Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

تمايز الخلايا الجذعية العصب خطوة واحدة بلازما باردة الغلاف الجوي علاج في المختبر

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58663
Automatic Translation
*1, *2, 3
1State Key Laboratory of Advanced Electromagnetic Engineering and Technology, Huazhong University of Science and Technology, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute/Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University
* These authors contributed equally

Summary

هذا البروتوكول يهدف إلى توفير خطوات تفصيلية تجريبية لعلاج البلازما الباردة الغلاف الجوي على الخلايا الجذعية العصبية، وكشف الفلورة لتعزيز التمايز.

Abstract

كما تم تطوير تكنولوجيا البلازما الفيزيائية، البلازما الباردة الغلاف الجوي (CAPs) التحقيق على نطاق واسع في إزالة التلوث، علاج السرطان، والتئام الجروح، وعلاج قناة الجذر، إلخ، تشكل حقل بحث جديد يدعى الطب البلازما. يجري خليط أنواع المتفاعلة الكهربائية والكيميائية، والبيولوجية، أظهرت قبعات قدراتهم لزيادة تمييز الخلايا الجذعية العصبية على حد سواء في المختبر و في فيفو ، وهي أن تصبح وسيلة واعدة لعلاج الأمراض العصبية في المستقبل. أخبار مثيرة أكثر بكثير هو أن استخدام قبعات يمكن تحقيق خطوة واحدة، وأمان الموجهة، تمايز الخلايا الجذعية العصبية (الود) لنقل الأنسجة. هنا علينا أن نظهر البروتوكول تجريبية مفصلة لاستخدام جهاز كاب نفاثة عصامي تعزيز التمايز مجلس الأمن القومي في C17.2-الود والخلايا الجذعية العصبية، والفئران الأولية، فضلا عن مراقبة مصير الخلية المقلوب والفحص المجهري الأسفار. مع مساعدة الفلورة تلطيخ التكنولوجيا، وجدنا كل الود أظهرت معدل التفاضلية المعجل من المجموعة غير المعالجة، و ~ 75 ٪ من الود متباينة بشكل انتقائي في الخلايا العصبية، التي أساسا ناضجة، اتروبين، والسيارات الخلايا العصبية.

Introduction

التفريق بين الود الموجهة إلى نسب معينة لنقل الأنسجة يعتبر واحداً من العلاجات الواعدة ل أمراض الأعصاب ونيوروتروماتيك1. على سبيل المثال، لا سيما المرجوة كاتيتشولامينيرجيك تتميز الخلايا العصبية في علاج مرض باركنسون (PD). ومع ذلك، قد الأساليب التقليدية لإعداد الخلايا المطلوب للنقل الكثير من العيوب، مثل المواد الكيميائية السمية أو تشكيل ندبة الآخرين، مما يعوق إلى حد كبير تطبيقات الود في الطب التجديدي2. ولذلك، من الضروري جداً العثور على الرواية وطريقة آمنة للتمايز القومي.

البلازما هي الدولة الرابعة من المسائل، ويلي الصلبة والسائلة، والغاز، وهو يشكل أكثر من 95% مسائل في الكون كله. بلازما محايدة كهربائياً مع الجسيمات المحايدة وغير منضم إيجابية/سلبية وعادة يتم إنشاؤها بواسطة عملية تفريغ عالية الفلطية في المعمل. في العقدين الأخيرين، تطبيق البلازما في الطب الحيوي قد اجتذب اهتمام هائل في جميع أنحاء العالم كتطوير تكنولوجيا البلازما الباردة الضغط الجوي. وبفضل هذا تكنيك، يمكن أن تتولد في الهواء المحيط في الغلاف الجوي دون تشكيل قوس مستقرة درجات الحرارة المنخفضة البلازما ويتكون من مختلف الأنواع المتفاعلة، مثل الأنواع النيتروجين التفاعلي (RNS)، والأنواع الأكسجين التفاعلية (روس)، والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) الإشعاع والإلكترونات والايونات والحقول الكهربائية3. قبعات بمزايا فريدة من نوعها للمنظمة المجهري، وعلاج السرطان، والجرح تضميد الجراح، وعلاج الأمراض الجلدية، وتكاثر الخلايا، والخلية التمايز4،5،،من67. في العمل السابق، أثبتنا أن جت البلازما الباردة الغلاف الجوي يمكن أن يعزز التفريق بين الود في الخلايا الجذعية العصبية موريني C17.2 (C17.2-الود) والخلايا الجذعية العصبية الأولية الفئران، نستعرض إمكانيات كبيرة لتصبح أداة قوية للموجة التفريق بين الود8. على الرغم من أن هذه الآلية لتعزيز عملية النداء الموحد للتمايز القومي ليست مفهومة تماما حتى الآن، لا التي تم إنشاؤها بواسطة قبعات وقد ثبت أن تكون عاملاً رئيسيا في العملية. في هذا العمل، ونحن نهدف إلى توفير بروتوكول تجريبي مفصلة لاستخدام بلازما هليوم/أكسجين ضغط الجوي الطائرات نفاثة لمعاملة الود في المختبروإعداد الخلايا والمعالجة المسبقة، مورفولوجيا الملاحظة بالمجهر المقلوب، و الأسفار مراقبة الفحص المجهري لتلطيخ الفلورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-خلية الثقافات وبريديفيرينتييشن

  1. زراعة الخلايا الجذعية العصبية وبريديفيرينتييشن
    1. إعداد كوفيرسليبس بولي-د-يسين-المغلفة. وضع ساترة عقيمة (20 ملم في القطر) في لوحة 12-جيدا. معطف الزجاج غطاء مع بولي-د-يسين، 0.1% w/v، في الماء (جدول المواد) لأفضل التصاق الخلايا على كوفيرسليبس باتباع الخطوات التالية.
      ملاحظة: يجب تحديد الظروف المثلى لكل خط الخلية والتطبيق.
      1. أسيبتيكالي معطف سطح ساترة مع بولي-د-يسين، 0.1% w/v، في المياه. روك بلطف لضمان طلاء حتى السطح ساترة.
      2. بعد استزراع بين عشية وضحاها (ح ~ 12) عند 37 درجة مئوية، إزالة الحل بولي-د-يسين وشطف السطح 3 x مع 1 مل الماء المعقم.
      3. الجاف في خلايا على الأقل 30 دقيقة قبل البذر منها.
  2. الثقافة C17.2 (C17.2-الأمن القومي) الخلايا الجذعية العصبية موريني وبريديفيرينتييشن
    1. احتضان الود C17.2 في 25 سم2 قارورة النسر معدلة دولبيكو في المتوسط (دميم) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 5% الحصان المصل (HS) والبنسلين/ستربتوميسين 1% في 37 درجة مئوية و 5% CO2 د ~ 2-3.
    2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 85%، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل التربسين الطازجة (0.25 في المائة) إلى قارورة. اتركه لمدة 1 دقيقة؛ ثم أضف 1 مل من الثقافة المتوسطة بقارورة وماصة صعودا وهبوطاً عدة مرات لضمان تعليق خلية مفردة.
    3. حساب كثافة الخلايا في تعليق استخدام هيموسيتوميتير. حساب حجم المطلوب من تعليق خلية لإعطاء تركيز خلية الأخيرة من 2 × 104 خلايا/مل.
    4. بذور C17.2-الود في كوفيرسليبس المغلفة في لوحة 12-جيدا مع الكثافة ~ 2 × 104 خلايا كل بئر. تحقق من كثافة الخلايا تحت مجهر.
      ملاحظة: للحصول على نتيجة أفضل، يجب أن تحدد كثافة الخلية المثلى قبل التجربة الفلورة.
    5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة خلية ح 12 للسماح لمرفق.
    6. بعد الإلحاق، تغسل الخلايا 2 x مع 1 مل من برنامج تلفزيوني وزراعة الخلايا بالتمايز المتوسطة تتألف من DMEM/F12 مع الملحق 1% N2 عن 48 ساعة قبل العلاج البلازما.
  3. ثقافة الخلايا الجذعية العصبية الأولية الجرذان وبريديفيرينتييشن
    1. الثقافة تعليق المتوسطة النمو الفئران مجلس الأمن القومي في قوارير T25 غير المصقول في كثافة 5 × 105 خلايا الفئران الأساسي مجلس الأمن القومي.
      ملاحظة: الفئران الابتدائي الود كانت معزولة بعد بروتوكول شيه et al. 9.
    2. تحقق من تكوين نيوروسفيريس تحت مجهر مقلوب. تأكد من أن يسلك مورفولوجية نيوروسفيريس مجمعات متعددة الخلايا كروية وشفافة.
    3. عندما تصل نيوروسفيريس إلى قطرها 3 مم أو أكبر، نقل تعليق نيوروسفيري إلى أنبوب الطرد المركزي العقيمة 15 مل وترك نيوروسفيريس تسوية بالجاذبية.
    4. إزالة المادة طافية بعناية لتترك في نيوروسفيريس في حجم أدنى من المتوسط.
    5. أشطف نيوروسفيريس 1 x مع 5 مل من برنامج تلفزيوني، والسماح نيوروسفيريس تسوية بالجاذبية. إزالة المادة طافية على ترك كمية الحد أدنى من برنامج تلفزيوني.
    6. إضافة كمية مناسبة من متوسطة التمايز لضبط كثافة الخلية إلى نيوروسفيريس ~ 12-15 في المليلتر. متوسطة التمايز للفئران الابتدائي الود يتكون من DMEM/F12 و 2% B27 و 1% FBS.
    7. البذور 1 مل تعليق نيوروسفيري على كل ساترة المغلفة في لوحة 12-جيدا.
      ملاحظة: اهتزاز لوحة برفق التأكد من أن نيوروسفيريس توزع بالتساوي. هذه الخطوة غير الحرجة للحصول على أفضل نتيجة الفلورة.
    8. ضع اللوحة في الحاضنة والسماح له بريديفيرينتياتي عن 24 ساعة قبل العلاج البلازما.

2-إعداد الطائرات البلازما

  1. اختر إدراج أنبوب كوارتز نصف مفتوحة مع قطرها داخلي من 2 مم وقطر خارجي من 4 مم. سلك الجهد العالي التي يبلغ قطرها 2 مم في الأنبوب.
  2. إدراج أنبوب الكوارتز مع أسلاك الضغط العالي في محقن 5 مل واستخدام حامل لتركيبها داخل مركز المحاقن. تعيين المسافة بين نهاية أنبوب الكوارتز مختومة ونصيحة حقنه 1 سم.
  3. توصيل أنبوب مطاط سيليكون 1 م (مع قطر داخلي 12 مم) إلى النهاية المفتوحة للمحاقن، وثم قم بتوصيله بصمام مقياس التدفق والغاز في التسلسل.

3-الحصول على الطائرات

  1. قم بتوصيل الدائرة كما هو موضح في الشكل 1. الاتصال سلك الإخراج من إمدادات الطاقة إلى جهاز البلازما النفاثة، وثم الاتصال غيض المسبار الفولت العالي مع سلك الإخراج للكشف عن التيار الكهربائي. توصيل الطرف الآخر من المسبار الفولت العالي للذبذبات لتسجيل معلومات الجهد الناتج. تحقق في الدائرة كلها وتأكد من ترتكز جميع إمدادات الطاقة والذبذبات والتحقيق ذات الجهد العالي.
  2. تحقق من خط الغاز. تأكد من أنه تم ربط أنبوب الغاز إلى جهاز البلازما النفاثة؛ ثم افتح صمام غاز الهليوم (حجم الكسر، 99.999 ٪) والأكسجين (حجم الكسر، 99.999%)، وضبط تدفق الغاز إلى 1 L:0.01 لتر في الدقيقة (أنه: س2).
    ملاحظة: تتيح تدفق الغاز لعدة دقائق قبل أن يتحول في الإمداد بالطاقة لأول مرة.
  3. تعيين مطال النبض، والتردد، وعرض النبض ك 8 كيلو فولت و 8 كيلو هرتز و ns 1600، على التوالي. تحقق الدائرة مرة أخرى، وبعد ذلك، بدوره على زر الإخراج لإنشاء طائرة بلازما.
    تنبيه: لا تلمس الأسلاك عالية الفلطية في أي وقت.

4-البلازما علاج الخلايا الجذعية العصبية

  1. تعيين المسافة بين الفوهة المحاقن وثقب الخلية جيدا إلى 15 ملم.
    ملاحظة: يتم قياس المسافة من أسفل المنصة حيث يتم وضع لوحة 12-جيدا.
  2. لوحة 12-جيدا خارج الحاضنة وتغيير وسيلة للخلايا بريديفيرينتياتيد إلى 800 ميليلتر من متوسطة التمايز الطازجة.
  3. تقسيم الخلايا إلى ثلاث مجموعات: مجموعة عنصر تحكم غير معالجة، و 60 s هو ويا غاز تدفق2 (1%) فريق علاج، ومجموعة علاج بلازما s 60.
    ملاحظة: توجد أي فقدان السائل واضحة بشرط المعاملة.
  4. ضع لوحة 12-البئر تحت الطائرات البلازما وتأكد من فوهة المحقن هو ثابت في المركز من كل حفرة وإعطاء العلاج ذات الصلة لمختلف الفئات المذكورة في الخطوة 4، 3.
    ملاحظة: أبقى عناصر التحكم غير المعالجة في متوسطة التمايز في درجة حرارة الغرفة أثناء إجراء تجريبي لضمان ظروف المعاملة الموحدة. مجموعة العلاج تدفق الغاز2 (1%) أنه ويا عولج بألا هو ويا2 (1%) تدفق الغاز، دون توليد البلازما. وينبغي إجراء جميع العلاجات في ثلاث نسخ.

5. تمايز الخلايا الجذعية العصبية

  1. وبعد العلاج، إزالة الثقافة الأصلية وإضافة 1 مل من جديد التمايز المتوسطة لكل بئر.
  2. احتضان الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 6 تغيير دال في المتوسط كل يوم.
  3. التحقق من حالة تمايز الجماعات المختلفة يوميا تحت مجهر خفيفة مقلوب مرحلة عالي تباين. عشوائياً تحديد الحقول على الأقل 12 والتقاط صور لتسجيل التغييرات الشكلية.

6-الفلورة تلطيخ

  1. الشطف
    1. أخذ العينات خارج الخلية الحاضنة وإزالة المتوسطة بالطموح. شطف الخلايا 1 x مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: بعد المفاضلة، الخلايا يتم بسهولة فصل. من الضروري إضافة برنامج تلفزيوني من الجانب من الآبار الثقافة لتجنب الغسيل خارج الخلايا.
  2. التثبيت
    1. إصلاح الخلايا مع 500 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد تثبيت البرنامج، بلطف شطف الخلايا 3 x مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، مدة كل منهما 5 دقائق لإزالة بارافورمالدهيد 4% المتبقية.
      ملاحظة: يجب تحديد النقطة الزمنية المثلى لتثبيت الخلية وفقا لأنواع الخلايا. بعد تثبيت البرنامج، أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني من الجانب من الآبار الثقافة وتترك العينة في الجدول لمدة 5 دقائق. لا تستخدم شاكر مختبر، للتأكد من فقدان الحد أدنى من الخلايا.
  3. بيرميبيليزيشن
    1. بيرميبيليزي العينات مع 0.2% 100 تريتونكس في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وبعد بيرميبيليزيشن، شطف الخلايا بلطف مع 1 مل برنامج تلفزيوني لثلاث مرات، مدة 5 دقائق كل.
      ملاحظة: يجب أن تحدد نقطة الوقت الأمثل للخلية permeabilization وفقا لأنواع الخلايا. بعد بيرميبيليزيشن، أضف 1 مل برنامج تلفزيوني من الجانب من الآبار الثقافة، ترك العينة في الجدول لمدة 5 دقائق. لا تستخدم شاكر مختبر للتأكد من فقدان الحد الأدنى من الخلايا.
  4. حظر
    1. أضف 1 مل مصل الماعز 10% في برنامج تلفزيوني لكل عينة وتترك العينة في الجدول من أجل ح 1 لمنع أي تفاعلات غير محدد.
      ملاحظة: لا تستخدم مختبر شاكر، لمنع الخلايا من فصلها من الشريحة. شطف ليس ضروريا في هذه الخطوة.
  5. الحضانة مع جسم الأولية
    1. تضعف جسم الأولية باستخدام المخزن المؤقت لتمييع جسم الأولية.
      ملاحظة: لتحقيق أفضل النتائج، يجب تحديد نسبة التخفيف النهائية من جسم الأولية قبل الاختبار الأولى. نسب تمييع نيستين المضادة (للخلايا الجذعية غير متمايزة)، ثالثا مكافحة-β-Tubulin (للخلايا العصبية)، O4 المضادة (أوليجوديندروسيتي)، ومكافحة--NF200 (للخلايا العصبية الناضجة)، دردشة المضادة (للخلايا العصبية اتروبين)، مكافحة--LHX3 (للخلايا العصبية الحركية)، غابا المضادة (ل جابايرجيك الخلايا العصبية)، السيروتونين المضادة (للخلايا العصبية هرمون السيروتونين)، ومكافحة ال (بالنسبة للخلايا العصبية تتميز) هي 1:80 1: 200، 1: 100، 1: 100، 1: 100، 1: 200، 1: 100، 1: 200 و 1: 100، على التوالي.
    2. تطبيق 300 ميليلتر من الأجسام المضادة الأساسي المخفف لعينات مختلفة.
    3. احتضان عينات الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: من المستحسن لاحتضان الأجسام الأولية في 4 درجات مئوية للحد من الخلفية وتلطيخ غير محدد.
    4. إزالة الأجسام المضادة الأولية وشطف بلطف الخلايا 3 x مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
  6. الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي
    1. تمييع الأضداد الثانوي مترافق Cy3 أو مترافق 488 فلور أليكسا استخدام مصل الماعز 3% في برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: لتحقيق أفضل النتائج، يجب تحديد نسبة التخفيف النهائية لجسم الثانوية حسب الاختبار الأولى.
    2. تطبيق 300 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة للكشف عن كل جسم الأولية.
      ملاحظة: جميع الخطوات اللاحقة التي تحتاج إلى القيام بها في الظلام لمنع تبريد الأسفار.
    3. تبني نموذج الخلية في الظلام ح 2 في درجة حرارة الغرفة.
    4. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وشطف الخلايا بلطف مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. تلطيخ النووية
    1. تطبيق 500 ميليلتر من هويشت 33258 العامل الحل أن تزج عينة خلية.
    2. تبني نموذج الخلية في الظلام لمدة 8 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتسمية الأنوية.
    3. شطف بلطف الخلايا 3 x مع 1 مل من برنامج تلفزيوني، 10 دقيقة كل، محمية من الضوء.
      ملاحظة: لفقدان الحد أدنى من الخلايا، الشرط الغسيل المثلى يجب أن يحدد تجريبيا.
  8. تصاعد
    1. ضع قطره واحدة من تصاعد المتوسطة في مركز ميكروسليدي.
    2. تتخذ من كوفيرسليبس (مع عينات) استخدام الملقط بعناية بوضع العينة على أعلى من المتوسط المتصاعدة. تجنب فقاعات الهواء.
    3. قم بإزالة أي وسط تصاعد الزائدة مع ورقة ماصة.
  9. ملاحظة مجهرية الأسفار
    1. مراقبة العينات تحت المجهر الأسفار مزودة بمرشحات هويشت 33258 و 488 فلور أليكسا Cy3. لكل عينة، عشوائياً تحديد الحقول على الأقل من 8-12 وسجل الصور مع كاميرا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ولوحظ مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر المقلوب كل يوم بعد العلاج CAP. ويبين الشكل 2 صور المجهر الخفيفة المرحلة المقلوب العادية-على النقيض من التفريق بين الخلايا في خطوط الخلايا على حد سواء. معارض المجموعة المعالجة بالبلازما بمعدل تسارع تمايز ونسبة تمايز عالية مقارنة بالمجموعة تدفق التحكم والغاز.

نتائج إيمونوفلوريسسينت C17.2-الود والفئران الابتدائي الود مثقف لمد 6 بعد العلاج يرد في الشكل 3 و رقم 4، على التوالي. نيستين (+، الأخضر) انخفضت، β-Tubulin الثالث (+، الأحمر) زيادة كبيرة، و O4 (+ الأخضر) زيادة طفيفة في كل خلية خطوط مقارنة بمجموعة التحكم. علاجات الحد الأقصى من 60 s تعزيز فعالية C17.2-الود إلى الخلايا العصبية النسب مقارنة بمجموعة العلاج تدفق الغاز والسيطرة على المجموعة. وقد تدفق الغاز النقي أي تأثير مرئي على التفريق بين مجلس الأمن القومي.

يبين الشكل 5 تحديد مصير الخلايا العصبية في مجموعة العلاج البلازما s 60. وقد لوحظت تعبيرات قوية NF200 (للخلايا العصبية الناضجة)، والدردشة (للعصبية اتروبين) و LHX3 (بالنسبة للخلايا العصبية الحركية). جابايرجيك وهرمون السيروتونين في الخلايا العصبية ونادراً ما شوهدت، بينما لم يتم الكشف عن لا من الخلايا العصبية تتميز.

Figure 1
الشكل 1 : التخطيطي للإعداد التجريبية. الجهاز البلازما النفاثة متصل بسلك الإخراج من إمدادات الطاقة ذات الجهد العالي. يتم استخدام مجس الجهد العالي مع الذبذبات للكشف عن الجهد الناتج. عندما تتدفق الغازات العامل عن طريق المحاقن والجهد العالي، سيتم إنشاء jet البلازما وتنتشر في الهواء الطلق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : عادي مقلوب صور المجهر الخفيفة مرحلة التباين الود C17.2 والفئران الابتدائي الود. وهذا الرقم مقتبس من شيونغ et al. 8 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : الكشف عن الفلورة من الود C17.2 غير المعالجة (على اليسار)، 60 s الغاز تدفق المعالجة C17.2-الود (الأوسط)، و 60 s البلازما المعالجة C17.2-NCSs (يمين) لمد 6 الثقافة. نيستين (+، الأخضر)/هويشت؛ Β-Tubulin الثالث (+، الأحمر)/هويشت؛ O4 (+، الأخضر)/هويشت. النووية ملطخة هويشت 33258. وهذا الرقم مقتبس من شيونغ et al. 8 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : الكشف عن الفلورة الفئران غير المعالجة الأولية الود (يسار) و 60 s الغاز تدفق المعالجة الأولية الفئران الود (الأوسط) 60 s المعالجة بالبلازما الابتدائي الفئران الود (يمين) لمد 6 الثقافة- نيستين (+، الأخضر)/هويشت؛ Β-Tubulin الثالث (+، الأحمر)/هويشت؛ O4 (+، الأخضر)/هويشت. النووية ملطخة هويشت 33258. وهذا الرقم مقتبس من شيونغ et al. 8 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : تحديد مصير الخلايا العصبية التي تدرسها الفلورة في مجموعة العلاج البلازما s 60- NF200 (+، أحمر)/هويشت؛ دردشة (+ الأحمر)/هويشت؛ LHX3 (+، أحمر)/هويشت؛ غابا (+ الأحمر)/هويشت؛ السيروتونين (+ الأحمر)/هويشت؛ ال (+ الأحمر)/هويشت. النووية ملطخة هويشت 33258. وهذا الرقم مقتبس من شيونغ et al. 8 مع الإذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C17.2--الود نوع خط الخلايا الجذعية العصبية مخلدة من خلايا الدماغ الطبقة الحبيبية الماوس الأطفال حديثي الولادة، التي وضعتها سنايدر وغيرها10،11. الود C17.2 يمكن أن تفرق في الخلايا العصبية، وأستروسيتيس، وأوليجوديندروسيتيس، وتستخدم على نطاق واسع في علم الأعصاب12. وفي دراستنا السابقة، يمكن أن تعزز قبعات التفريق بين الود C17.2 في الخلايا العصبية. كما أجريت دراسة إثبات لمبدأ باستخدام الود الفئران الأولية، وأثر تعرض البلازما على الفئران الابتدائي الود نوعيا مماثلة لتلك التي C17.2 الود، مع تفريق أقوى من الخلايا العصبية. قبعات، تكنولوجيا الفيزيائية رواية، قد تمثل أداة واعدة لعلاج الأمراض العصبية، مثل مرض الزهايمر، وشعبة المشتريات، وإصابات النخاع الشوكي وغيرها.

ويقدم العلاج كاب طريقة خطوة واحدة لتعزيز الأمن القومي C17.2 والفئران الأساسي مجلس الأمن القومي التمايز في المختبر مع فترة علاج قصيرة والقليل من تلف الخلايا. وعلاوة على ذلك، أظهرت النتائج ~ 75% توجيه التمايز في الخلايا العصبية، مما يجعل العلاج البلازما طريقة واعدة لزرع الأنسجة مستقبلا في العيادة. ومع ذلك، البروتوكول الحالي المعينين فقط نوع واحد من الأجهزة كاب للتمايز القومي. الحد من استخدام هذا ميكروبلاسما عند nonuniformity لوم البلازما يعامل لوحة 12-جيدا. العمل في المستقبل ستنظر باستخدام جهاز بلازما كبيرة الحجم أو متوسطة المنشط البلازما لمعاملة موحدة.

وهناك العديد من الخطوات الحاسمة ضمن البروتوكول. أولاً، كل خطوة الغسيل بعناية فلابد، ليتم فصل الخلايا بسهولة بعد المفاضلة. إجراءات التثبيت و permeabilization خطوات حاسمة أخرى في إيمونوستينينج. التثبيت ضروري للحفاظ على مورفولوجيا وأنتيجينيسيتي من الخلايا13. يسمح بيرميبيليزيشن الأجسام المضادة لربط المستضدات داخل الخلايا والنووية14. يجب أن تحدد نقطة للتثبيت و permeabilization الوقت الأمثل من خلال الاختبار الأولى. حضانة حجب وجسم الفلورة لا تقل أهمية كخطوات الغسيل لطيف. من المستحسن استخدام مصل الحيوان من نفس المصدر كجسم الثانوي لتغطية البروتينات الذاتية ملزمة غير محدد. لتحقيق أفضل النتائج، يجب تحديد نسبة التخفيف النهائية الضد من الاختبار الأولى. أما بالنسبة للعلاج البلازما، والجرعة البلازما يجب أن تطبق بدقة شديدة؛ سوف يحفز العلاج البلازما منذ فترة طويلة ومكثفة الخلية المبرمج أو نخر. ولذلك، يجب أن اﻷسئل وقت المعالجة والمسافة.

وباختصار، يوفر بروتوكول خطوة بخطوة لحفز التمايز القومي باستخدام طائرة نفاثة بلازما الغلاف الجوي هذه المخطوطة ويسلط الضوء على القضايا الحرجة أثناء العملية برمتها. أغطية يمكن تعزيز التفريق بين الود في الخلايا العصبية ووضوح سيكون مفيداً لعلاج الأمراض العصبية. كما أنها جديرة بالاهتمام ملاحظة أن البروتوكول الحالي يركز فقط على الأثر في المختبر من قبعات على الود. من الضروري إجراء دراسات في المستقبل لتقييم تأثير البلازما في فيفو باستخدام نماذج الماوس لإصابة العصب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل "هوا تشونغ الباحث البرنامج"، صندوق الابتكار المستقل لجامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2018KFYYXJJ071)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 31501099 و 51707012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip NEST 801008
Poly-D-lysine Beyotime P0128
DMEM medium HyClone SH30022.01B stored at 4 °C
DMEM/F12 medium HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
N2 supplement Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement Gibco 17504044 stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum HyClone SH30074.03 tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010 stored at 4 °C
Trypsin HyClone 25300054 stored at 4 °C
PBS solution HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
TritonX-100 Sigma T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution Vector Laboratories S-1000-20 stored at 4 °C
anti-Nestin Beyotime AF2215 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III Sigma Aldrich T2200 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4 R&D Systems MAB1326 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG 
12-well plate corning 3512
25 cm2 flask corning 430639
Hoechst 33258 Beyotime C1018 stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium Beyotime P0128 stored at -20 °C and protect from light
Light microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics Company XD-202
Fluorescence microscopy Nikon 80i
High – voltage Power Amplifier Directed Energy PVX-4110
DC power supply Spellman SL1200
Function Generator Aligent  33521A
Oscilloscope Tektronix DPO3034
High voltage probe Tektronix P6015A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
  2. Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
  3. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
  4. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
  5. Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
  6. Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
  7. Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
  8. Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
  9. Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
  10. Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
  11. Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
  12. Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).

Tags

الهندسة، العدد 143، البلازما الجو البارد، غاز التصريف، والخلايا الجذعية العصبية، التمايز، الفلورة، C17.2-الود، والود الفئران الأولية
تمايز الخلايا الجذعية العصب خطوة واحدة بلازما باردة الغلاف الجوي علاج <em>في المختبر</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve… More

Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e58663, doi:10.3791/58663 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter