Summary
该方案旨在提供神经干细胞冷大气等离子体处理和免疫荧光检测的详细实验步骤, 以提高分化。
Abstract
随着物理等离子体技术的发展, 冷大气等离子体 (cap) 在去污、癌症治疗、创面愈合、根管治疗等方面得到了广泛的研究, 形成了一个新的研究领域--血浆医学。作为电、化学和生物反应物种的混合物, cap 已经证明了它们在体外和体内增强神经干细胞分化的能力, 正在成为神经疾病治疗的一种有希望的方法在未来。更令人兴奋的消息是, 使用 cap 可以实现一步, 并安全定向, 分化神经干细胞 (nsc) 的组织运输。本文演示了利用自制 cap 射流装置增强 c17.2-nsc 和原发性大鼠神经干细胞 nsc 分化的详细实验方案, 以及倒置显微镜和荧光显微镜观察细胞命运的实验方案。利用免疫荧光染色技术, 发现 nsc 均比未治疗组表现出加速差异率, ~ 75% 的 nsc 选择性分化为神经元, 主要是成熟的、胆碱能的和运动的。神经元。
Introduction
nsc 定向分化为一定的组织转运谱系被认为是治疗神经退行性疾病和神经创伤性疾病最有前途的方法之一。例如, 儿茶酚胺能多巴胺能神经元是帕金森病 (pd) 治疗中特别需要的。然而, 传统的方法, 准备所需的细胞运输有许多缺点, 如化学毒性, 疤痕形成, 或其他, 这在很大程度上阻碍了 nsc 在再生医学2的应用。因此, 寻找一种新颖、安全的 nsc 分化方法是非常必要的。
等离子体是继固体、液体和气体之后的第四种物质状态, 它占整个宇宙物质的95% 以上。等离子体与未结合的正向粒子/负粒子和中性粒子呈电中性, 通常由实验室中的高压放电产生。近二十年来, 随着冷大气压力等离子体技术的发展, 等离子体在生物医学中的应用受到了广泛的关注。通过这项技术, 可以在大气中的大气中产生稳定的低温等离子体, 而不会形成电弧, 它由各种活性物质组成, 如活性氮种 (rns)、活性氧物种 (ros)、紫外线 (uv)辐射、电子、离子和电场3。cap 在微生物失活、癌症治疗、伤口愈合、皮肤病治疗、细胞增殖和细胞分化4、5、6、7等方面具有独特的优势。在前面的研究中, 我们证明了冷大气等离子体射流可以增强 nsc 在小鼠神经干细胞 c17.2 (c17.2-nsc) 和原代大鼠神经干细胞中的分化, 显示出成为定向靶向的强大工具的巨大潜力。nsc8的分化。虽然目前还没有完全了解 nsc 分化的 cap 增强机制, 但 cap 产生的 no 已被证明是这一过程中的关键因素。在这项工作中, 我们的目的是提供一个详细的实验方案, 使用大气压力螺旋氧等离子体喷射器治疗 nsc 的体外, 细胞的制备和预处理, 形态学观察倒置显微镜,荧光显微镜观察免疫荧光染色。
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Protocol
1. 细胞培养和分化前
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神经干细胞培养与分化前
- 准备多 d-赖氨酸涂层盖板。将无菌盖板 (直径为20毫米) 放入12孔板中。将盖板玻璃涂上多 d-赖氨酸, 0.1% wv, 在水中 (材料表), 通过以下步骤在盖板上更好地粘附。
注: 必须为每个细胞系和应用确定最佳条件。- 在水中无菌地将盖滑层表面涂上多 d-赖氨酸, 0.1% wv。轻轻摇晃, 以确保覆盖表面的均匀涂层。
- 在37°c 下进行隔夜培养 (~ 12小时) 后, 去除多 d-赖氨酸溶液, 用1毫升的无菌水冲洗表面3倍。
- 在播种前, 将细胞干燥至少30分钟。
- 准备多 d-赖氨酸涂层盖板。将无菌盖板 (直径为20毫米) 放入12孔板中。将盖板玻璃涂上多 d-赖氨酸, 0.1% wv, 在水中 (材料表), 通过以下步骤在盖板上更好地粘附。
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小鼠神经干细胞 c17.2 (c17.2-nsc) 培养与分化前
- 在 dulbecco 改良鹰培养基 (dmem) 中, 用25厘米2瓶中培养 c17.2-nsc, 辅以10% 的胎牛血清 (fbs), 在37°c 时, 5% 马血清 (hs) 和1% 青霉素/链霉素 ~ 2-3 d.
- 当细胞达到85% 的融合时, 取出培养基, 用1毫升的 pbs 清洗细胞, 并在烧瓶中加入1毫升的新鲜胰蛋白酶 (0.25%)。离开它 1分钟;然后, 在烧瓶和移液器上下多次添加1毫升培养基, 以确保单细胞悬浮液。
- 使用血细胞仪计算悬浮液中细胞的密度。计算细胞悬浮液所需的体积, 使细胞的最终浓度为 2 x10 4 cellsl。
- 在12孔板上的涂层盖板上播种 c17.2-nsc, 每口井的密度为 ~ 2 x10 4个。在显微镜下检查细胞密度。
注: 为了获得更好的结果, 必须在免疫荧光实验之前确定最佳的细胞密度。 - 将细胞在37°c 时在细胞孵化器中孵育 12小时, 以便进行附着。
- 附着后, 用 pbs 1 毫升清洗细胞 2x, 在血浆治疗前48小时用 dmmm\ f12 和 1% n2 补充组成的分化培养基培养细胞。
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原发性大鼠神经干细胞培养与分化前
- 在密度为 5 x 10 5 的情况下, 在无涂层 t25 瓶中培养大鼠 nsc 生长介质中的原发大鼠 nsc 悬浮液。
注: 按照谢氏等人的协议, 分离出主要的大鼠 nsc .9个。 - 在倒置显微镜下检查神经球体的形成。确保神经球体的形态表现出球形和透明的多细胞复合物。
- 当神经球的直径达到3毫米或更大时, 将神经球悬浮液转移到15毫升无菌离心管中, 让神经球体通过重力沉淀。
- 小心地取出上清液, 使神经球处于最小的介质体积。
- 用 pbs 的5毫升冲洗神经球 1x, 让神经球通过重力沉淀。取出上清液, 留下最小的 pbs 体积。
- 加入合适的分化量, 将细胞密度调整到每毫升约12-15 个神经球。原发性大鼠 nsc 的分化培养基为 dmemmc2 f12、2% b27 和 1% fbs。
- 种子1毫升的神经球悬浮液到每个涂层覆盖在12孔板上。
注: 轻轻摇晃板, 以确保神经球体均匀分布。此步骤对于更好的免疫荧光结果至关重要。 - 将板放入孵化器, 使其在等离子体处理前提前24小时。
- 在密度为 5 x 10 5 的情况下, 在无涂层 t25 瓶中培养大鼠 nsc 生长介质中的原发大鼠 nsc 悬浮液。
2. 等离子喷射机的制备
- 选择内径为2毫米、外径为4毫米的半开石英管, 将直径为2毫米的高压导线插入管中。
- 用高压电线将石英管插入5毫升注射器中, 然后使用支架将其安装在注射器的中心内。将石英管的密封端与注射器尖端之间的距离设置为1厘米。
- 将1米硅橡胶管 (内径为12毫米) 连接到注射器的开口端, 然后依次将其连接到流量计和气阀。
3. 获取喷射机
- 连接电路, 如图 1所示。将电源的输出线连接到等离子喷射装置, 然后将高压探头的尖端与输出线连接, 以检测电压。将高压探头的另一端连接到示波器, 以记录输出电压的信息。检查整个电路, 确保电源、示波器和高压探头全部接地。
- 检查煤气管道。确保气体管已连接到等离子喷射装置;然后, 打开氦 (体积分数, 99.99%) 和氧气 (体积分数, 99.999%) 的气阀, 并将气体流量设置为 1 l:0.01 l/min (他:o 2)。
注: 在首次打开电源之前, 让气体流动几分钟。 - 将脉冲振幅、频率和脉冲宽度分别设置为 8 kv、8千赫和 1600 ns。再次检查电路, 然后打开输出按钮以创建等离子射流。
注意: 任何时候都不要接触高压电线。
4. 神经干细胞的血浆治疗
- 将注射器喷嘴与细胞井孔之间的距离设置为15毫米。
注: 距离是从放置12孔板的平台底部测量的。 - 将12孔板从孵化器中取出, 将预分化细胞的培养基改为800μl 的新鲜分化培养基。
- 将细胞分为三组: 未处理对照组、60度 he-o-2 (1% ) 气体流处理组和60秒等离子体处理组。
注: 在处理条件下没有明显的液体损失。 - 将12孔板置于等离子射流下, 确保注射器喷嘴固定在每个孔的中心, 并对步骤4.3 中提到的不同组进行相关处理。
注: 在实验过程中, 未经处理的控制在室温下保持在分化介质中, 以确保处理条件的均匀。he-o2 (1%) 气体流量处理组仅使用 he 和 o2 (1%) 气体流量处理, 不产生等离子体。所有的治疗都应一式三份。
5. 神经干细胞分化
- 处理后, 去除原有培养物, 在每口井中添加1毫升新的分化介质。
- 在37°c 和 5% co2 中孵育孵化器中的细胞, 每隔一天更换一次培养基。
- 在倒置相对比光显微镜下, 每天检查不同组的分化状态。随机选择至少12个字段并拍照记录形态变化。
6. 免疫荧光染色
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冲洗
- 从细胞孵化器中取出样品, 通过吸入去除培养基。用1毫升的 pbs 冲洗细胞1x。
注: 分化后, 细胞很容易分离。有必要从培养井的一侧添加 pbs, 以避免冲洗细胞。
- 从细胞孵化器中取出样品, 通过吸入去除培养基。用1毫升的 pbs 冲洗细胞1x。
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固定
- 在室温下将500μl 的 4% 甲醛的细胞固定20分钟。固定后, 用1毫升 pbs 轻轻冲洗细胞 3倍, 每次 5分钟, 去除残留的4% 的甲醛。
注: 细胞固定的最佳时间点必须根据细胞类型来确定。固定后, 从培养井的一侧加入1毫升的 pbs, 并将样品放在桌子上5分钟。不要使用实验室振动台, 以确保最小的细胞损失。
- 在室温下将500μl 的 4% 甲醛的细胞固定20分钟。固定后, 用1毫升 pbs 轻轻冲洗细胞 3倍, 每次 5分钟, 去除残留的4% 的甲醛。
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渗透率
- 在室温下, 在 pbs 中使用 0.2% TritonX-对样品进行敏化, 时间为10分钟。渗透后, 用1毫升 pbs 轻轻冲洗细胞 3次, 每次5分钟。
注: 必须根据电池类型确定细胞渗透的最佳时间点。渗透后, 从培养井的一侧添加1毫升 pbs, 将样品放在桌子上5分钟。不要使用实验室振动台, 以确保最小的细胞损失。
- 在室温下, 在 pbs 中使用 0.2% TritonX-对样品进行敏化, 时间为10分钟。渗透后, 用1毫升 pbs 轻轻冲洗细胞 3次, 每次5分钟。
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阻塞
- 在 pbs 中添加1毫升10% 山羊血清到每个样本中, 并将样品放在表中 1小时, 以阻止任何非特异性相互作用。
注: 不要使用实验室振动台, 以防止细胞脱离幻灯片。在此步骤中不需要冲洗。
- 在 pbs 中添加1毫升10% 山羊血清到每个样本中, 并将样品放在表中 1小时, 以阻止任何非特异性相互作用。
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与原代抗体的培养
- 使用初级抗体稀释缓冲液稀释原代抗体。
注: 为了获得最佳结果, 必须通过预检确定初级抗体的最终稀释率。抗奈斯汀 (未分化干细胞) 的稀释率, 抗β-tuulin iii (用于神经元)、抗 o4 (用于少突胶质细胞)、抗 nf200 (适用于成熟神经元)、抗 chat (适用于胆碱能神经元)、抗 lhx3 (用于运动神经元)、抗 gaba (用于少突胶质细胞)gab过敏神经元)、抗血清素 (用于血清素能神经元) 和抗 th (用于多巴胺能神经元) 分别为1:80、1:80、1:80、100、1:80、1:80、1:80 和 1: 100。 - 将300μl 稀释的原生抗体应用于不同的样品。
- 在4°c 下隔夜培养细胞样本。
注: 建议在4°c 孵育原代抗体, 以减少背景和非特异性染色。 - 取出原代抗体, 用1毫升的 pbs 轻轻冲洗细胞3倍。
- 使用初级抗体稀释缓冲液稀释原代抗体。
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用二级抗体进行培养
- 在 pbs 中使用3% 的山羊血清稀释 cy3 共轭或亚历克莎氟488共轭二级抗体。
注: 为了获得最佳结果, 二次抗体的最终稀释率必须通过预检来确定。 - 应用300μl 的相关二级抗体来检测每个初级抗体。
注: 所有后续步骤都需要在黑暗中执行, 以防止荧光淬火。 - 在室温下在黑暗中培养细胞样本2小时。
- 取出二级抗体, 用1毫升的 pbs 在室温下轻轻冲洗细胞10分钟。
- 在 pbs 中使用3% 的山羊血清稀释 cy3 共轭或亚历克莎氟488共轭二级抗体。
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核染色
- 应用 500μl hoechst 33258 工作溶液将细胞样品浸入。
- 在室温下在黑暗中培养细胞样本 8分钟, 以标记细胞核。
- 用1毫升的 pbs 轻轻冲洗细胞 3倍, 每个细胞 10分钟, 不受光线影响。
注: 对于最小的细胞损失, 必须根据经验确定最佳的洗涤条件。
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安装
- 将一滴安装介质放置在微晶的中心。
- 用推子从盖板 (带样品) 中取出, 并小心地将样品放在安装介质的顶部。避免气泡。
- 用吸水纸取出多余的安装介质。
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荧光显微镜观察
- 观察荧光显微镜下的样品, 其中配备了 hoechst 33258、亚历克莎 flor 488 和 cy3 的过滤器。对于每个示例, 随机选择至少8-12 个字段, 并用相机记录图像。
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Representative Results
在 cap 治疗后, 每天在倒置显微镜下观察细胞形态。图 2 显示了两个细胞系中细胞分化的普通倒置相对比光显微镜图像。与对照组和气体流组相比, 等离子处理组的分化速度加快, 分化率较高。
处理后培养 6 d 的 c17.2-nsc 和原代大鼠 nsc 的免疫荧光结果分别如图 3和 图 4所示。与对照组相比, 两个细胞系的 nestin (+, 绿色) 均显著减少, β-tubulin iii (+, 红色) 显著增加, o4 (+, 绿色) 略有增加。与对照组和气流处理组相比, 60秒的 cap 治疗有效地将 c17.2-nsc 增强为神经元谱系。纯气流对 nsc 分化无明显影响。
图 5显示了60秒等离子体治疗组的神经元命运指标。观察到 nf200 (成熟神经元)、at (胆碱能神经元) 和 lhx3 (运动神经元) 的强烈表达。gabaep 能神经元和血清素能神经元很少见, 而没有检测到多巴胺能神经元。
图 1: 实验装置示意图.等离子射流装置连接到高压电源的输出线上。采用带示波器的高压探头检测输出电压。当工作气体流经注射器并打开高压时, 等离子体射流将被产生并传播到露天。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: c17.2 nsc 和主要大鼠 nsc 的普通倒置相对比光显微镜图像.这个数字改编自熊等人.经允许。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 免疫荧光检测未经处理的 c17.2-ns (左)、60气体流处理的 c17.2-nsc (中) 和 60 s 等离子体处理的 c17.2-ncs (右) 6 d 培养.内斯汀 (+, 绿色)/hoechst;β-tuulin iii (+, 红色)/hoechst;o4 (+, 绿色)/hechststt。核被污染与 hoechst 33258。这个数字改编自熊等人.经允许。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 免疫荧光检测未经处理的原发性大鼠 nsc (左)、60气流处理的原发鼠 nsc (中) 和60例血浆处理的原发性大鼠 nsc (右) 6 d 培养.内斯汀 (+, 绿色)/hoechst;β-tuulin iii (+, 红色)/hoechst;o4 (+, 绿色)/hechststt。核被污染与 hoechst 33258。这个数字改编自熊等人.经允许。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 用免疫荧光法研究了60s 血浆治疗组的神经命运指标.nf200 (+, 红色)/hoechst;at (+, 红色)/hoechst;lhx3 (+, 红色)/hoechst;gaba (+, 红色)/hoechst;血清素 (+, 红色)/hoechst;th (+, 红色)/hechststd。核被污染与 hoechst 33258。这个数字改编自熊等人.经允许。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
c17.2-nsc 是由 snyder 等人开发的一种由新生小鼠小脑颗粒层细胞产生的不朽神经干细胞.c17.2-nsc 可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞, 广泛应用于神经科学12。在我们之前的研究中, cap 可以增强 c17.2-nsc 向神经元的分化。还使用原发性大鼠 nsc 进行了原理验证研究, 血浆暴露对原发性大鼠 nsc 的影响在质量上与 c17.2 nsc 相似, 神经元分化更强。cap 是一种新型的物理化学技术, 可能是神经疾病治疗的一个很有前途的工具, 如阿尔茨海默氏症、pd、脊髓损伤等。
cap 治疗提供了一个一步到位的方法, 以提高 c17.2 nsc 和原代大鼠 nsc 体外分化, 治疗时间短, 细胞损伤小。此外, 结果表明, 约75% 的定向分化为神经元, 使血浆治疗成为临床未来组织移植的一种有希望的方法。然而, 目前的协议只招募了一种类型的 cap 设备进行 nsc 区分。使用这种微等离子体的局限性在于等离子体羽流处理12井板时的不均匀性。今后的工作将考虑使用大容量等离子体装置或等离子体激活介质进行均匀处理。
协议中有几个关键步骤。首先, 每个清洗步骤都必须小心进行, 因为细胞在分化后很容易分离。固定和渗透的过程是免疫染色的其他关键步骤。这种固定是必要的, 以保持形态和抗原性的细胞13。渗透使抗体与细胞内抗原和核抗原结合 14。固定和渗透的最佳时间点必须通过预试来确定。免疫荧光阻滞和抗体培养与温和的洗涤步骤同样重要。建议使用与二级抗体相同来源的动物血清来覆盖内源性非特异性结合蛋白。为了获得最佳结果, 抗体的最终稀释率必须通过预检来确定。至于血浆处理, 血浆剂量必须非常仔细地使用;长期和激烈的血浆治疗会导致细胞凋亡或坏死。因此, 必须对治疗时间和距离进行预检。
总之, 这份手稿提供了一个循序渐进的协议, 通过使用大气等离子体喷射器诱导 nsc 分化, 并强调了整个过程中的关键问题。cap 可以增强 nsc 向神经元的分化, 显然对神经疾病的治疗是有益的。同样值得注意的是, 目前的协议只关注 cap 对 nsc 的体外效应。利用小鼠神经损伤模型评价血浆在体内的作用, 对今后的研究是必要的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了华中学者计划、华中科技大学自主创新基金 (2018kfyxj071 号) 和中国国家自然科学基金 (31501099 和 51707012) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
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