Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Sinir kök hücre farklılaşması bir tek adımlı soğuk atmosferik plazma tedavi Vitro tarafından

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58663
Automatic Translation
*1, *2, 3
1State Key Laboratory of Advanced Electromagnetic Engineering and Technology, Huazhong University of Science and Technology, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute/Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Bu iletişim kuralı bir soğuk atmosferik plazma tedavisinin ayrıntılı deneysel adımlar sinir kök hücreleri ve farklılaşma Geliştirme için ayirt algılama sunmayı amaçlamaktadır.

Abstract

Fiziksel plazma teknoloji, soğuk atmosferik plazmasının (CAP) yaygın olarak araştırdık gibi dekontaminasyon, kanser tedavisi, yara iyileşmesi, kök kanal tedavisi, vb, yeni bir araştırma alanı oluşturan plazma tıp adında. Elektrik, kimyasal ve biyolojik reaktif türlerin bir karışımı olarak, kapaklar her iki vitro sinir kök hücre farklılaşması geliştirmek için yeteneklerini göstermiştir ve vivo içinde ve are olma nörolojik hastalık tedavisi için umut verici bir yol gelecekte. Çok daha heyecan verici haber büyük harfler kullanarak tek adımlı farkında olmayabilir ve güvenli bir şekilde yönettiği, sinir kök hücreleri (NSCs) ayrımında doku ulaşım için olduğunu. Biz burada detaylı Deneysel protokol NSC farklılaşma C17.2-NSCs ve birincil sıçan nöral kök hücrelerin, geliştirmek için kendini yetiştirmiş bir kap jet aygıtı kullanarak hem de hücre kaderi ile ters gözlemleyerek ve floresan mikroskopi göstermek. Teknoloji boyama ayirt yardımıyla daha işlenmemiş grubu hızlandırılmış bir Diferansiyel oranı gösterdi her iki NSCs bulduk ve ~ %75-in NSCs seçmeli olarak esas olarak Olgun, kolinerjik ve motor nöronların farklı nöronlar.

Introduction

NSCs yönlendirilmiş farklılaşma doku ulaşım için belirli bir soy içine nörodejeneratif ve neurotraumatic hastalıkları1için en umut verici tedavilerin biri olarak kabul edilir. Örneğin, catecholaminergic dopaminerjik nöron özellikle Parkinson hastalığı (PD) tedavisinde istenen. Ancak, istediğiniz hücreleri taşıma için hazırlamak için geleneksel yöntemlerle kimyasal toksisitesi, yara oluşumu veya büyük ölçüde engellemektedir rejeneratif tıp2NSCs uygulamalarda diğerleri gibi birçok sakıncaları vardır. Bu nedenle, bir roman ve güvenli bir şekilde NSC farklılaşma için bulmak çok gereklidir.

Plazma konularda, aşağıdaki katı, sıvı ve gaz dördüncü durumudur ve bu konularda tüm evrenin % 95'den fazla teşkil eder. Plazma ilişkisiz pozitif/negatif ve tarafsız parçacıkları ile elektriksel olarak nötr ve genellikle yüksek gerilim deşarj Lab tarafından oluşturulur. Son yirmi yılda, biyomedikal plazmada uygulanması soğuk atmosferik basınç plazma teknoloji geliştirme dünya çapında büyük dikkat çekti. Bu teknik sayesinde istikrarlı düşük sıcaklık plazma ark oluşumu olmadan atmosferi çevreleyen havasında oluşturulacak ve reaktif nitrojen türler (RNS), reaktif oksijen türleri (ROS), ultraviyole (UV) gibi çeşitli reaktif türler oluşur radyasyon, elektronlar, iyonlar ve elektrik alanı3. Kapaklar mikro-organizma inactivation, kanser tedavisi, yara iyileşmesi, cilt hastalıkları, hücre çoğalması ve hücre farklılaşması4,5,6,7tedavisi için benzersiz avantajları vardır. Önceki çalışmalarda, biz soğuk atmosferik plazma jet NSCs farklılaşma fare nöral kök hücre C17.2 (C17.2-NSCs) ve birincil sıçan nöral kök hücrelerin, geliştirebilirsiniz yönettiği için güçlü bir araç olmak için büyük bir potansiyele sergilenmesi gösterdi NSCs8farklılaşma. CAP geliştirme NSC farklılaşma mekanizması henüz tam olarak anlaşılmaktadır değil, ancak Hayır kapaklar tarafından oluşturulan sürecinde önemli bir faktör olduğu ortaya çıktı. Bu çalışmada, biz bir atmosfer basıncı helyum/oksijen plazma jeti NSCs vitro, hücre hazırlık ve Önarıtma, morfoloji gözlem tarafından ters mikroskop, tedavisi için kullanmanın ayrıntılı bir deneysel protokol sağlamayı amaçlamaktadır ve floresans mikroskobu gözlem ayirt boyama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hücre kültürleri ve Predifferentiation

  1. Nöral kök hücre kültür ve predifferentiation
    1. Poli-D-lizin-kaplı coverslips hazırlayın. Steril coverslip (20 mm çapında) 12-şey plaka koymak. Poli-D-lizin, % 0,1 w/v, su (Malzemeler tablo) ile kapak cam coverslips üzerinde daha iyi hücre adezyon için sonraki adımları izleyerek kat.
      Not: Her hücre kültürünü ve uygulama için en uygun koşulları belirlenmelidir.
      1. Aseptik poli-D-lizin, % 0,1 w/v, su ile coverslip yüzey kat. Rock yavaşça coverslip yüzey bile bir kaplama emin olmak için.
      2. Sonra geceleme (~ 12 h) 37 ° C'de kültür, poli-D-lizin çözümü kaldırmak ve yüzey 3 durulayın x 1 mL steril su ile.
      3. Hücreleri en az 30 dk onları tohum önce kuru.
  2. Fare nöral kök hücre C17.2 (C17.2-NSC) kültür ve predifferentiation
    1. C17.2-NSCs Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) ile % 10 fetal Sığır serum (FBS), % 5 at serum (HS) ve % 1 penisilin/streptomisin 37 ° C ve % 5 CO2 ~ 2-3 d için takıma bir 25 cm2 şişesi içinde kuluçkaya.
    2. Hücreleri % 85 izdiham ulaştığınızda, orta kaldırmak, PBS 1 mL hücrelerle yıkama ve taze tripsin (% 0,25) 1 mL şişe ekleyin. 1 dakika bırakın; daha sonra kültür orta 1 mL şişe ve pipet yukarı ve aşağı bir tek hücre süspansiyon emin olmak için birkaç kez ekleyin.
    3. Bir hemasitometre kullanarak süspansiyon hücrelerde yoğunluk saymak. 2 x 104 hücre/mL son hücre konsantrasyon vermek için hücre süspansiyon gerekli hacmi hesaplamak.
    4. C17.2-NSCs 12-şey plaka ~ 2 x de başına 104 hücre yoğunluğu ile kaplı coverslips üzerinde tohum. Mikroskop altında hücre yoğunluğu kontrol edin.
      Not: daha iyi bir sonuç için optimum hücre yoğunluğu ayirt deneme önce belirlenmesi gerekir.
    5. Bir hücre kuluçka için eki için izin vermek 12 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    6. Hücreler 2 ek sonra yıkayın x 1 mL PBS ile ve hücrelerin plazma tedavi öncesi 48 saat için %1 N2 eki ile DMEM/F12 oluşan farklılaşma orta ile yetiştirmek.
  3. Birincil sıçan nöral kök hücre kültür ve predifferentiation
    1. Sıçan NSC büyüme aracı olarak kaplamasız T25 şişeler 5 x 105 hücre yoğunluğu, birincil fare NSC süspansiyon kültür.
      Not: Birincil fare NSCs Xie vd. protokol sonrası izole 9.
    2. Ters bir mikroskop altında neurospheres oluşumunu kontrol edin. Neurospheres morfoloji küresel ve şeffaf çok hücreli kompleksleri sergileyen emin olun.
    3. Neurospheres 3 mm veya daha büyük bir çap ulaştığınızda, bir 15 mL steril santrifüj tüpü ve yerçekimi tarafından neurospheres razı olsun neurosphere süspansiyon aktarın.
    4. Neurospheres orta hacmi en az çok dikkatli bir şekilde bırakmak süpernatant kaldırın.
    5. Durulama neurospheres 1 x 5 mL de PBS ve neurospheres yerleşmek yerçekimi tarafından izin ile. PBS bir asgari miktar bırakmak süpernatant kaldırın.
    6. Farklılaşma orta ~ 12-15 neurospheres mililitre başına için hücre yoğunluğunu ayarlamak için uygun birim ekleme. Farklılaşma orta birincil fare NSCs için DMEM/F12, %2 B27 ve % 1 oluşan FBS.
    7. Tohum neurosphere süspansiyon kaplamalı her coverslip 12-şey plaka üzerine 1 mL.
      Not: hafifçe neurospheres eşit olarak dağıtılır sağlamak için plaka sallamak. Daha iyi bir ayirt sonuç için kritik bir adımdır.
    8. Plaka da kuluçka yerleştirin ve plazma tedavi öncesi 24 h için predifferentiate sağlar.

2. plazma jetlerin hazırlanması

  1. Bir iç çapı 2 mm ve bir dış çapı 4 mm. ile bir yarı-açık kuvars tüp takın bir yüksek gerilim tel çapı 2 mm ile tüpün içine seçin.
  2. Kuvars tüp yüksek gerilim tel ile 5 mL şırınga yerleştirin ve bir tutucu şırınga merkezi içinde bağlamak için kullanın. Kuvars tüp kapalı sonu ve şırınga ucu arasındaki mesafe 1 cm ayarlamak.
  3. Açık belgili tanımlık tenkıye sonuna kadar bir 1 m silikon kauçuk kanal (ile bir iç çapı 12 mm) bağlanmak ve sonra sırayla için akış ölçer ve gaz vanası bağlayın.

3. Jets edinimi

  1. Devre Şekil 1' de gösterildiği gibi bağlayın. Güç kaynağının çıkış tel plazma jeti cihaza bağlayın ve yüksek gerilim sonda ucu gerilim algılamak için çıkış kabloyla bağlayın. Çıkış voltajı bilgileri kaydetmek için osiloskop yüksek gerilim sonda diğer ucunu bağlayın. Tüm devre kontrol ve güç kaynağı, osiloskop ve yüksek gerilim probu tüm cezalısın emin olun.
  2. Gaz hattı kontrol edin. Tüp gaz plazma jeti aygıta bağlı olduğundan emin olun; o zaman, gaz vanası helyum (birim kesir, % 99.999) ve oksijen (birim kesir, % 99.999) açın ve gaz akışı 1 L:0.01 L/dk (o: O2) ayarlayın.
    Not: ilk kez güç kaynağı açmadan önce birkaç dakika için gaz akışı sağlar.
  3. Darbe genlik, frekans ve darbe genişliği 8 olarak ayarla kV, 8 kHz ve 1600 ns, anılan sıraya göre. Devre yeniden denetleyin ve ardından, bir plazma jet oluşturmak için Çıkış düğmesini açın.
    Uyarı: yüksek gerilim tel herhangi bir zamanda dokunmayın.

4. nöral kök hücre tedavisinde plazma

  1. Şırınga meme ve hücre iyi deliğe 15 mm arasındaki mesafeyi ayarlayın.
    Not: 12-şey plaka yerleştirildiği platformu alttan mesafe ölçülür.
  2. 12-şey plaka kuluçka makinesi dışarı alın ve orta predifferentiated hücrelerinin taze farklılaşma orta 800 µL için değiştirin.
  3. Hücreleri üç gruba ayırın: bir tedavi edilmemiş kontrol grubu, 60 s o ve O2 (% 1) gaz akışı tedavi grup ve 60 s plazma tedavi grup.
    Not: Hiçbir belirgin sıvı kaybı tedavi koşul altında vardır.
  4. 12-şey plaka plazma jetlerin altında yer, her deliğin ortasına şırınga başlık sabit olduğundan emin olun ve farklı gruplara 4.3 adımda belirtilen ilgili tedavi vermek.
    Not: Tek tip tedavi koşulları sağlamak için deneysel bir işlem sırasında farklılaşma Orta oda sıcaklığında tedavi edilmezse denetimleri tutuldu. O ve O2 (% 1) gaz akışı tedavi grubunda yalnızca bir o ile tedavi edildi ve O2 (% 1) gaz akışı, plazma üretimi olmadan. Tüm tedaviler nüsha gerçekleştirilmelidir.

5. sinirsel kök hücre farklılaşması

  1. Tedavi sonra özgün kültür kaldırın ve her şey için yeni farklılaşma orta 1 mL ekleyin.
  2. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka 6 için kuluçkaya ö değiştirmek orta her geçen gün.
  3. Her gün bir ters faz kontrast ışık mikroskobu altında farklı grupların ayırt etme durumunu denetleyin. Rastgele en az 12 alanları seçin ve morfolojik değişiklikleri kaydetmek için fotoğraf çekmek.

6. ayirt boyama

  1. Durulama
    1. Hücre inkübatör dışında örnekleri ve orta aspirasyon tarafından sökün. Durulama hücreleri 1 x 1 mL PBS ile.
      Not: farklılaşma sonra hücreleri kolayca ayrılır. Hücreleri dışına yıkama önlemek için kültür wells tarafındaki PBS eklemek gereklidir.
  2. Fiksasyon
    1. Hücreleri 500 µL % 4 paraformaldehyde oda sıcaklığında 20 dakika ile düzeltmek. Fiksasyon sonra yavaşça hücreleri 3 durulama x 1 mL kalan % 4'paraformaldehyde kaldırmak için PBS, 5 min her, ile.
      Not: Hücre fiksasyon için en uygun zaman noktası hücre tiplerine göre belirlenmelidir. Fiksasyonun sonra PBS 1 mL kültür wells taraftan ekleyin ve 5 min için tablo örnek bırakmaktır. Bir laboratuar shaker en az bir hücre kaybı sağlamak için kullanın.
  3. Permeabilization
    1. Örnekleri % 0,2 ile permeabilize TritonX-100 oda sıcaklığında 10 dakika için PBS içinde. Permeabilization sonra üç kez, 5 min her için 1 mL PBS yavaşça hücrelerle durulayın.
      Not: Cep permeabilization için uygun zaman noktası hücre tiplerine göre belirlenmelidir. Permeabilization sonra 1 mL PBS kültür wells, yan eklemek tablo 5 min için örnek bırakın. Bir laboratuar shaker hücreleri en az kaybı sağlamak için kullanın.
  4. Engelleme
    1. 1 mL % 10 keçi serum PBS içinde her örnek için eklenir ve örnek spesifik olmayan herhangi bir etkileşimi engellemek 1 h için masaya bırakılır.
      Not: bir laboratuvar shaker slayttan ayırma hücreleri önlemek için kullanmayın. Bir durulama Bu adım gerekli değildir.
  5. Kuluçka birincil antikor ile
    1. Birincil antikor seyreltme tampon kullanarak birincil antikor sulandırmak.
      Not: en iyi sonuçlar için birincil antikor son seyreltme oranı öntest tarafından belirlenmelidir. Anti-testin (için farklılaşmamış kök hücre), seyreltme oranları anti-β-tübülin III (nöron için) anti-O4 (için oligodendrocyte), anti-NF200 (için olgun nöronlar), Anti-sohbet (için kolinerjik nöronlar), anti-LHX3 (için motor nöronlar), anti-GABA (için GABAergic nöronlar), anti-serotonin (için serotonerjik nöron) ve anti-TH (için dopaminerjik nöron) are 1:80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200 ve 1: 100, anılan sıraya göre.
    2. Seyreltilmiş birincil antikorların 300 µL farklı örnekleri için geçerlidir.
    3. Gecede 4 ° C'de hücre örnekleri kuluçkaya
      Not: Bu 4 ° C'de arka plan ve nonspesifik boyama azaltmak için birincil antikorlar kuluçkaya önerilir.
    4. Birincil antikorlar kaldır ve yavaşça hücreleri 3 durulayın x 1 mL PBS ile.
  6. Kuluçka ikincil antikor ile
    1. Cy3-Birleşik veya Alexa Fluor 488 Birleşik ikincil antikorlar % 3 keçi serum içinde PBS kullanarak sulandırmak.
      Not: en iyi sonuçlar için ikincil antikor son seyreltme oranı öntest tarafından belirlenmelidir.
    2. Her birincil antikor algılamak için ilgili ikincil antikorların 300 µL uygulanır.
      Not: Sonraki adımlar floresans Şoklama önlemek için karanlıkta gerçekleştirilmesi gerekir.
    3. Hücre örneği içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında 2 h için kuluçkaya.
    4. İkincil antikorlar kaldırmak ve PBS 1 mL oda sıcaklığında 10 dakika hafifçe hücrelerle durulayın.
  7. Nükleer boyama
    1. 500 µL Höchst 33258 çalışma çözüm hücre örnek sokmak için geçerlidir.
    2. Hücre örnek çekirdeklerin etiketlemek için oda sıcaklığında 8 min için karanlıkta kuluçkaya.
    3. Nazikçe yıkayın hücreleri 3 x 1 mL PBS, 10 min her, ile korunan ışıktan.
      Not: hücreleri en az kaybı için en iyi çamaşır koşulu ampirik olarak belirlenmelidir.
  8. Montaj
    1. Montaj orta bir damla microslide ortasına yerleştirin.
    2. Cımbız kullanarak coverslips dışında (örnekler ile) almak ve dikkatli bir şekilde örnek montaj orta üstüne getirin. Hava kabarcıkları kaçının.
    3. Emici kağıt ile her aşırı montaj ortam kaldırın.
  9. Floresans mikroskobu gözlem
    1. Höchst 33258, Alexa Fluor 488 ve Cy3 için filtre ile donatılmış floresans mikroskobu altında örnekleri gözlemlemek. Her örnek için rasgele bir kamera ile en az 8-12 alanları ve kayıt görüntüleri seçin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hücre morfolojisi ters mikroskop altında her gün kap tedavi sonrasında görülmüştür. Şekil 2 , her iki hücre hatlarında sıradan ters faz kontrastlı ışık mikroskobu görüntüler hücre farklılaşma göstermektedir. Plazma tedavi grubu bir hızlandırılmış farklılaşma oranı ve denetim ve gaz akışı grubuna kıyasla yüksek farklılaşma oranı sergiler.

C17.2-NSCs ve birincil fare NSCs tedavi gösterilir sonra Şekil 3 ve Şekil 4, sırasıyla için 6 d kültürlü immünfloresan sonuçları. Testin (+, yeşil) azalma, anlamlı bir artış, β-tübülin III (+, kýrmýzý) ve O4 (+, yeşil) biraz arttı hem de kontrol grubu ile karşılaştırıldığında satırları hücre. CAP tedaviler 60 s etkili nöronal lineage kontrol grubu ve gaz akış tedavi grubuna göre içine C17.2 NSCs gelişmiş. Saf gaz akışı NSC farklılaşma üzerinde görünür bir etkisi vardı.

Şekil 5 nöronal kader belirtimi 60 s plazma tedavi grubunda gösterilir. NF200 (için olgun nöron), sohbet (için kolinerjik nöron) ve LHX3 (motor nöron için) güçlü ifadeler tespit edildi. Süre hiçbir dopaminerjik nöron tespit edildi GABAergic ve serotonerjik nöron nadiren, görüldü.

Figure 1
Resim 1 : Deneysel tuzak şematik. Plazma jeti aygıtı yüksek voltajlı güç kaynağı çıkış kabloya bağlı. Yüksek gerilim sonda osiloskop ile çıkış voltajı algılamak için kullanılır. Çalışma gazlar şırınga akan ve yüksek gerilim üzerinde olduğunda, plazma jet oluşturulur ve açık havaya yaymak. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : C17.2-NSCs ve birincil fare NSCs için sıradan ters faz kontrastlı ışık mikroskobu görüntüler. Bu rakam Xiong vd adapte 8 izne sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Tedavi edilmezse C17.2-NSCs ayirt tespiti (solda), 60 s gaz akışı-C17.2-NSCs (orta) ve 60 tedavi s plazma-tedavi C17.2-NCSs (sağda) için 6 d kültür. Testin (+ yeşil) / Höchst; Β-tübülin III (+, kýrmýzý) / Höchst; O4 (+, yeşil) / Höchst. Nükleer Höchst 33258 ile lekeli. Bu rakam Xiong vd adapte 8 izne sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Ayirt algılama tedavi edilmezse birincil fare NSCs (solda), 60 s gaz akışı tedavi birincil fare NSCs (orta) ve 60 s plazma tedavi birincil fare NSCs (sağda) 6 d kültür. Testin (+ yeşil) / Höchst; Β-tübülin III (+, kýrmýzý) / Höchst; O4 (+, yeşil) / Höchst. Nükleer Höchst 33258 ile lekeli. Bu rakam Xiong vd adapte 8 izne sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Nöronal kader belirtimi okudu tarafından 60 s plazma tedavi grubunda ayirt. NF200 (+, kırmızı) / Höchst; Sohbet (+, kýrmýzý) / Höchst; LHX3 (+, kırmızı) / Höchst; GABA (+, kýrmýzý) / Höchst; Serotonin (+, kýrmýzý) / Höchst; TH (+, kýrmýzý) / Höchst. Nükleer Höchst 33258 ile lekeli. Bu rakam Xiong vd adapte 8 izne sahip. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C17.2-NSCs olan bir tür ölümsüzleştirdi nöral kök hücre satırı yenidoğan fare serebellar taneli katman hücrelerden, Snyder ve diğerleri tarafından geliştirilen10,11. C17.2-NSCs nöronlar, astrocytes ve oligodendrocytes ayırabilir ve nörolojik12' yaygın olarak kullanılmaktadır. Bizim önceki çalışmada, CAPs C17.2-NSCs farklılaşma nöronların içine geliştirmek. Bir kanıt prensibi çalışma da birincil fare NSCs kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve plazma pozlama etkisi birincil fare NSCs C17.2-NSCs, nöronlar daha güçlü bir farklılaşma ile niteliksel benzer. Kapaklar, bir roman fizikokimyasal teknoloji, Alzheimer hastalığı, PD, Medulla Spinalis Yaralanmalarında ve diğerleri gibi nörolojik hastalık tedavisi için umut verici bir araç temsil edebilir.

CAP tedavi C17.2 Milli Güvenlik ve birincil fare NSC farklılaşma vitro kısa tedavi süresi ve küçük hücre hasarı ile geliştirmek için tek bir yol sunar. Ayrıca, sonuçlar % ~ 75 farklılaşma plazma tedavi gelecekteki doku nakillerine için umut verici bir yöntem klinikte yapılan nöronların içine yönetmen gösterdi. Ancak, geçerli protokol yalnızca NSC farklılaşma cihazlarý CAP bir tür işe. Bu microplasma kullanarak sınırlama nonuniformity olduğunda plazma tüy 12-şey plaka davranır. Yapılacak çalışmalar büyük hacimli plazma aygıt veya orta plazma-harekete geçirmek için tek tip tedavi kullanarak ele alacağız.

Protokol içinde çeşitli kritik adımlar vardır. Hücreleri kolayca ayırt etme sonra ayrılır için ilk olarak, her yıkama adım dikkatle, gerçekleştirilmesi gerekir. İmmunostaining diğer kritik adımlarda fiksasyon ve permeabilization işlemlerdir. Fiksasyonun Morfoloji ve antigenicity13hücreleri korumak gereklidir. Permeabilization antikorlar hücre içi ve nükleer antijenleri14' e bağlamak izin verir. Uygun zaman fiksasyon ve permeabilization için öntest ile belirlenmelidir. Ayirt engelleme ve antikor kuluçka gibi nazik çamaşır adımları önemlidir. Bu hayvan serum ikincil antikor olarak aynı kaynaktan endojen nonspesifik proteinler kapsayacak şekilde kullanmak için tavsiye edilir. En iyi sonuçlar için antikor son seyreltme oranı öntest tarafından belirlenmelidir. Plazma tedavi gelince, plazma dozaj çok dikkatli uygulanmalıdır; uzun süreli ve yoğun plazma tedavi hücre apoptosis veya nekroz neden. Bu nedenle, tedavi zaman ve mesafe pretested gerekir.

Özetle, bu el yazması bir atmosferik plazma jeti kullanarak NSC farklılaşma inducing için adım adım bir protokol sağlar ve tüm süreç sırasında kritik konuları vurgular. Kapaklar NSCs farklılaşma nöronların içine artırabilir ve net nörolojik hastalıkların tedavisi için faydalı olacaktır. Geçerli protokol yalnızca NSCs kapaklar vitro etkisi üzerinde duruluyor Not için faydalıdır. Fare modelleri sinir yaralanma kullanarak plazma vivo içinde etkisini değerlendirmek gelecekteki çalışmaları için gereklidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Huazhong Akademik Program, Huazhong Üniversitesi bilim ve teknoloji (No. 2018KFYYXJJ071) ve Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (NOS 31501099 ve 51707012) bağımsız yenilik Fonu tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip NEST 801008
Poly-D-lysine Beyotime P0128
DMEM medium HyClone SH30022.01B stored at 4 °C
DMEM/F12 medium HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
N2 supplement Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement Gibco 17504044 stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum HyClone SH30074.03 tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010 stored at 4 °C
Trypsin HyClone 25300054 stored at 4 °C
PBS solution HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
TritonX-100 Sigma T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution Vector Laboratories S-1000-20 stored at 4 °C
anti-Nestin Beyotime AF2215 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III Sigma Aldrich T2200 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4 R&D Systems MAB1326 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG 
12-well plate corning 3512
25 cm2 flask corning 430639
Hoechst 33258 Beyotime C1018 stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium Beyotime P0128 stored at -20 °C and protect from light
Light microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics Company XD-202
Fluorescence microscopy Nikon 80i
High – voltage Power Amplifier Directed Energy PVX-4110
DC power supply Spellman SL1200
Function Generator Aligent  33521A
Oscilloscope Tektronix DPO3034
High voltage probe Tektronix P6015A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
  2. Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
  3. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
  4. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
  5. Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
  6. Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
  7. Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
  8. Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
  9. Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
  10. Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
  11. Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
  12. Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).

Tags

Mühendisliği sayı 143 soğuk atmosferik plazmaları gaz deşarj sinir kök hücreleri farklılaşma ayirt C17.2-NSCs birincil fare NSCs
Sinir kök hücre farklılaşması bir tek adımlı soğuk atmosferik plazma tedavi <em>Vitro</em> tarafından
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve… More

Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e58663, doi:10.3791/58663 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter