Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

בידול תאי עצב באמצעות צעד אחד קר פלזמה אטמוספרי טיפול במבחנה

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58663
Automatic Translation
*1, *2, 3
1State Key Laboratory of Advanced Electromagnetic Engineering and Technology, Huazhong University of Science and Technology, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute/Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה שואפת לספק שלבים מפורטים ניסיוני של טיפול פלזמה אטמוספרי קר על תאי גזע עצביים וזיהוי immunofluorescence עבור שיפור בידול.

Abstract

כמו התפתחות הטכנולוגיה פלזמה הפיזי, פלזמות אטמוספרי קר (כמוסות) נחקרו באופן נרחב בטיהור, טיפול בסרטן, ריפוי פצעים, טיפול שורש, וכו ', יוצרים שדה מחקר חדש בשם פלזמה רפואה. להיות תערובת של מינים תגובתי חשמלית, כימית וביולוגית, כמוסות הראו את היכולות שלהם כדי לשפר עצב תאי גזע בידול בשני במבחנה והופך ויוו ואינם ניתנים דרך מבטיחה לטיפול מחלה נוירולוגית בעתיד. בחדשות הרבה יותר מרגשת היא באמצעות כמוסות עשויים להבין בשלב אחד, בבטחה ביים, התמיינות של תאי גזע עצביים (NSCs) בשביל לרקמות תחבורה. נדגים כאן הפרוטוקול ניסיוני מפורט של שימוש בהתקן שווי מטוס מתוצרת עצמית לשיפור לבטחון לאומי בידול C17.2-NSCs, תאי גזע עצביים החולדה הראשית, וכן התבוננות גורל התא על ידי הפוכה של קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ. עם העזרה של immunofluorescence מכתים טכנולוגיה, מצאנו שני NSCs את הראה שיעור דיפרנציאלית מואצת יותר בקבוצה ללא טיפול, ~ 75% NSCs מובחן באופן סלקטיבי נוירונים, אשר הינם בעיקר בוגרים, שימוש, מנוע נוירונים.

Introduction

הבידול בבימויו של NSCs לתוך שושלת מסוימים לתחבורה רקמות נחשב של טיפולים המבטיחים ביותר עבור מחלות ניווניות, neurotraumatic1. לדוגמה, נוירונים דופאמין catecholaminergic הם בעיקר הרצוי לטיפול מחלת פרקינסון (PD). עם זאת, שיטות מסורתיות כדי להכין את התאים הרצויים עבור תחבורה יש חסרונות רבים, כגון כמות רעילה, היווצרות צלקת או אחרים, ומחבלים במידה רבה את היישומים של NSCs רפואה רגנרטיבית2. לכן, זה ממש הכרחי למצוא הרומן דרך בטוחה עבור בידול לבטחון לאומי.

פלזמה היא המדינה הרביעית של עניינים, הבאים מוצק, נוזל וגז, היא מהווה יותר מ 95% של נושאים בעולם כולו. פלזמה חשמלית ניטרליים עם חיובי/שלילי לא מאוגד וחלקיקים נייטרלי, מופק בדרך כלל על ידי הפרשות מתח גבוה במעבדה. בשני העשורים האחרונים, היישום של פלזמה ב וההתערבות משכה תשומת לב אדירה ברחבי העולם וכן פיתוח טכנולוגי פלזמה קר לחץ אטמוספירי. בזכות זה פירות טכני, יציב בטמפרטורה נמוכה פלזמה יכול להיווצר באוויר הסובב על האווירה מבלי במערך קשת ומורכבת ממינים שונים תגובתי, כגון חנקן ונבדקים מינים (האחיות המוסמכות), מינים חמצן תגובתי (ROS), אולטרה סגול (UV) קרינה, אלקטרונים, יונים ושדה חשמלי3. כמוסות יש יתרונות ייחודיים עבור מיקרו-אורגניזם איון, טיפול בסרטן, פצע מרפא, טיפול של מחלות עור, התפשטות תאים תאים בידול4,5,6,7. בעבודה הקודמת, הפגנו פלזמה אטמוספרי קר jet יכול לשפר את הבידול של NSCs תאי גזע עצביים מאתר C17.2 (C17.2-NSCs) והן תאי גזע עצביים החולדה הראשית, מפגין פוטנציאל גדול להפוך לכלי רב עוצמה בוים הבידול של NSCs8. למרות המנגנון של שיפור שווי של בידול לבטחון לאומי אינה מובנת במלואה, שנוצר על ידי אותיות לא הוכח להיות גורם מפתח בתהליך. בעבודה זו, אנו שואפים לספק פרוטוקול נסיוני מפורט של השימוש של פלזמה הליום/חמצן אטמוספרי סילון לטיפול NSCs במבחנה, הכנה תא, רעלני, מורפולוגיה תצפית על ידי מיקרוסקופ הפוכה, ו קרינה פלואורסצנטית התבוננות מיקרוסקופית של immunofluorescence מכתים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. התא תרבויות Predifferentiation

  1. תאי גזע עצביים ותרבות predifferentiation
    1. להכין coverslips זכוכית אקרילית-D-ליזין-מצופה. לשים על coverslip סטרילי (20 מ מ קוטר) על פלטה 12-. טוב. מעיל הזכוכית המכסה עם פולי-D-ליזין, 0.1% w/v, במים (טבלה של חומרים) עבור אדהזיה תא טוב יותר על coverslips על-ידי ביצוע השלבים הבאים.
      הערה: תנאים אופטימליים להיקבע עבור כל שורת התאים וכל יישום.
      1. גילוח ורחיצה כירורגית מעיל פני coverslip עם פולי-D-ליזין, 0.1% w/v, במים. רוק בעדינות כדי לוודא ציפוי מבטל גם את פני השטח של coverslip.
      2. לאחר culturing לילה (~ 12 h) ב 37 מעלות צלזיוס, להסיר את הפתרון פולי-D-ליזין ולשטוף את פני השטח 3 x עם 1 מ ל מים סטריליים.
      3. יבש את התאים לפחות 30 דקות לפני זריעה אותם.
  2. תרבות C17.2 (C17.2-NSC) מאתר תאי גזע עצביים, predifferentiation
    1. דגירה C17.2-NSCs בבקבוקון2 25 ס מ בינוני הנשר של Dulbecco ששונתה (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 5% הסוס סרום (HS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור d ~ 2-3.
    2. כאשר התאים מגיעים למפגש 85%, להסיר את המדיום, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין טריים (0.25%) לתוך הבקבוק. תשאיר את זה עבור 1 דקות; לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של תרבות בינוני את הבקבוק, פיפטה לאורך מספר פעמים כדי לוודא השעיה תא בודד.
    3. לספור את צפיפות התאים ההשעיה באמצעות hemocytometer. לחשב את הנפח הנדרש של תא ההשעיה לתת ריכוז התא האחרון של עונה 2 פרק 104 תאים/מ ל....
    4. זרע C17.2-NSCs-coverslips מצופה בצלחת 12-ובכן עם הצפיפות של ~ 2 x 104 תאים לכל טוב. בדוק את צפיפות התאים במיקרוסקופ.
      הערה: לקבלת תוצאה טובה יותר, צפיפות תא אופטימלית להיקבע לפני הניסוי immunofluorescence.
    5. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה תא במשך 12 שעות לאפשר את הקובץ המצורף.
    6. לאחר מצורף, לשטוף את התאים 2 x עם 1 מ"ל של PBS ולטפח את התאים בינונית בידול המורכב DMEM/F12 עם תוספת של 1% N2 במשך 48 שעות לפני הטיפול פלזמה.
  3. Predifferentiation והתרבות של תאי גזע עצביים החולדה הראשית
    1. תרבות ההשעיה החולדה הראשית לבטחון לאומי בשנת החולדה לבטחון לאומי מדיום הגידול במבחנות T25 ללא ציפוי-צפיפות של תאים5 5 x 10.
      הערה: החולדה הראשית NSCs היו מבודדים בעקבות הפרוטוקול של שייה. et al. 9.
    2. בדוק את היווצרות neurospheres תחת מיקרוסקופ הפוכה. ודא שהמורפולוגיה של neurospheres מוצגים מתחמי multicellular כדורית ושקופה.
    3. כאשר neurospheres להגיע בקוטר 3 מ מ או יותר, להעביר את המתלים neurosphere שפופרת צנטרפוגה סטרילי 15 מ"ל ולתת neurospheres להתיישב על ידי הכבידה.
    4. הסר את תגובת שיקוע בקפידה כדי להשאיר את neurospheres נפח מינימלי של המדיום.
    5. לשטוף את neurospheres 1 x 5 מ של PBS ולתת neurospheres להתפשר על ידי הכבידה. הסר את תגובת שיקוע לעזוב נפח מינימלי של PBS.
    6. להוסיף נפח מתאים של בידול בינוני כדי להתאים את צפיפות התאים כדי ~ 12-15 neurospheres למיליליטר. המדיום הבידול העיקרי העכברוש NSCs מורכב DMEM/F12, 2% B27, ו- 1% FBS.
    7. זרעי 1 מ"ל של השעיה neurosphere על גבי כל אחד מצופה coverslip בצלחת 12-. טוב.
      הערה: לנער את הצלחת בעדינות כדי להבטיח neurospheres מופצים בצורה שווה. שלב זה הוא קריטי לקבלת תוצאה טובה יותר immunofluorescence.
    8. למקם את הצלחת לתוך החממה ולאפשר predifferentiate במשך 24 שעות לפני הטיפול פלזמה.

2. הכנת מטוסי פלזמה

  1. בחר צינור פתוח למחצה קוורץ עם קוטר פנימי של 2 מ מ, קוטר חיצוני של 4 מ מ. להוסיף חוט מתח גבוה בקוטר של 2 מ מ לתוך הצינור.
  2. הכנס את הצינור קוורץ עם החוט מתח גבוה לתוך מזרק 5 מ ל ולהשתמש בעל כדי לטעון אותו בתוך המרכז של המזרק. לקבוע את המרחק בין קצה הצינור קוורץ אטום לבין קצה המזרק 1 ס מ.
  3. להתחבר צינור גומי סיליקון 1 מ' (עם הקוטר הפנימי של 12 מ מ) הקצה הפתוח של המזרק ולהתחבר, ואז, זה השסתום זרימה וגז ברצף.

3. רכישת מטוסי

  1. חבר את המעגל כמוצג באיור1. את החוט פלט של ספק הזרם ןקתהל פלזמה סילון, לאחר מכן, חבר את קצה המכשיר מתח גבוה עם החוט פלט כדי לזהות את המתח. חבר את הקצה השני של המכשיר מתח גבוה אוסצילוסקופ לרשום את המידע של המתח. בדוק את כל המסלול ולוודא שאת אספקת החשמל, אוסצילוסקופ את החללית מתח גבוה כולכם מקורקעים.
  2. בדוק את הגז. ודא שהשפופרת חובר למכשיר הפלזמה סילון; לאחר מכן, פתח שסתום הגז של הליום (שבר נפח, 99.999%) וחמצן (שבר נפח, 99.999%), מוגדר זרימת הגז 1 L:0.01 L/min (2הוא: O).
    הערה: תן זרימת הגז למשך מספר דקות לפני הפעלת הכוח בפעם הראשונה.
  3. הגדר את הדופק משרעת בתדר, רוחב 8 kV 8 kHz, 1600 ns, בהתאמה. . בדוק שוב המעגל והפעל, ואז, לחצן ' פלט ' כדי ליצור מטוס פלזמה.
    התראה: אל תיגע החוט מתח גבוה בכל עת.

4. פלזמה לטיפול תאי גזע עצביים

  1. קבעו את המרחק בין הצינור של המזרק החור תא טוב עד 15 מ מ.
    הערה: המרחק נמדד מהחלק התחתון של פלטפורמת היכן ממוקם לוח 12-. טוב.
  2. לוקח את הצלחת. ובכן 12 מתוך החממה ושנה את המדיום של התאים predifferentiated µL 800 של בידול טרי בינוני.
  3. התאים מתחלקים לשלוש קבוצות: קבוצת הבקרה שלא טופלו 60 s הוא-ו-O2 (1%) גז זרימה טיפול קבוצה, קבוצת טיפול פלזמה 60 s.
    הערה: יש ללא אובדן נוזלים ברור תחת התנאי טיפול.
  4. למקם את הצלחת 12-ובכן תחת הג'טס פלזמה, ודא שהזרבובית המזרק הוא קבוע במרכז כל חור ולתת את הטיפול הרלוונטי לקבוצות שונות שהוזכר בשלב 4.3.
    הערה: הפקדים לא מטופל הוחזקו במדיום בידול בטמפרטורת החדר במהלך ההליך ניסיוני כדי להבטיח תנאי טיפול אחיד. קבוצת הטיפול הוא-ו-O זרימת גז2 (1%) טופלה רק הוא ואת זרימת גז O2 (1%), ללא פלזמה הדור. כל הטיפולים צריכה להתבצע דולר.

5. התמיינות תאי גזע עצביים

  1. לאחר הטיפול, להסיר את התרבות המקורית ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום חדש בידול מכל קידוח.
  2. דגירה התאים בחממה ב CO 37 ° C ו-5%2 עבור 6 ד לשנות המדיום בכל יום אחר.
  3. לבדוק את מצב בידול של קבוצות שונות מדי יום תחת מיקרוסקופ אור שלב הפוכה-ניגודיות. באופן אקראי לבחור שדות לפחות 12, לצלם להקליט את שינויים מורפולוגיים.

6. immunofluorescence מכתים

  1. שטיפה
    1. לקחת את הדגימות מתוך החממה תא ולהסיר את המדיום על ידי השאיפה. לשטוף את התאים 1 x 1 מ ל- PBS.
      הערה: לאחר הבידול, התאים בקלות מנותקים. זה הכרחי להוסיף את PBS מהצד של הבארות תרבות כדי להימנע לשטוף את התאים.
  2. קיבעון
    1. לתקן את התאים עם 500 µL של 4% paraformaldehyde למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הקיבעון, לשטוף בעדינות את התאים 3 x עם 1 מ"ל ל- PBS, 5 דקות כל אחת, כדי להסיר את paraformaldehyde 4% שיורית.
      הערה: נקודת הזמן האופטימלי עבור קיבוע תא צריכה להיקבע על פי סוגי תאים. לאחר הקיבעון, להוסיף 1 מ"ל של PBS מהצד של הבארות תרבות ולהשאיר את הדגימה על השולחן במשך 5 דקות. אל תשתמש מטרף מעבדה, כדי להבטיח הפסד מינימלי של תאים.
  3. Permeabilization
    1. Permeabilize את הדגימות עם 0.2% TritonX-100 ב- PBS 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר permeabilization, יש לשטוף את התאים בעדינות עם 1 מ"ל PBS עבור שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד.
      הערה: נקודת הזמן האופטימלי עבור תא permeabilization צריכה להיקבע על פי סוגי תאים. לאחר permeabilization, להוסיף 1 מ"ל PBS מהצד של הבארות תרבות, להשאיר את הדגימה על השולחן במשך 5 דקות. אל תשתמש מטרף מעבדה כדי להבטיח אובדן מינימלי של תאים.
  4. חסימת
    1. להוסיף 1 מ"ל של נסיוב עז 10% ב- PBS כל מדגם ולהשאיר את הדגימה בטבלה 1 h כדי לחסום את כל אינטראקציות לא ספציפית.
      הערה: אין להשתמש מטרף מעבדה, כדי למנוע את התאים של ניתוק של השקופית. שטיפה אין צורך בשלב זה.
  5. הדגירה עם נוגדן ראשוני
    1. לדלל נוגדן ראשוני באמצעות נוגדן ראשוני דילול מאגר.
      הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, יחס דילול הסופי של הנוגדן הראשי חייב להיקבע על ידי pretest. יחס דילול של אנטי-Nestin (עבור מובחן תאי גזע), אנטי-β-טובולין III (עבור נוירון), אנטי-O4 (עבור אוליגודנדרוציטים), אנטי-NF200 (עבור נוירונים בוגרים), אנטי-צ'אט (עבור שימוש הנוירונים), אנטי-LHX3 (עבור מוטורי לגלוקוז), אנטי-GABA (עבור GABAergic הנוירונים), סרוטונין נגד (עבור נוירונים תכולה), ה-anti (עבור נוירונים דופאמין) הם 1:80, 1:200, בטחונות, בטחונות, בטחונות, 1:200, בטחונות, 1:200 ומטריים, בהתאמה.
    2. µL 300 של נוגדנים העיקרי מדולל חלות על מדגמים שונים.
    3. דגירה הדגימות תא בן לילה ב 4 º C.
      הערה: מומלץ דגירה נוגדנים הראשי ב 4 ° C כדי להפחית את הרקע ואת מכתים לא ספציפית.
    4. הסר את הנוגדנים העיקרי ולשטוף בעדינות את התאים 3 x עם 1 מ"ל ל- PBS.
  6. הדגירה עם נוגדנים משניים
    1. לדלל הנוגדנים משני Cy3 מצומדת או מצומדת אלקסה עבור חיל הים 488 שימוש בסרום עז 3% ב- PBS.
      הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, יחס דילול הסופי של הנוגדן המשני חייב להיקבע על ידי pretest.
    2. החל µL 300 של נוגדנים משניים הרלוונטיים כדי לזהות כל נוגדן ראשוני.
      הערה: כל השלבים הבאים צריך להתבצע בחושך כדי למנוע קרינה פלואורסצנטית שכבתה.
    3. דגירה המדגם תא בחושך 2 h בטמפרטורת החדר.
    4. הסר את הנוגדנים משני ולשטוף את התאים בעדינות עם 1 מ"ל של PBS 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. צביעת גרעינית
    1. החל µL 500 של הפתרון עובד Hoechst 33258 לטבול את דגימת תאים.
    2. דגירה המדגם תא בחושך 8 דקות בטמפרטורת החדר לתייג את הגרעינים.
    3. לשטוף בעדינות את התאים 3 x עם 1 מ"ל ל- PBS, 10 דקות כל אחד, מוגן מפני אור.
      הערה: עבור הפסד מינימלי של תאים, התנאי כביסה מיטביים להיקבע מדעית.
  8. הרכבה
    1. מקום טיפה אחת של הרכבה בינונית במרכז microslide.
    2. להוציא coverslips (עם דגימות) באמצעות פינצטה ומקם בזהירות את המדגם על המדיום הרכבה. להימנע בועות אוויר.
    3. הסר כל מדיום הרכבה עודף עם נייר סופג.
  9. התבוננות מיקרוסקופית קרינה פלואורסצנטית
    1. לבחון את הדגימות תחת מיקרוסקופיית פלורסצנטיות מצויד מסננים Hoechst 33258, 488 עבור חיל הים אלקסה של Cy3. עבור כל דגימה, בחר באופן אקראי תמונות רשומות ושדות לפחות 8-12 עם מצלמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מורפולוגיה תאים נצפתה תחת המיקרוסקופ הפוכה בכל יום לאחר הטיפול CAP. איור 2 מציג את הדימויים במיקרוסקופ אור רגיל ניגודיות שלב הפוכה הבידול תא בשתי השורות התא. הקבוצה שטופלו פלזמה תערוכות שיעור בידול מואצת, יחס התמיינות גבוהה לעומת הקבוצה זרימת גז ובקרה.

תוצאות immunofluorescent C17.2-NSCs, החולדה הראשית NSCs תרבותי עבור 6 d לאחר הטיפול מוצגים באיור 3 , איור 4, בהתאמה. Nestin (+, ירוק) ירד, השלישי β-טובולין (+, אדום) גדל באופן משמעותי, ו- O4 (+, ירוק) מעט מוגברת בשניהם תא קווי לעומת קבוצת הביקורת. כובע טיפולים של 60 s משופרת ביעילות את C17.2-NSCs לתוך שושלת היוחסין עצביים, לעומת קבוצת הביקורת וקבוצת טיפול זרימת גז. זרימת גז טהור היתה אין השפעה גלויה על הבידול לבטחון לאומי.

איור 5 מציגה את מפרט הגורל עצביים קבוצת טיפול פלזמה 60 s. ביטויים חזק של NF200 (עבור נוירון בוגר), צ'אט (עבור שימוש נוירון) ו LHX3 (עבור motor neuron) נצפו. GABAergic של הנוירונים תכולה היו נדירות, ואילו נוירונים דופאמין לא אותרו.

Figure 1
איור 1 : סכימטי של הסידור ניסיוני. המכשיר סילון פלזמה מחובר הכבל פלט הספקת חשמל מתח גבוה. החללית מתח גבוה עם אוסצילוסקופ משמש כדי לזהות את המתח. כאשר גזים עבודה זורמים דרך המזרק, מתח גבוה הוא על המטוס פלזמה ייווצר, להפיץ לאוויר הפתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : דופן הפוכה תמונות מיקרוסקופ אור בניגודיות שלב C17.2-NSCs, החולדה הראשית NSCs. נתון זה ממאמרו של Xiong. et al. 8 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : Immunofluorescence זיהוי של לא מטופל C17.2-NSCs (שמאל), גז s 60 זרימה שטופלו C17.2-NSCs (באמצע), ו-60 s פלזמה-טיפול C17.2-NCSs (מימין) 6 ד' של תרבות. Nestin (+, ירוק) / Hoechst; Β-טובולין השלישי (+, אדום) / Hoechst; O4 (+, ירוק) / Hoechst. הגרעין הוא מוכתם Hoechst 33258. נתון זה ממאמרו של Xiong. et al. 8 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : Immunofluorescence זיהוי של החולדה הראשית לא מטופל NSCs (משמאל), 60 s גז שטופלו הזרימה הראשי עכברוש NSCs (באמצע) ו- 60 s שטופלו פלזמה העיקרי עכברוש NSCs (מימין) בשביל 6 ד' של תרבות. Nestin (+, ירוק) / Hoechst; Β-טובולין השלישי (+, אדום) / Hoechst; O4 (+, ירוק) / Hoechst. הגרעין הוא מוכתם Hoechst 33258. נתון זה ממאמרו של Xiong. et al. 8 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : מפרט הגורל עצביים למד מאת immunofluorescence הקבוצה טיפול פלזמה 60 s. NF200 (+, אדום) / Hoechst; צ'אט (+, אדום) / Hoechst; LHX3 (+, אדום) / Hoechst; גאבא (+, אדום) / Hoechst; סרוטונין (+, אדום) / Hoechst; TH (+, אדום) / Hoechst. הגרעין הוא מוכתם Hoechst 33258. נתון זה ממאמרו של Xiong. et al. 8 עם הרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C17.2-NSCs הוא סוג של קו מונצחים תאי גזע עצביים מתאי שכבת פרטנית אסטרוציטומה העכבר neonatal, שפותחה על ידי שניידר ואחרים10,11. C17.2-NSCs יכולים להתמיין נוירונים, האסטרוציטים, ו אוליגודנדרוציטים, נמצאים בשימוש נרחב במדעי המוח12. במחקר הקודם שלנו, כמוסות יכול לשפר את הבידול של C17.2-NSCs לתוך הנוירונים. מחקר הוכחה של עקרון גם בוצע באמצעות עכבר ראשי NSCs, השפעת החשיפה פלזמה על החולדה הראשית NSCs היה דומה לזה של C17.2-NSCs, עם הבחנה חזקה יותר של נוירונים איכותית. כמוסות, physicochemical טכנולוגיה, עשוי לייצג כלי מבטיח טיפול מחלות נוירולוגיות, כגון מחלת אלצהיימר, PD, פגיעה בחוט השדרה ועוד.

שווי טיפול מציע דרך בשלב אחד כדי לשפר את C17.2 לבטחון לאומי והן החולדה הראשית לבטחון לאומי בידול במבחנה עם זמן טיפול קצר ונזק בתא קטן. יתר על כן, התוצאות הראו % ~ 75 ביים בידול לתוך הנוירונים, אשר עשה טיפול פלזמה שיטה מבטיחה בעתיד רקמות השתלות במרפאה. עם זאת, בפרוטוקול הנוכחי גייסו רק סוג אחד של קאפ מכשירי בידול לבטחון לאומי. המגבלה של שימוש microplasma הזה הוא nonuniformity הפלומה פלזמה מתייחס את הצלחת 12-. טוב. העבודה תשקול באמצעות התקן פלזמה בנפח גדול או בינוני מופעל פלזמה לטיפול אחיד.

ישנם מספר שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. ראשית, כל שלב כביסה יש בזהירות לבצע, עבור התאים מנותקים בקלות לאחר הבידול. ההליכים של קיבוע ו- permeabilization הם צעדים קריטיים אחרים ב- immunostaining. הקיבעון יש צורך לשמר את המורפולוגיה antigenicity של תאים13. Permeabilization מאפשר נוגדנים לאגד אנטיגנים תאיים וגרעיני14. הזמן האופטימלי נקודת קיבוע, permeabilization צריכה להיקבע דרך pretest. הדגירה חסימה ו נוגדן immunofluorescence חשובים פחות שלבים כביסה עדינה. מומלץ להשתמש בסרום בעלי חיים מאותו מקור כמו הנוגדן משני כדי לכסות את החלבונים אנדוגני איגוד לא ספציפית. לקבלת תוצאות מיטביות, יחס דילול הסופי של הנוגדן חייב להיקבע על ידי pretest. לגבי הטיפול פלזמה, המינון פלזמה יש למרוח היטב; טיפול פלזמה ותיק ונמרץ יניעו תא אפופטוזיס או נמק. לכן, הטיפול הזמן והמרחק חייב להיות pretested.

לסיכום, כתב יד זה מספק נוהל שלב אחר שלב להשראת לבטחון לאומי בידול באמצעות סילון של פלזמה אטמוספרי, מדגיש בעיות קריטיות במהלך כל התהליך. כובעים יכול לשפר את הבידול של NSCs לתוך הנוירונים, ברור יהיה מועיל לטיפול של מחלות נוירולוגיות. זה גם ראוי לציין כי בפרוטוקול הנוכחי רק מתמקד במבחנה ההשפעה של כמוסות על NSCs. זה הכרחי ללימודים בעתיד להעריך את ההשפעה של פלזמה ויוו באמצעות העכבר מודלים של עצב פציעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית מלומד Huazhong, הקרן חדשנות עצמאית של אוניברסיטת Huazhong של המדע, הטכנולוגיה (מספר 2018KFYYXJJ071), את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין (' קט ' 31501099 ו- 51707012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip NEST 801008
Poly-D-lysine Beyotime P0128
DMEM medium HyClone SH30022.01B stored at 4 °C
DMEM/F12 medium HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
N2 supplement Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement Gibco 17504044 stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum HyClone SH30074.03 tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010 stored at 4 °C
Trypsin HyClone 25300054 stored at 4 °C
PBS solution HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
TritonX-100 Sigma T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution Vector Laboratories S-1000-20 stored at 4 °C
anti-Nestin Beyotime AF2215 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III Sigma Aldrich T2200 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4 R&D Systems MAB1326 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG 
12-well plate corning 3512
25 cm2 flask corning 430639
Hoechst 33258 Beyotime C1018 stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium Beyotime P0128 stored at -20 °C and protect from light
Light microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics Company XD-202
Fluorescence microscopy Nikon 80i
High – voltage Power Amplifier Directed Energy PVX-4110
DC power supply Spellman SL1200
Function Generator Aligent  33521A
Oscilloscope Tektronix DPO3034
High voltage probe Tektronix P6015A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
  2. Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
  3. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
  4. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
  5. Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
  6. Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
  7. Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
  8. Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
  9. Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
  10. Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
  11. Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
  12. Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).

Tags

הנדסה גיליון 143 פלזמות אטמוספרי קר גז פריקה תאי גזע עצביים בידול immunofluorescence C17.2-NSCs NSCs החולדה הראשית
בידול תאי עצב באמצעות צעד אחד קר פלזמה אטמוספרי טיפול <em>במבחנה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve… More

Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e58663, doi:10.3791/58663 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter