 된 페이-스파이/siRNA 단지의 Agarose 젤 전기 이동 법. 0의 Fe: siRNA 비율 무료 siRNA duplexes를 페이 SPIONS 없이 나타냅니다. 평균 크기와 무료 페이 SPIONs 여기 사용의 zeta 잠재력은 30 nm와 45 mV. siRNA 수 완전히 바인딩할 페이 SPIONs Fe: siRNA 비율에 도달 하면 4와 위, 48의 평균 크기 페이-SPIONs를 사용 하 여 이전 결과와 일치 및 30.5 mV18의 zeta 잠재력. 저 능 아 밴드 (페이-스파이/siRNA 단지)의 부재 얼룩, 강한 siRNA 바인딩 표시 및 페이 SPIONs의 응축 능력 중 EB에 siRNA의 어려움을 반영 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 페이-스파이 페이-스파이/siRNA NPs의 생물 학적 특성. (A)이이 패널 세포 생존 능력 분석 결과 보여줍니다. 페이 SPIONs 베어링 다른 제타 잠재력의 표시 된 복용량과 16 h에 대 한 RAW 264.7 세포 치료 하 고, MTS 시험 다음, 수행 되었다. 세포 생존 능력 (입자 노출) 컨트롤에 대 한 정규화 되었다. 데이터 중복 우물의 평균 ± SD는. (B)이이 패널 RAW 264.7 세포에 의해 페이-스파이/Cy3-siRNA 통풍 관의 흐름 cytometric 분석을 보여줍니다. 세포는 각각 15 µ g Fe/mL (위 패널) 또는 5 μ g 4와 8, Fe: siRNA (w/w) 비율로 Cy3 표시 된 siRNA에 complexed 페이 SPIONs의 Fe/mL (하단 패널) 24 h incubated 했다. 특이 현상 (NC) siRNA를 비-형광 siRNA를 나타냅니다. M2: 문이 지역; Pe-높이: Cy3 형광 강도입니다. 페이-SPIONs 여기 사용의 siRNA transfection 효율 (37.8 nm, 48 mV) 48의 평균 크기 페이-SPIONs를 사용 하 여 이전 연구와 유사 했다 및 30.5 mV18의 zeta 잠재력. (C)이이 패널 셀룰러 철 예금 시각화 여 페이-스파이/siRNA 통풍 관의 분석을 보여줍니다. 7.5, 15, 및 32 μ g Fe/mL 페이-SPIONs RAW 264.7 세포 incubated 했다 (48 nm, 30.5 mV) siRNA와 complexed (Fe: siRNA = 8) 프러시안 블루 스테인드. 스케일 바 20 μ m입니다. (D)이이 패널 페이 SPIONs에 의해 전달 되는 siRNA의 입을 효율성의 생체 외에서 검증을 보여줍니다. 특정 siRNA 타겟팅 쥐 일리노이-2/15 수용 체 β 체인 페이 SPIONs에 로드 된 (48 nm, 30.5 mV) Fe: siRNA에 = 8, 다음, 쥐 복 막 대 식 세포로 페. NC siRNA 제어로 사용 되었다. 효과 입을 유전자 정량 PCR에 의해 평가 했다. 셀 15 μ g Fe/mL에 단지와 함께 알을 품을 했다. 데이터 triplicate 우물의 평균 ± SD는. 패널 D 단 오 절 외 에서 수정 되었습니다. 게시자에서 허가로 18 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: vivo에서 세포의 통풍 관 페이-스파이/siRNA NPs. 3 관절염 쥐 0.3 mg/kg Cy3 siRNA 페이-스파이와 공식화의 단 하나의 복용량으로 정 맥으로 주입 했다 (48 nm, 30.5 mV). PBS를 주입 한 쥐 제어로 사용 되었다. 혈액, 비장, 간, 신장, 그리고 염증이 관절 주사 후 2, 8, 그리고 24 시간 수집 했다. 페이-스파이/Cy3-siRNA NPs의 세포질 통풍 관 cytometry 안티-CD3 (A)와 (B) 안티-CD11b 단일 클론 항 체를 사용 하 여에 의해 평가 되었다. 비율 문이 CD3 + 또는 CD11b + 셀 Cy3 siRNA 글귀입니다. 여기에 표시 된 결과 두 개의 독립적인 실험의 대표. 이 그림에서 단 오 절 외. 수정 되었습니다. 게시자에서 허가로 18 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
대 식 세포는 일반적으로 사용 되 nonviral 접근, electroporation, 양이온 리 등 지질 종에 의해 transfect 내 화물. 여기 우리 transfect siRNA와 대 식 세포를 안정적이 고 효율적인 방법을 설명 합니다. 현재 프로토콜을 사용 하 여, 이상 대 식 세포와 같은 RAW 264.7 세포 (그림 2B)와 쥐 복 막 대 식 세포18 의 90% 수 수 페 세포 생존 능력의 중요 한 장애 없이 siRNA와. 이 메서드는 nanocarrier의 산화 철의 코어와 PEI의 셸 구성 전달 플랫폼 페이-스파이에 따라 다릅니다. 그래서, 프로토콜의 첫 번째 주요 단계 페이-SPIONs siRNA 전달에 적합의 합성입니다. 일반적으로, 페이 코팅 SPIONs 준비가 올레산 코팅 SPIONs에서 있는 올레산은 직접 교환 SPIONs의 표면에서 페이 또는 그 파생 상품15, 리간드-교환 방법에 의해 긍정적으로 위탁 된 친수성 NPs를 생성 표면입니다. 여기에 제시 된 경우, SPIONs의 표면에 덮인 올레산 수용 성 dimercaptosuccinic 산에 의해 대체 되었다 그리고 페이 정전기 상호 작용을 통해 스파이 표면에 로드 된. 이 메서드는 온화 하 고, 대량으로 준비 하는 쉬운 이며 합성된 NPs 물20에 있는 우수한 안정성. 그것은 유명한 페이 세포 독성, 고 독성의 분자량21강하게 상관 한다입니다. 안전을 위해, PEI SPIONs을 합성 하는 때 중요 한 고려 사항은 이러한 입자는 10 kDa이이 프로토콜에는 저 분자 무게 페이 대 한 코팅입니다. PEI의 원치 않는 독성 효과 주로 그것의 긍정적인 요금;에 의해 중재 따라서, 페이-SPIONs의 제타 전위의 측정은 필수, 그리고 값 37 보다 더 높은 되어야 mV. 포지티브 차지 감소는 단순히 페이 콘텐츠를 줄임으로써 얻을 수 있습니다. 이 siRNA 전달 시스템의 성공적인 응용 프로그램에 대 한 또 다른 중요 한 단계는 젤 지체 하 여 Fe: siRNA 비율의 최적화입니다. 페이-스파이/siRNA 단지 분자는 페이 SPIONs 바인딩할 수 있는 siRNA 아래 낮은 Fe: siRNA 비율에 게 합리적인 것 같다. 이 상황에서 적은 양의 페이 SPIONs 사용할 수 있습니다, 따라서 그것의 잠재적인 세포 독성을 최소화.
경우 원하는 입을 효율성 또는 치료 효과 생산 되지, 교류 cytometry 또는 형광 현미경 붙일 레이블된 siRNA와 로드 캐리어를 사용 하 여 여 transfection 효율을 확인 합니다. 또는, 페이-스파이/siRNA 글귀는 철의 단일과 립 세포에 감지 충분히 민감한 전통적인 프러시안 파란 얼룩에 의해 시험 될 수 있다. Transfection 효율 실제로 낮은 경우 transfection 조건 셀 밀도, transfection 시간, 페이-스파이/siRNA 입자의 복용량 등을 최적화 하기 위해 필요할 수 있습니다. 셀 통로 번호 transfection22의 효율성에 또한 영향을 미칠 수 있습니다. 대부분의 경우에서 부족 한 입을 효과 발생 하지 않습니다 부족 페이-스파이/siRNA 통풍 관에 의해로 현재 페이 스파이 시스템 대 식 세포는 효과적인 siRNA 전송을 용이 하 게 입증 되었습니다. 때때로, 동일한 유전자를 대상으로 하는 여러 siRNAs를 결합 하 여 최저 효율을 향상 하는 좋은 전략 수. 있습니다 그것은, RNAi transfection의 24 시간 이내 발생 합니다, 하지만 발병 및 유전자 침묵 시키기의 기간에 따라 대상의 이직 률, 희석 속도 siRNA의 장 수 및 매체에서 혈 청의 농도도 주목 된다. 따라서, 과정 실험 최대한 효과2,22시간 포인트를 정확 하 게 결정 하는 데 필요한 수 있습니다 시간. Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 치료 효능은 또한, 여부에 따라 달라 집니다 및 siRNA 대상 질병 고기;에 기여 하는 어느 정도 따라서, 적절 한 siRNA 대상의 선택은 예상된 결과 대 한 중요 한.
대 식 세포에 siRNA를 제공 하기 위한이 프로토콜의 몇 가지 이점이 있다. (1) 메서드를 수행 하기 쉽습니다 대량, 페이-SPIONs를 생산 하는 저렴 한 방법 그리고 그들은 4 ° c.에 유지 하는 경우 12 개월 이상 생산 하는 NPs는 물에서 안정 (대 식 세포에 의해 SPIONs의 2) 자발적 먹어서 효과적인 페이 스파이 중재 하는 siRNA 전송을, 높은 transfection 효율 결과 촉진 한다. 그 RAW 264.7 세포와 쥐 복 막 대 식 세포, 외이 방식은 다른 대 식 세포 세포 선 및 기본 세포 transfection에 대 한 복용량 최적화로 예상 된다. (3) siRNA transfection 빠르게 그리고 실시 하기가 시간이 많이 걸리는 이며 Nucleofector 장치2필요 합니다 nucleofection 같은 다른 대 식 세포 transfection 방법으로 비교 합니다. (4) 페이-스파이 특정 질병 모델에서 대 식 세포 타겟 조직의 siRNA 전달에 대 한 이상적인 차량 일 수 있다. 대 식 세포 개발 및 다양 한 만성 염증 성 질환으로 종양;의 진행에 중요 한 역 그리고 한 눈에 띄는 조직학이 질병의 기능은 새 피와 비정상적인 혈관. 따라서, 향상 된 침투성 및 보존 효과, 체계적으로 관리 약물 로드 NPs 병 조직에 축적 하는 경향이 쉽게 캡처됩니다 지방 세포에 의해 향상 된 특이성을 선도, 부작용 감소 및 향상 된 치료 효능입니다. 보조 제 관절염의 쥐 모델에서 정 맥 주입된 페이-스파이/siRNA 단지 채택 되었다 CD11b + 셀의 40%에 의해 첫번째 24 시간 동안 주입18후. 반면, 양이온 liposome 생쥐에서 조직의 siRNA 전달에 캐리어로 사용 되었다 때 관절염 관절에서 CD11b + 셀의 5% 미만 siRNA lipoplexes23속은. 또한, 그들의 자기 특성으로 인하여 외부 자기장의 응용 프로그램 수 있습니다 추가 대상 조직에 페이-스파이/siRNA 단지의 축적을 촉진 그리고 그들의 세포질 통풍 관을 증가. 또한 주목할 만한입니다 같은 siRNA 로드 NPs를 사용할 수 있는 대 식 세포 기능 조절에 대 한 뿐만 아니라 이미징 대 식 세포에 대 한 진단 정보, 모니터 치료 효능을 제공 하 고 환자의 임상 결과12예측.
그러나,이 프로토콜와 관련 된 제한 존재 합니다. 페이-스파이 시스템 siRNA 전달에 대 한 복용량의 좁은 범위를 전시 한다. 최대 이해 RAW264.7 세포 15 µ g (그림 2B 와 2c) Fe/mL의 농도에서 페이-스파이/siRNAs를 노출 했다 하는 동안 발생 했습니다. 페이-스파이/siRNA 농도 32 µ g Fe/mL 증가 세포질 통풍 관 (그림 2C) 발생 하지 않았다 그러나, 그와 반대로, PEI의 본질적인 독성 때문에 세포 죽음을 유도의 위험을 증가 시킬 수를 증가. 다른 한편으로, Fe/mL RAW264.7 세포 (그림 2B 와 2c)의 글귀를 감소 분명히 5 또는 7.5 µ g에 페이-스파이/siRNA를 감소. 따라서, 우리는 대 식 세포 transfection 시험관에 대 한 최적의 페이-스파이/siRNA 농도 ~ 15 µ g Fe/mL (잘에서 최종 농도)는 제안 합니다. 고려 되어야 하는 또 다른 한계는 대 식 세포 활동에 페이-SPIONs의 가능한 효과입니다. 나노 입자 면역 응답24, 그들의 표면 개 질, 표면 충전, 크기, 모양, 그리고 그들을 합성 하는 데 사용 하는 방법론에도 유도 수 있습니다. Mulens-아리아 외. 최근 페이 코팅 SPIONs 대 식 세포 활성화25을 실행 했다. 페이-스파이 합성 여기에 제시의 방법 Mulens-아리아 외.의 크게 다릅니다 하 고 따라서 현재 프로토콜 트리거 기반 여부 페이 SPIONs 준비 대 식 세포 활성화는 추가 조사를 기다리고 있다. 그러나, 명확 하 게이 문제를 해결 하려면 것이 좋습니다, 페이-스파이 complexed 출 격 siRNA, 차량 자체 (페이 스파이)와 함께 현재 프로토콜을 사용 하는 경우 다른 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜은 상대적으로 큰 크기로 인해 DNA의 전달에 적합 하지.
요약 하자면, 우리는 여기 siRNA transfection 세포에 대 한 차량으로 페이 코팅 SPIONs를 사용 하는 방법 제시. 이러한 NPs 기본 세포에 생체 외에서에 뿐만 아니라 불멸 하 게 대 식 세포 세포 선으로 siRNA를 효율적으로 제공 하 고 기능적으로 유도 유전자 transfection에 대 한 최적의 복용량에서 세포 생존 능력을 영향을 주지 않고 입을 수 있습니다. 또한, 페이-SPIONs 대 식 세포, siRNA 배달 vivo에서 사용할 수 있습니다 이미지를 가능 하 게 하로 조절, 세포의 역 기능 개발 및 많은 만성 염증 성 질환의 진행에 기여 하 고 암입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81772308)와 국가 핵심 연구 및 중국의 개발 프로그램 (No. 2017YFA0205502)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Warm in 37°C water bath before use |
| Fetal bovine serum | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillin/streptomycin (1.5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Tetrazolium-based MTS assay kit | Promega | G3582 | For cytotoxicity analysis |
| RAW 264.7 cell line | Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China | TCM13 | |
| Tissue culture plates (6-well) | Corning | 3516 | |
| Tissue culture dishes (10 cm) | Corning | 430167 | |
| RNase-free tubes (1.5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Centrifuge tubes (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar rats | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences |
||
| Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder | National Institutes for Food and Drug Control, China |
for inducing adjuvant arthritis in rats | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, China) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, China) | ||
| Polyethyleneimine (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | E107079 | |
| Ammonia water | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | A112077 | |
| Oleic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | O108484 | |
| Dimethylsulfoxide | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D103272 | |
| FeSO4•7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3•6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Dimercaptosuccinic acid | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | D107254 | |
| ultrafiltration tube | Millipore | UFC910096 | |
| Tetramethylammonium hydroxide solution | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | T100882 | |
| Particle size and zeta potential analyzer | Malvern, England | Nano ZS90 |
References
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723 (2011).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection. Journal of Visualized Experiments. (91), e51960 (2014).
- Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The Expression of Exogenous Genes in Macrophages: Obstacles and Opportunities. Macrophages and Dendritic Cells. , Springer. 123-143 (2009).
- Zhang, M., Gao, Y., Caja, K., Zhao, B., Kim, J. A. Non-viral nanoparticle delivers small interfering RNA to macrophages in vitro and in vivo. PLoS ONE. 10 (3), e0118472 (2015).
- Davignon, J. -L., et al. Targeting monocytes/macrophages in the treatment of rheumatoid arthritis. Rheumatology. 52 (4), 590-598 (2012).
- Brown, J. M., Recht, L., Strober, S. The promise of targeting macrophages in cancer therapy. Clinical Cancer Research. 23 (13), 3241-3250 (2017).
- Karunakaran, D., et al. Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis. Science Advances. 2 (7), e1600224 (2016).
- Prosperi, D., Colombo, M., Zanoni, I., Granucci, F. Drug nanocarriers to treat autoimmunity and chronis inflammatory diseases. Seminars in Immunology. 34, 61-67 (2017).
- Höbel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (2), 129 (2009).
- Liu, G., et al. N-Alkyl-PEI-functionalized iron oxide nanoclusters for efficient siRNA delivery. Small. 7 (19), 2742-2749 (2011).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J. Imaging macrophages with nanoparticles. Nature Materials. 13 (2), 125 (2014).
- Magro, M., et al. Covalently bound DNA on naked iron oxide nanoparticles: Intelligent colloidal nano-vector for cell transfection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. 1861 (11), 2802-2810 (2017).
- Abdelrahman, M., et al. siRNA delivery system based on magnetic nanovectors: Characterization and stability evaluation. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 106, 287-293 (2017).
- Zhang, H., Lee, M. -Y., Hogg, M. G., Dordick, J. S., Sharfstein, S. T. Gene delivery in three-dimensional cell cultures by superparamagnetic nanoparticles. ACS Nano. 4 (8), 4733-4743 (2010).
- Moghimi, S. M., Hunter, A. C., Murray, J. C. Long-circulating and target-specific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological Reviews. 53 (2), 283-318 (2001).
- Harvey, A. E. Jr, Smart, J. A., Amis, E. Simultaneous spectrophotometric determination of iron (II) and total iron with 1, 10-phenanthroline. Analytical Chemistry. 27 (1), 26-29 (1955).
- Duan, J., et al. Polyethyleneimine-functionalized iron oxide nanoparticles for systemic siRNA delivery in experimental arthritis. Nanomedicine. 9 (6), 789-801 (2014).
- Fröhlich, E. The role of surface charge in cellular uptake and cytotoxicity of medical nanoparticles. International Journal of Nanomedicine. 7, 5577 (2012).
- Wu, Y., et al. Ultra-small particles of iron oxide as peroxidase for immunohistochemical detection. Nanotechnology. 22 (22), 225703 (2011).
- Xia, T., et al. Polyethyleneimine coating enhances the cellular uptake of mesoporous silica nanoparticles and allows safe delivery of siRNA and DNA constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).
- Mocellin, S., Provenzano, M. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2 (1), 39 (2004).
- Courties, G., et al. et al.In vivo RNAi-mediated silencing of TAK1 decreases inflammatory Th1 and Th17 cells through targeting of myeloid cells. Blood. 116 (18), 3505-3516 (2010).
- Zolnik, B. S., Gonzalez-Fernandez, A., Sadrieh, N., Dobrovolskaia, M. A. Minireview: nanoparticles and the immune system. Endocrinology. 151 (2), 458-465 (2010).
- Mulens-Arias, V., Rojas, J. M., Pérez-Yagüe, S., Morales, M. P., Barber, D. F. Polyethylenimine-coated SPIONs trigger macrophage activation through TLR-4 signaling and ROS production and modulate podosome dynamics. Biomaterials. 52, 494-506 (2015).
