Summary
इस प्रोटोकॉल के लिए एक ठंड वायुमंडलीय प्लाज्मा उपचार की विस्तृत प्रयोगात्मक कदम तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और विभेद बढ़ाने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने पर प्रदान करना है ।
Abstract
शारीरिक प्लाज्मा प्रौद्योगिकी के विकास के रूप में, ठंड वायुमंडलीय प्लाज्मा (टोपियां) व्यापक रूप से प्रदूषित में जांच की गई है, कैंसर के उपचार, घाव हीलिंग, रूट कैनाल उपचार, आदि, एक नए अनुसंधान क्षेत्र के गठन प्लाज्मा दवा का नाम. बिजली, रासायनिक, और जैविक प्रतिक्रियाशील प्रजातियों में से एक मिश्रण होने के नाते, टोपियां उनकी क्षमता को बढ़ाने के लिए तंत्रिका स्टेम सेल दोनों विट्रो में और vivo में भिंनता है और स्नायविक रोग उपचार के लिए एक आशाजनक तरीका बन रहे है दिखाया गया है भविष्य में । अधिक रोमांचक खबर यह है कि टोपी का उपयोग कर एक कदम का एहसास हो सकता है, और सुरक्षित रूप से निर्देशित, तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव (ऊतक परिवहन के लिए एनएससी) । हम यहां एक स्व-निर्मित कैप जेट डिवाइस का उपयोग करने के लिए सी में एनएससी भेदभाव को बढ़ाने के विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदर्शन-एनएससी और प्राथमिक चूहे तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं, साथ ही साथ औंधा और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल भाग्य देख । इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला प्रौद्योगिकी की मदद के साथ, हम दोनों एनएससी अनुपचारित समूह की तुलना में एक त्वरित अंतर दर दिखाया पाया, और ~ ७५% एनएससी चुनिंदा ंयूरॉंस में विभेदित, जो मुख्य रूप से परिपक्व हैं, कोलीनर्जिक, और मोटर न्यूरॉन्स.
Introduction
निर्देशित एनएससी के ऊतक परिवहन के लिए एक निश्चित वंश में भेदभाव neurodegenerative और neurotraumatic रोगों के लिए सबसे होनहार चिकित्सा में से एक माना जाता है1। उदाहरण के लिए, catecholaminergic dopaminergic न्यूरॉन्स पार्किंसंस रोग (पीडी) उपचार में विशेष रूप से वांछित हैं । हालांकि, पारंपरिक तरीकों परिवहन के लिए वांछित कोशिकाओं को तैयार करने के लिए कई कमियां हैं, जैसे रासायनिक विषाक्तता, निशान गठन, या दूसरों को, जो काफी हद तक में एनएससी के अनुप्रयोगों में बाधा होती है अपक्षयी दवा2. इसलिए, यह एक उपंयास और एनएससी भेदभाव के लिए सुरक्षित तरीका खोजने के लिए बहुत आवश्यक है ।
प्लाज्मा मामलों की चौथी राज्य है, ठोस, तरल और गैस के बाद, और यह पूरे ब्रह्मांड में मामलों के ९५% से अधिक का गठन किया । प्लाज्मा असीम सकारात्मक/नकारात्मक और तटस्थ कणों के साथ विद्युत तटस्थ है और आमतौर पर प्रयोगशाला में एक उच्च वोल्टेज निर्वहन द्वारा उत्पंन होता है । पिछले दो दशकों में, चिकित्सा में प्लाज्मा के आवेदन शीत वायुमंडलीय दबाव प्लाज्मा प्रौद्योगिकी के विकास के रूप में दुनिया भर में भारी ध्यान आकर्षित किया है । इस कलाओं के लिए धन्यवाद, स्थिर कम तापमान प्लाज्मा चाप गठन के बिना वातावरण में आसपास के हवा में उत्पन्न किया जा सकता है और इस तरह प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजातियों (RNS), प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS), पराबैंगनी (यूवी) के रूप में विभिन्न प्रतिक्रियाशील प्रजातियों के होते हैं विकिरण, इलेक्ट्रॉनों, आयनों, और बिजली के क्षेत्र3. कैप्स सूक्ष्म जीव निष्क्रियता, कैंसर चिकित्सा, घाव भरने, त्वचा रोगों के उपचार, सेल प्रसार, और सेल विभेद4,5,6,7के लिए अद्वितीय लाभ है । पिछले काम में, हम का प्रदर्शन किया है कि ठंड वायुमंडलीय प्लाज्मा जेट दोनों murine तंत्रिका स्टेम सेल सी 17.2 (सी 17.2-एनएससी) और प्राथमिक चूहे तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं में एनएससी के भेदभाव में वृद्धि कर सकते हैं, के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बनने के लिए एक महान क्षमता का प्रदर्शन निर्देशित एनएससी का विभेद८. हालांकि एनएससी भेदभाव की टोपी बढ़ाने के तंत्र को पूरी तरह से अभी तक समझ में नहीं है, कोई टोपियां द्वारा उत्पंन करने की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कारक साबित किया गया है । इस काम में, हम एनएससी के उपचार के लिए एक वायुमंडलीय दबाव हीलियम/ऑक्सीजन प्लाज्मा जेट का उपयोग कर के एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदान करने के उद्देश्य इन विट्रो, सेल तैयारी और उपचार, औंधा माइक्रोस्कोप द्वारा आकृति विज्ञान अवलोकन, और इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपिक अवलोकन ।
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Protocol
1. सेल संस्कृतियों और भेदभाव
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तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति और भेदभाव
- पॉली-डी-lysine-लेपित coverslips तैयार करें । एक 12-अच्छी तरह से थाली में एक बाँझ coverslip (व्यास में 20 मिमी) रखो । कोट पाली के साथ कवर ग्लास-डी-lysine, ०.१% w/v, पानी में (सामग्री तालिका) अगले चरणों का पालन करके coverslips पर बेहतर सेल आसंजन के लिए ।
नोट: प्रत्येक कक्ष पंक्ति और अनुप्रयोग के लिए इष्टतम शर्तें निर्धारित की जानी चाहिए ।- Aseptically कोट पाली-डी-lysine के साथ coverslip की सतह, पानी में ०.१% w/ धीरे रॉक coverslip सतह की एक भी कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए ।
- ३७ ° c पर रातोंरात संवर्धन (~ 12 एच) के बाद, पाली-डी-lysine समाधान निकालें और 1 मिलीलीटर बाँझ पानी के साथ सतह 3x कुल्ला ।
- उन्हें बोने से पहले कोशिकाओं को न्यूनतम 30 min में सुखा लें ।
- पॉली-डी-lysine-लेपित coverslips तैयार करें । एक 12-अच्छी तरह से थाली में एक बाँझ coverslip (व्यास में 20 मिमी) रखो । कोट पाली के साथ कवर ग्लास-डी-lysine, ०.१% w/v, पानी में (सामग्री तालिका) अगले चरणों का पालन करके coverslips पर बेहतर सेल आसंजन के लिए ।
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Murine तंत्रिका स्टेम सेल सी 17.2 (सी 17.2-एनएससी) संस्कृति और भेदभाव
- मशीन सी 17.2-एनएससी में एक 25 सेमी2 कुप्पी में Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक, 5% हार्स सीरम (एच एस), और 1% पेनिसिलिन/streptomycin पर ३७ ° c और 5% CO2 के लिए ~ 2-3 d.
- जब कोशिकाओं ८५% संगम तक पहुँचने, मध्यम निकालें, पंजाब की 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने और कुप्पी में ताजा trypsin (०.२५%) की 1 मिलीलीटर जोड़ें । 1 मिनट के लिए छोड़ दें; फिर, कुप्पी और पिपेट के ऊपर और नीचे कई बार एक ही सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए संस्कृति के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
- एक hemocytometer का उपयोग कर निलंबन में कोशिकाओं के घनत्व गिनती । 2 x 104 कोशिकाओं की एक अंतिम सेल एकाग्रता देने के लिए सेल निलंबन की आवश्यक मात्रा की गणना/
- बीज सी 17.2-एनएससी लेपित coverslips पर 12 में अच्छी तरह से थाली के घनत्व के साथ ~ 2 x 10 अच्छी तरह से प्रति4 कोशिकाओं । एक खुर्दबीन के नीचे सेल घनत्व की जांच करें ।
नोट: एक बेहतर परिणाम के लिए, इष्टतम कोशिका घनत्व इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोग से पहले निर्धारित किया जाना चाहिए । - 12 ज के लिए एक सेल मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन लगाव के लिए अनुमति देने के लिए ।
- लगाव के बाद, पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ 2x कोशिकाओं को धो और भेदभाव मध्यम DMEM/F12 के साथ 1% N2 पूरक के साथ कोशिकाओं की खेती के लिए प्लाज्मा उपचार से पहले ४८ ज ।
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प्राथमिक चूहे तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति और भेदभाव
- संस्कृति 5 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर कोट T25 कुप्पी में चूहा एनएससी विकास माध्यम में प्राथमिक चूहे एनएससी निलंबन ।
नोट: प्राथमिक चूहे एनएससी Xie एट अल के प्रोटोकॉल के बाद अलग थे । 9. - एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत neurospheres के गठन की जाँच करें. सुनिश्चित करें कि neurospheres की आकृति विज्ञान गोलाकार और पारदर्शी कोशिकीय परिसरों को दर्शाती है ।
- जब neurospheres 3 मिमी या बड़ा के एक व्यास तक पहुँचने, एक 15 मिलीलीटर बाँझ केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए neurosphere निलंबन स्थानांतरण और neurospheres गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करते हैं ।
- मध्यम की एक न्यूनतम मात्रा में neurospheres छोड़ने के लिए ध्यान से supernatant निकालें.
- neurospheres 1x को पंजाब के 5 मिलीलीटर से कुल्ला करें और neurospheres को गुरुत्वाकर्षण से सुलझा दें । supernatant को हटाने के लिए पंजाबियों की एक ंयूनतम मात्रा छोड़ दें ।
- milliliter प्रति ~ 12-15 neurospheres करने के लिए सेल घनत्व को समायोजित करने के लिए विभेदक मध्यम की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें । प्राथमिक चूहे एनएससी के लिए विभेदक मध्यम DMEM/F12, 2% B27, और 1% FBS के होते हैं ।
- बीज neurosphere निलंबन के 1 मिलीलीटर 12-वेल प्लेट में प्रत्येक लेपित coverslip पर ।
नोट: थाली धीरे से मिलाने के लिए सुनिश्चित करें कि neurospheres समान रूप से वितरित कर रहे हैं । यह चरण एक बेहतर इम्यूनोफ्लोरेसेंस परिणाम के लिए महत्वपूर्ण है । - मशीन में थाली प्लेस और यह प्लाज्मा उपचार से पहले 24 घंटे के लिए अंतर करने की अनुमति ।
- संस्कृति 5 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर कोट T25 कुप्पी में चूहा एनएससी विकास माध्यम में प्राथमिक चूहे एनएससी निलंबन ।
2. प्लाज्मा जेट विमानों की तैयारी
- 2 मिमी के एक आंतरिक व्यास और 4 मिमी के एक बाहरी व्यास के साथ एक आधा खुला क्वार्ट्ज ट्यूब चुनें । ट्यूब में 2 मिमी के व्यास के साथ एक उच्च वोल्टेज तार डालें ।
- एक 5 मिलीलीटर सिरिंज में उच्च वोल्टेज तार के साथ क्वार्ट्ज ट्यूब डालें और एक धारक का उपयोग करने के लिए यह सिरिंज के केंद्र के अंदर माउंट. 1 सेमी पर क्वार्ट्ज ट्यूब और सिरिंज टिप के सील अंत के बीच की दूरी निर्धारित करें ।
- एक 1 मीटर सिलिकॉन रबर पाइप (12 मिमी के एक भीतरी व्यास के साथ) सिरिंज के खुले अंत करने के लिए कनेक्ट और, तो, यह flowmeter और अनुक्रम में गैस वाल्व को कनेक्ट.
3. जेट विमानों का अधिग्रहण
- आरेख 1में दर्शाए अनुसार सर्किट कनेक्ट करें । प्लाज्मा जेट डिवाइस के लिए बिजली की आपूर्ति के उत्पादन तार कनेक्ट और, फिर, वोल्टेज का पता लगाने के लिए उत्पादन तार के साथ उच्च वोल्टेज जांच के टिप कनेक्ट. आउटपुट वोल्टेज की जानकारी रिकॉर्ड करने के लिए आस्टसीलस्कप करने के लिए उच्च वोल्टेज की जांच के दूसरे छोर से कनेक्ट करें । पूरे सर्किट की जांच करें और सुनिश्चित करें कि बिजली की आपूर्ति, आस्टसीलस्कप, और हाई वोल्टेज की जांच सभी जमीनी हैं ।
- गैस लाइन की जांच कराएंगे । सुनिश्चित करें कि गैस ट्यूब प्लाज्मा जेट डिवाइस से जोड़ा गया है; फिर, हीलियम के गैस वाल्व खोलने (मात्रा अंश, ९९.९९९%) और ऑक्सीजन (मात्रा अंश, ९९.९९९%) और गैस के प्रवाह सेट करने के लिए 1 L:0.01 L/मिनट (वह: O2) ।
नोट: पहली बार के लिए बिजली की आपूर्ति चालू करने से पहले कई मिनट के लिए गैस का प्रवाह करते हैं । - पल्स आयाम, आवृत्ति, और पल्स चौड़ाई 8 केवी, 8 kHz, और १६०० एनएस, क्रमशः के रूप में सेट करें । फिर से सर्किट की जांच करें और फिर, एक प्लाज्मा जेट बनाने के लिए उत्पादन बटन पर बारी ।
चेतावनी: किसी भी समय उच्च वोल्टेज तार को छूने नहीं है ।
4. तंत्रिका स्टेम सेल के प्लाज्मा उपचार
- सिरिंज के नोजल और सेल अच्छी तरह से 15 मिमी छेद के बीच की दूरी निर्धारित करें ।
नोट: दूरी जहां 12 अच्छी तरह से थाली रखा है मंच के नीचे से मापा जाता है । - मशीन से बाहर 12-अच्छी तरह से थाली ले लो और नए विभेदक मध्यम के ८०० µ एल के लिए विभेदित कोशिकाओं के माध्यम बदल जाते हैं ।
- तीन समूहों में विभाजित कोशिकाओं: एक अनुपचारित नियंत्रण समूह, एक ६० एस वह और-O2 (1%) गैस प्रवाह उपचार समूह, और एक ६० एस प्लाज्मा उपचार समूह ।
नोट: उपचार हालत के तहत कोई स्पष्ट तरल नुकसान नहीं है । - प्लाज्मा जेट विमानों के तहत 12-अच्छी तरह से थाली प्लेस, सुनिश्चित करें कि सिरिंज नोजल प्रत्येक छेद के केंद्र में तय हो गया है, और विभिंन चरण ४.३ में वर्णित समूहों के लिए प्रासंगिक उपचार दे ।
नोट: अनुपचारित नियंत्रण अंतर मध्यम में प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान कमरे के तापमान पर रखा गया था वर्दी उपचार की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए । वह और o2 (1%) गैस प्रवाह उपचार समूह केवल एक वह और ओ2 (1%) गैस प्रवाह के साथ इलाज किया गया, प्लाज्मा पीढ़ी के बिना । सभी उपचार तपसिल में किया जाना चाहिए ।
5. तंत्रिका स्टेम कोशिका विभेद
- उपचार के बाद, मूल संस्कृति को हटा दें और प्रत्येक अच्छी तरह से नए विभेदक के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
- मशीन में ३७ ° c और 5% CO2 के लिए 6 d. मध्यम हर दूसरे दिन बदलें ।
- एक उल्टे चरण-कंट्रास्ट प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत दैनिक विभिंन समूहों की भिंनता स्थिति की जांच करें । रूपात्मक परिवर्तन रिकॉर्ड करने के लिए यादृच्छिक रूप से कम से कम 12 फ़ील्ड्स का चयन करें और फ़ोटो लें ।
6. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
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Rinsing
- नमूने सेल मशीन से बाहर ले जाओ और आकांक्षा द्वारा माध्यम को दूर । पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ 1x की कोशिकाओं को कुल्ला ।
नोट: विभेदन के बाद कोशिकाएं आसानी से अलग हो जाती हैं । इस कल्चरल वेल्स की तरफ से पंजाबियों को जोड़ने के लिए जरूरी है कि वे कोशिकाओं को धोने से परहेज करें ।
- नमूने सेल मशीन से बाहर ले जाओ और आकांक्षा द्वारा माध्यम को दूर । पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ 1x की कोशिकाओं को कुल्ला ।
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निर्धारण
- कक्ष के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के ५०० µ एल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें । निर्धारण के बाद, धीरे से 1, 5 मिनट एक, अवशिष्ट 4% paraformaldehyde को दूर करने के लिए पंजाबियों की एक मिलीलीटर के साथ 3x कोशिकाओं कुल्ला ।
नोट: कक्ष निर्धारण के लिए इष्टतम समय बिंदु कक्ष प्रकार के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए । निर्धारण के बाद, संस्कृति कुओं के किनारे से पंजाबियों की 1 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए मेज पर नमूना छोड़ दें । कोशिकाओं का एक ंयूनतम नुकसान सुनिश्चित करने के लिए, एक प्रयोगशाला शेखर का उपयोग न करें ।
- कक्ष के तापमान पर 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde के ५०० µ एल के साथ कोशिकाओं को ठीक करें । निर्धारण के बाद, धीरे से 1, 5 मिनट एक, अवशिष्ट 4% paraformaldehyde को दूर करने के लिए पंजाबियों की एक मिलीलीटर के साथ 3x कोशिकाओं कुल्ला ।
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Permeabilization
- Permeabilize के नमूनों को ०.२% TritonX-१०० के लिए पंजाब में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर । permeabilization के बाद, तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1 एमएल पंजाबियों के साथ धीरे कोशिकाओं कुल्ला ।
नोट: कक्ष permeabilization के लिए इष्टतम समय बिंदु कक्ष प्रकारों के अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए । permeabilization के बाद, कल्चरल वेल्स की ओर से 1 मिलीलीटर पंजाबियों जोड़ें, 5 मिनट के लिए मेज पर नमूना छोड़ दें । कोशिकाओं की ंयूनतम हानि सुनिश्चित करने के लिए एक प्रयोगशाला शेखर का उपयोग न करें ।
- Permeabilize के नमूनों को ०.२% TritonX-१०० के लिए पंजाब में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर । permeabilization के बाद, तीन बार, 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1 एमएल पंजाबियों के साथ धीरे कोशिकाओं कुल्ला ।
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अवरुद्ध
- प्रत्येक नमूने के लिए पंजाब में 10% बकरी सीरम के 1 मिलीलीटर जोड़ें और किसी भी विशिष्ट बातचीत को ब्लॉक करने के लिए 1 ज के लिए मेज पर नमूना छोड़ दें ।
नोट: कक्षों को स्लाइड से अलग करने से रोकने के लिए, किसी प्रयोगशाला के शेखर का उपयोग न करें. एक कुल्ला इस कदम में आवश्यक नहीं है ।
- प्रत्येक नमूने के लिए पंजाब में 10% बकरी सीरम के 1 मिलीलीटर जोड़ें और किसी भी विशिष्ट बातचीत को ब्लॉक करने के लिए 1 ज के लिए मेज पर नमूना छोड़ दें ।
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प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन
- प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर का उपयोग प्राथमिक एंटीबॉडी पतला ।
नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी के अंतिम कमजोर पड़ने अनुपात के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए । विरोधी Nestin के कमजोर पड़ने अनुपात (विभेदित स्टेम सेल के लिए), विरोधी β-Tubulin III (न्यूरॉन के लिए), विरोधी O4 (oligodendrocyte के लिए), विरोधी NF200 (परिपक्व न्यूरॉन्स के लिए), विरोधी चैट (कोलीनर्जिक न्यूरॉन्स के लिए), विरोधी LHX3 (मोटर न्यूरॉन्स के लिए), विरोधी गाबा (के लिए GABAergic न्यूरॉन्स), विरोधी सेरोटोनिन (serotonergic न्यूरॉन्स के लिए), और विरोधी गु (dopaminergic न्यूरॉन्स के लिए) हैं 1:80, 1:200, 1:100, 1:100, 1:100, 1:200, 1:100, 1:200, और 1:100, क्रमशः. - अलग नमूनों के लिए पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के ३०० µ एल लागू करें ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कक्ष नमूने मशीन ।
नोट: यह पृष्ठभूमि और विशिष्ट धुंधला को कम करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी मशीन के लिए सिफारिश की है । - प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और धीरे से 1 पंजाबियों की मिलीलीटर के साथ 3x कोशिकाओं कुल्ला ।
- प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर का उपयोग प्राथमिक एंटीबॉडी पतला ।
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माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन
- Cy3-संयुग्मित या Alexa Fluor ४८८-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी पंजाब में 3% बकरी सीरम का उपयोग कर पतला ।
नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी के अंतिम कमजोर पड़ने अनुपात निर्धारित किया जाना चाहिए । - प्रत्येक प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए प्रासंगिक द्वितीयक एंटीबॉडी के ३०० µ एल लागू करें ।
नोट: प्रतिदीप्ति शमन रोकने के लिए सभी बाद के चरणों अंधेरे में प्रदर्शन किया जाना चाहिए । - कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए अंधेरे में सेल नमूना मशीन ।
- माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ धीरे से कोशिकाओं कुल्ला ।
- Cy3-संयुग्मित या Alexa Fluor ४८८-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी पंजाब में 3% बकरी सीरम का उपयोग कर पतला ।
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परमाणु धुंधलान
- सेल नमूना विसर्जित करने के लिए Hoechst ३३२५८ कार्य समाधान के ५०० µ एल लागू करें ।
- नाभिक लेबल करने के लिए कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए अंधेरे में सेल नमूना मशीन ।
- धीरे पंजाब के 1 मिलीलीटर, 10 मिनट प्रत्येक, प्रकाश से रक्षा के साथ 3x कोशिकाओं कुल्ला ।
नोट: कोशिकाओं की एक न्यूनतम हानि के लिए, इष्टतम धुलाई हालत empirically निर्धारित किया जाना चाहिए.
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बढ़ते
- microslide के केंद्र में बढ़ते मध्यम की एक बूंद प्लेस ।
- coverslips (नमूनों के साथ) चिमटी का उपयोग कर बाहर ले और ध्यान से बढ़ते माध्यम के शीर्ष पर नमूना स्थिति । हवा के बुलबुले से बचें ।
- शोषक कागज के साथ किसी भी अतिरिक्त बढ़ते मध्यम निकालें ।
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प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी प्रेक्षण
- Hoechst ३३२५८, Alexa Fluor ४८८, और Cy3 के लिए फिल्टर के साथ सुसज्जित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के तहत नमूनों का निरीक्षण करें । प्रत्येक नमूने के लिए, बेतरतीब ढंग से कम से 8-12 क्षेत्रों का चयन करें और एक कैमरे के साथ छवियों को रिकॉर्ड.
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Representative Results
सेल आकृति विज्ञान हर दिन उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत टोपी उपचार के बाद मनाया गया । चित्रा 2 दोनों सेल लाइनों में सेल भेदभाव के साधारण उल्टे चरण विपरीत प्रकाश माइक्रोस्कोप छवियों से पता चलता है । प्लाज्मा उपचार समूह एक त्वरित विभेदक दर और नियंत्रण और गैस प्रवाह समूह की तुलना में एक उच्च विभेद अनुपात प्रदर्शित करती है ।
सी 17.2 के immunofluorescent परिणाम-एनएससी और प्राथमिक चूहे एनएससी के लिए कल्चरल 6 डी के उपचार के बाद चित्रा 3 और चित्रा 4, क्रमशः में दिखाए जाते हैं । Nestin (+, हरा) कम, β-Tubulin III (+, लाल) काफी वृद्धि हुई है, और नियंत्रण समूह की तुलना में दोनों सेल लाइनों में O4 (+, हरा) थोड़ा बढ़ा । ६० एस के कैप उपचार प्रभावी रूप से सी बढ़ाकर 17.2-एनएससी ंयूरॉन वंश में नियंत्रण समूह और गैस प्रवाह उपचार समूह की तुलना में । शुद्ध गैस का प्रवाह एनएससी भेदभाव पर कोई असर नहीं दिख रहा था ।
चित्रा 5 ६० एस प्लाज्मा उपचार समूह में ंयूरॉन भाग्य विनिर्देश से पता चलता है । NF200 की मजबूत अभिव्यक्ति (परिपक्व ंयूरॉन के लिए), (के लिए कोलीनर्जिक ंयूरॉन) चैट, और LHX3 (के लिए मोटर ंयूरॉन) मनाया गया । GABAergic और serotonergic न्यूरॉन्स शायद ही कभी देखा गया, जबकि कोई dopaminergic न्यूरॉन्स का पता लगाया गया.
चित्रा 1 : प्रयोगात्मक सेट अप की योजनाबद्ध । प्लाज्मा जेट डिवाइस उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति के उत्पादन तार से जुड़ा हुआ है । आस्टसीलस्कप के साथ उच्च वोल्टेज की जांच के लिए उत्पादन वोल्टेज का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । जब काम गैसों सिरिंज के माध्यम से बह रहे हैं और उच्च वोल्टेज पर है, प्लाज्मा जेट उत्पन्न किया जाएगा और खुली हवा में प्रचार. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2 : साधारण उल्टे चरण-कंट्रास्ट हल्के माइक्रोस्कोप के लिए छवियां सी 17.2-एनएससी और प्राथमिक मूषक एनएससी । यह आंकड़ा Xiong एट अल से अनुकूलित है । 8 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3 : अनुपचारित सी की इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन सी 17.2-एनएससी (बाएं), ६० एस गैस प्रवाह-सी 17.2-एनएससी (मध्य), और ६० एस प्लाज्मा-इलाज सी 17.2-NCSs (सही) संस्कृति के 6 डी के लिए । Nestin (+, हरा)/Hoechst; β-Tubulin III (+, red)/Hoechst; O4 (+, हरा)/Hoechst. परमाणु Hoechst ३३२५८ के साथ दाग है । यह आंकड़ा Xiong एट अल से अनुकूलित है । 8 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : अनुपचारित प्राथमिक चूहे एनएससी के इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन (बाएं), ६० एस गैस प्रवाह प्राथमिक चूहा एनएससी (मध्य), और ६० एस प्लाज्मा इलाज प्राथमिक चूहा एनएससी (सही) के लिए 6 संस्कृति के डी । Nestin (+, हरा)/Hoechst; β-Tubulin III (+, red)/Hoechst; O4 (+, हरा)/Hoechst. परमाणु Hoechst ३३२५८ के साथ दाग है । यह आंकड़ा Xiong एट अल से अनुकूलित है । 8 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5 : ंयूरॉन भाग्य विनिर्देशन ६० एस प्लाज्मा उपचार समूह में इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा अध्ययन किया । NF200 (+, लाल)/Hoechst; चैट (+, लाल)/Hoechst; LHX3 (+, लाल)/Hoechst; गाबा (+, लाल)/Hoechst; सेरोटोनिन (+, लाल)/Hoechst; ध (+, लाल)/Hoechst. परमाणु Hoechst ३३२५८ के साथ दाग है । यह आंकड़ा Xiong एट अल से अनुकूलित है । 8 अनुमति के साथ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
सी 17.2-एनएससी नवजात माउस अनुमस्तिष्क दानेदार परत कोशिकाओं से अमर तंत्रिका स्टेम सेल लाइन का एक प्रकार है, स्नाइडर और अंय लोगों द्वारा विकसित10,11। सी 17.2-एनएससी ंयूरॉंस में अंतर कर सकते हैं, astrocytes, और oligodendrocytes और व्यापक रूप से12तंत्रिका विज्ञान में प्रयोग किया जाता है । हमारे पिछले अध्ययन में, टोपियां सी के विभेद को बढ़ा सकता है 17.2-एनएससी में ंयूरॉंस । एक सबूत के सिद्धांत का अध्ययन भी प्राथमिक चूहे एनएससी का उपयोग कर बाहर किया गया था, और प्राथमिक चूहे एनएससी पर प्लाज्मा जोखिम के प्रभाव के गुणात्मक सी के समान था 17.2-एनएससी, न्यूरॉन्स के एक मजबूत भेदभाव के साथ. कैप्स, एक उपंयास भौतिक प्रौद्योगिकी, स्नायविक रोग चिकित्सा के लिए एक आशाजनक उपकरण जैसे अल्जाइमर रोग, पीडी, रीढ़ की हड्डी की चोट, और दूसरों के रूप में प्रतिनिधित्व कर सकते हैं ।
कैप उपचार एक कम उपचार समय और थोड़ा सेल क्षति के साथ इन विट्रो में दोनों सी 17.2 एनएससी और प्राथमिक चूहे एनएससी भेदभाव को बढ़ाने के लिए एक कदम रास्ता प्रदान करता है । इसके अलावा, परिणाम एक ~ ७५% ंयूरॉंस में भेदभाव का निर्देशन दिखाया, जो प्लाज्मा उपचार क्लिनिक में भविष्य के ऊतकों प्रत्यारोपण के लिए एक होनहार विधि बनाया । हालांकि, वर्तमान प्रोटोकॉल केवल एनएससी भेदभाव के लिए कैप उपकरणों की एक प्रकार की भर्ती । इस microplasma का उपयोग करने की सीमा एकरूपता है जब प्लाज्मा बेर 12 अच्छी तरह से थाली व्यवहार करता है । भविष्य के काम एक बड़ी मात्रा प्लाज्मा डिवाइस या प्लाज्मा-वर्दी उपचार के लिए सक्रिय माध्यम का उपयोग करने पर विचार करेंगे ।
प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम हैं । सबसे पहले, प्रत्येक धुलाई कदम सावधानी से किया जाना चाहिए, कोशिकाओं के लिए आसानी से अलग विभेद के बाद कर रहे हैं । निर्धारण और permeabilization की प्रक्रियाओं immunostaining में अन्य महत्वपूर्ण कदम हैं. निर्धारण13कोशिकाओं की आकृति विज्ञान और antigenicity को संरक्षित करने के लिए आवश्यक है । Permeabilization intracellular और परमाणु एंटीजन14को बाइंड करने के लिए एंटीबॉडी की अनुमति देता है । निर्धारण और permeabilization के लिए इष्टतम समय बिंदु को पुनर्परीक्षण के माध्यम से निर्धारित किया जाना चाहिए । इम्यूनोफ्लोरेसेंस अवरुद्ध और एंटीबॉडी गर्मी के रूप में कोमल धोने कदम के रूप में महत्वपूर्ण हैं । यह अंतर्जात विशिष्ट बाध्यकारी प्रोटीन को कवर करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में एक ही स्रोत से पशु सीरम का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है. इष्टतम परिणामों के लिए, एंटीबॉडी के अंतिम कमजोर पड़ने अनुपात के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए । प्लाज्मा उपचार के लिए के रूप में, प्लाज्मा खुराक बहुत ध्यान से लागू किया जाना चाहिए; लंबे समय तक और तीव्र प्लाज्मा उपचार कोशिका apoptosis या परिगलन पैदा करेगा । इसलिए, उपचार के समय और दूरी का परीक्षण किया जाना चाहिए ।
संक्षेप में, इस पांडुलिपि एक वायुमंडलीय प्लाज्मा जेट का उपयोग करके एनएससी भेदभाव उत्प्रेरण के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करता है और पूरी प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण मुद्दों पर प्रकाश डाला गया । कैप्स न्यूरॉन्स में एनएससी के भेदभाव को बढ़ा सकते हैं और मस्तिष्क संबंधी रोगों के उपचार के लिए स्पष्ट रूप से फायदेमंद होगा । यह भी ध्यान दें कि मौजूदा प्रोटोकॉल केवल एनएससी पर टोपियां के इन विट्रो प्रभाव पर केंद्रित करने के लिए सार्थक है । यह भविष्य के अध्ययन के लिए आवश्यक है vivo में प्लाज्मा के प्रभाव का मूल्यांकन तंत्रिका चोट के माउस मॉडलों का उपयोग कर ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस कार्य को Huazhong विद्वान कार्यक्रम, Huazhong विश्वविद्यालय के विज्ञान एवं प्रौद्योगिकी (सं. 2018KFYYXJJ071) के स्वतंत्र नवाचार निधि, और चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१५०१०९९ और ५१७०७०१२) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
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