Summary
Dit protocol is bedoeld om gedetailleerde experimentele stappen van een koude atmosferische plasma behandeling op neurale stamcellen en immunofluorescentie detectie voor verhoging van de differentiatie.
Abstract
Als de ontwikkeling van fysieke plasmatechnologie, koude atmosferische plasma's (CAPs) zijn grote schaal onderzocht in decontaminatie behandeling van kanker, wondgenezing, wortelkanaalbehandeling, enz., vorming van een nieuwe onderzoeksterrein plasma geneeskunde genoemd. Een mengsel van elektrische, chemische en biologische reactieve soorten, CAPs hebben vertoond hun capaciteiten om de zenuw stamcellen differentiatie beide in vitro en in vivo en zijn steeds een veelbelovende manier voor neurologische ziekte-behandeling in de toekomst. De veel spannender nieuws is dat met behulp van CAPs one-step kan realiseren, en veilig geregisseerd, differentiatie van neurale stamcellen (NSCs) voor het vervoer van het weefsel. Wij tonen hier de gedetailleerde experimenteel protocol van het gebruik van een zelf-gemaakte CAP jet-apparaat te verbeteren van NSC differentiatie in C17.2-NSCs en primaire rat neurale stamcellen, evenals observeren het lot van de cel door omgekeerde en fluorescentie microscopie. Met de hulp van immunofluorescentie kleuring van technologie, vonden we beide de NSCs toonde een versneld differentieel tarief dan de onbehandelde groep en ~ 75% van de NSCs selectief onderscheiden in neuronen, die voornamelijk volwassen, cholinerge en motor zijn neuronen.
Introduction
De gestuurde differentiatie van NSCs in een bepaalde bloedlijn voor weefsel vervoer wordt beschouwd als een van de meest beloftevolle therapieën voor neurodegeneratieve en neurotraumatic ziekten1. Catecholaminerge Dopaminerge neuronen zijn bijvoorbeeld vooral gewenst bij de behandeling van Parkinson (PD). Traditionele methoden voor te bereiden op de gewenste cellen vervoer hebben echter veel nadelen, zoals chemische toxiciteit, littekenvorming of anderen, die grotendeels belemmert de toepassingen van NSCs in de regeneratieve geneeskunde2. Het is daarom zeer noodzakelijk om het vinden van een roman en veilige manier voor NSC differentiatie.
Plasma is de vierde stand van zaken, volgende vaste stof, vloeistof en gas, en meer dan 95% van de zaken in het hele universum vormt. Plasma is elektrisch neutraal met niet-afhankelijke positieve/negatieve en neutrale deeltjes en wordt meestal gegenereerd door een hoog-voltage kwijting in het lab. In de laatste twee decennia, heeft de toepassing van plasma in biogeneeskunde enorme aandacht wereldwijd als de ontwikkeling van koude luchtdruk plasmatechnologie aangetrokken. Dankzij deze techniek, stabiele lage-temperatuur plasma kan worden gegenereerd in de omringende lucht in de atmosfeer zonder boog vorming en bestaat uit verschillende reactieve soorten, zoals reactieve stikstof soorten (RNS), reactieve zuurstof soorten (ROS), ultraviolet (UV) straling elektronen, ionen en elektrische veld3. CAPs hebben unieke voordelen voor inactivatie van micro-organisme, kankertherapie, wond genezing, behandeling van ziekten van de huid, celproliferatie en cel differentiatie4,5,6,7. In vorige werk, we laten zien dat koude atmosferische plasma jet kan het verbeteren van de differentiatie van NSCs in zowel de lymfkliertest neurale stamcellen C17.2 (C17.2-NSCs) en de primaire rat neurale stamcellen, vertonen een grote potentie om een krachtig instrument voor het gericht differentiatie van NSCs8. Hoewel het mechanisme van CAP versterking van NSC differentiatie niet volledig echter begrepen is geen gegenereerd door CAPs heeft bewezen een belangrijke factor in het proces. In dit werk, wij streven naar een gedetailleerde experimenteel protocol een atmosferische druk helium/zuurstof plasma straal te gebruiken voor de behandeling van NSCs in vitro, cel bereiding en voorbehandeling, morfologie observatie door omgekeerde Microscoop, en fluorescentie microscopie observatie van immunofluorescentie kleuring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cel culturen en Predifferentiation
-
Neurale stamcellen cultuur en predifferentiation
- Poly-D-lysine-gecoate coverslips voor te bereiden. Een steriele dekglaasje aan (20 mm diameter) in een 12-well plaat gebracht. Coat de cover glas met poly-D-lysine, 0,1% w/v, in water (Tabel of Materials) voor betere hechting van de cel op de coverslips door de volgende stappen te volgen.
Opmerking: Optimale omstandigheden moeten worden bepaald voor elke cellijn en toepassing.- Aseptisch coat het oppervlak van het dekglaasje aan met poly-D-lysine, 0,1% w/v, in water. Rock zachtjes om een gelijke deklaag van het dekglaasje aan oppervlak.
- Na het kweken van overnachting (~ 12 h) bij 37 ° C, de poly-D-lysine-oplossing verwijderen en spoel het oppervlak 3 x met 1 mL steriel water.
- Droog de cellen ten minste 30 min voordat ze zaaien.
- Poly-D-lysine-gecoate coverslips voor te bereiden. Een steriele dekglaasje aan (20 mm diameter) in een 12-well plaat gebracht. Coat de cover glas met poly-D-lysine, 0,1% w/v, in water (Tabel of Materials) voor betere hechting van de cel op de coverslips door de volgende stappen te volgen.
-
Lymfkliertest neurale stamcellen C17.2 (C17.2-NSC) cultuur en predifferentiation
- C17.2-NSCs in een maatkolf van 25 cm2 in Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 5% paard serum (HS) en 1% penicilline/streptomycine bij 37 ° C en 5% CO2 voor ~ 2-3 d uit te broeden.
- Wanneer de cellen bij 85% samenvloeiing, verwijderen van het medium, wassen van de cellen met 1 mL PBS en voeg 1 mL verse trypsine (0,25%) in de destillatiekolf. Laat het voor 1 min; dan, voeg 1 mL gestolde voedingsbodem aan de kolf en Pipetteer op en neer meerdere malen om de schorsing van een enkele cel.
- Tellen de dichtheid van de cellen in de opschorting die met behulp van een hemocytometer. Bereken de benodigde hoeveelheid celsuspensie tot een concentratie van de laatste cel van 2 x 104 cellen/mL.
- Beënt de C17.2-NSCs op het gecoate coverslips in de 12-well plaat met de dichtheid van ~ 2 x 104 cellen per putje. Controleer de celdichtheid onder een microscoop.
Opmerking: Voor een beter resultaat, de optimale celdichtheid moet worden bepaald voordat het experiment immunofluorescentie. - Incubeer de cellen bij 37 ° C in een cel incubator voor 12u te voorzien in bijlage.
- Na bijlage, wassen de cellen 2 x met 1 mL PBS en het cultiveren van de cellen met differentiatie medium bestaande uit DMEM/F12 met 1% N2 supplement voor 48 uur vóór de plasma behandeling.
-
Primaire rat neurale stamcellen cultuur en predifferentiation
- De schorsing van de primaire rat NSC in rat NSC groeimedium in ongecoate T25 kolven bij een dichtheid van 5 x 10-5 -cellen cultuur.
Opmerking: De primaire rat NSCs werden geïsoleerd volgens het protocol van Xie et al. 9. - Controleer de vorming van neurospheres onder een omgekeerde Microscoop. Zorg ervoor dat de morfologie van de neurospheres vertoont bolvormig en transparante meercellige complexen.
- Wanneer de neurospheres een diameter van 3 mm of groter bereikt, breng de neurosphere een tube van 15 mL steriele centrifuge en laat die de neurospheres door de zwaartekracht regelen.
- Verwijder het supernatant zorgvuldig te laten van de neurospheres in een minimale hoeveelheid medium.
- Spoel de neurospheres 1 x met 5 mL PBS en laat de neurospheres door de zwaartekracht regelen. Verwijder de bovendrijvende substantie te laten van een minimale volume van PBS.
- Een geschikt volume van differentiatie medium aan te passen van de celdichtheid tot ~ 12-15 neurospheres per milliliter toevoegen. Het differentiatie-medium voor primaire rat NSCs bestaat uit DMEM/F12, 2% B27, en 1% FBS.
- Neurosphere ophanging op elk zaad 1 mL gecoat dekglaasje aan in de 12-well-plaat.
Opmerking: Schud de plaat voorzichtig om ervoor te zorgen dat de neurospheres gelijkmatig verdeeld zijn. Deze stap is essentieel voor een beter resultaat van de immunofluorescentie. - Plaats de plaat in de incubator en laat ze predifferentiate gedurende 24 uur voordat de plasma behandeling.
- De schorsing van de primaire rat NSC in rat NSC groeimedium in ongecoate T25 kolven bij een dichtheid van 5 x 10-5 -cellen cultuur.
2. voorbereiding van de Plasma-Jets
- Kies een halfopen kwarts buis met een inwendige diameter van 2 mm en een uitwendige diameter van 4 mm. Steek een hoogspannings-draad met een diameter van 2 mm in de buis.
- Voeg de quartz-buis met de hoogspannings-draad in een 5 mL-spuit en gebruik een houder te mounten in het centrum van de spuit. Stel de afstand tussen de verzegelde uiteinde van de buis kwarts en de spuit tip op 1 cm.
- Een 1 m siliconen rubber pijp (met een inwendige diameter van 12 mm) verbinden met het open uiteinde van de spuit en sluit het vervolgens naar de debietmeter en gas klep in volgorde.
3. de verwerving van de Jets
- Sluit het circuit zoals afgebeeld in Figuur 1. Verbind de draad van de uitvoer van de voeding naar de plasma jet-apparaat, en sluit vervolgens het uiteinde van de sonde hoogspannings-met de draad van de uitvoer om te ontdekken de spanning. Sluit het andere uiteinde van de sonde van de hoog-voltage aan de oscilloscoop opnemen van de informatie van de uitgangsspanning. Controleer het hele circuit en dat de voeding, de oscilloscoop en de hoog-voltage-sonde zijn geaard.
- Controleer de gasleiding. Zorg ervoor dat de gas-buis is aangesloten op het plasma jet-apparaat; dan, open de klep van het gas van de helium (volume Fractie, 99,999%) en zuurstof (volume Fractie, 99,999%) en stel de gasstroom op 1 L:0.01 L/min (He: O2).
Opmerking: Laat de gasstroom voor enkele minuten voordat ik overga op de voeding voor de eerste keer. - De amplitude van de pols, frequentie en pulsbreedte instellen als 8 kV, 8 kHz en 1600 ns, respectievelijk. Controleer het circuit opnieuw en schakel vervolgens, op de knop van de uitgang maken een plasma-jet.
Let op: Raak niet de hoogspannings-draad op elk gewenst moment.
4. plasma behandeling van neurale stamcellen
- Stel de afstand tussen het mondstuk van de spuit en de cel goed gat tot 15 mm.
Opmerking: De afstand wordt gemeten vanaf de onderkant van het platform waar de 12-well plaat wordt geplaatst. - Neem de 12-well plaat uit de incubator en het medium van de predifferentiated cellen omzetten in 800 µL van verse differentiatie medium.
- De cellen verdelen in drie groepen: een onbehandelde controlegroep, een groep 60 s hij-en-O2 (1%) gas flow behandeling en een 60 s plasma behandeling groep.
Opmerking: Er is geen voor de hand liggende vloeibare verlies onder de voorwaarde van de behandeling. - Plaats de 12-well plaat onder de plasma-jets, zorg ervoor dat de verstuiver spuit wordt vastgesteld in het midden van iedere hole, en de ter zake dienende behandeling geven aan de verschillende groepen vermeld in stap 4.3.
Opmerking: De onbehandelde controles werden gehouden in differentiatie medium bij kamertemperatuur tijdens de experimentele procedure om eenvormige behandeling voorwaarden te garanderen. De hij-en-O2 (1%) gas flow behandelde groep werd behandeld met alleen een hij en de O-2 (1%)-gas-flow, zonder plasma generatie. Alle behandelingen moeten in drievoud worden uitgevoerd.
5. neurale stamcellen differentiatie
- Na de behandeling, het verwijderen van de oorspronkelijke cultuur en voeg 1 mL van nieuwe differentiatie medium aan elk putje.
- Incubeer de cellen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voor 6 d. wijzigen het medium om de andere dag.
- Controleer de status van de differentiatie van de verschillende groepen dagelijks onder een omgekeerde fase contrast licht microscope. Willekeurig ten minste 12 velden selecteren en nemen van foto's te nemen van de morfologische veranderingen.
6. immunofluorescentie kleuring
-
Spoelen
- Neem de monsters uit de cel incubator en verwijderen van het medium door aspiratie. Spoel de cellen 1 x met 1 mL PBS.
Opmerking: Na de differentiatie, worden de cellen zijn gemakkelijk uitneembaar. Het is noodzakelijk om toe te voegen de PBS van de kant van de cultuur-putten om te voorkomen dat het wassen van de cellen.
- Neem de monsters uit de cel incubator en verwijderen van het medium door aspiratie. Spoel de cellen 1 x met 1 mL PBS.
-
Fixatie
- Het herstellen van de cellen met de 500 µL van 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na de fixatie, spoel zachtjes de cellen 3 x met 1 mL PBS, 5 minuten elk, verwijderen van de resterende 4% paraformaldehyde.
Opmerking: Het optimale tijdstip voor fixatie van de cel moet worden bepaald volgens de celtypes. Na de fixatie, voeg 1 mL PBS van de kant van de cultuur-putten en laat het monster op de tabel voor 5 min. Gebruik geen een lab shaker, om ervoor te zorgen een minimaal verlies van cellen.
- Het herstellen van de cellen met de 500 µL van 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na de fixatie, spoel zachtjes de cellen 3 x met 1 mL PBS, 5 minuten elk, verwijderen van de resterende 4% paraformaldehyde.
-
Permeabilization
- Permeabilize van de monsters met 0,2% TritonX-100 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na permeabilization, spoel de cellen zachtjes met 1 mL PBS voor drie keer 5 minuten elk.
Opmerking: Het optimale tijdstip voor cel permeabilization moet worden bepaald volgens celtypes. Na permeabilization, voeg 1 mL PBS de kant van de cultuur-putten, laat het monster op de tafel voor 5 min. Gebruik geen een lab-shaker om de minimaal verlies van cellen.
- Permeabilize van de monsters met 0,2% TritonX-100 in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na permeabilization, spoel de cellen zachtjes met 1 mL PBS voor drie keer 5 minuten elk.
-
Blokkeren
- 1 mL 10% geit serum in PBS toevoegen aan elk monster en laat het monster op de tabel voor 1 h voor het blokkeren van alle niet-specifieke interacties.
Opmerking: Gebruik geen een lab shaker, om te voorkomen dat de cellen loskoppelen van de dia. Een spoelen is niet nodig in deze stap.
- 1 mL 10% geit serum in PBS toevoegen aan elk monster en laat het monster op de tabel voor 1 h voor het blokkeren van alle niet-specifieke interacties.
-
Incubatie met primair antilichaam
- Verdun het primaire antilichaam met primair antilichaam verdunning buffer.
Opmerking: Voor een optimaal resultaat de ratio van de uiteindelijke verdunning van het primaire antilichaam moet worden bepaald door dit. De verdunningsverhoudingen van anti-Nestin (voor ongedifferentieerde stamcellen), anti-β-tubuline III (voor neuron), anti-O4 (voor Oligodendrocyt), anti-NF200 (voor volwassen neuronen), anti-ChAT (voor cholinerge neuronen), anti-LHX3 (voor motorische neuronen), anti-GABA (voor GABAergic neuronen), anti-serotonine (voor serotonerge neuronen) en anti-TH (voor Dopaminerge neuronen) zijn 1:80, 1:200, 1:100, 1:100, 1:100, 1:200, 1:100, 1:200 en 1:100, respectievelijk. - 300 µL van verdunde primaire antilichamen toepassen door verschillende monsters.
- Incubeer de celsteekproeven 's nachts bij 4 ° C.
Opmerking: Het is aanbevolen om primaire antilichamen bij 4 ° C om de achtergrond en de niet-specifieke kleuring uit te broeden. - Verwijder de primaire antilichamen en zachtjes spoel de cellen 3 x met 1 mL PBS.
- Verdun het primaire antilichaam met primair antilichaam verdunning buffer.
-
Incubatie met secundair antilichaam
- Verdun de Cy3-geconjugeerde of Alexa Fluor 488-geconjugeerde secundaire antilichamen met behulp van 3% geit serum in PBS.
Opmerking: Voor een optimaal resultaat de ratio van de uiteindelijke verdunning van het secundaire antilichaam moet worden bepaald door dit. - Breng 300 µL van relevante secundaire antilichamen te detecteren elke primair antilichaam.
Opmerking: Alle van de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in het donker om te voorkomen dat fluorescentie blussen. - Incubeer het monster van de cel in het donker gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder de secundaire antilichamen en spoel de cellen zachtjes met 1 mL PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Verdun de Cy3-geconjugeerde of Alexa Fluor 488-geconjugeerde secundaire antilichamen met behulp van 3% geit serum in PBS.
-
Nucleaire kleuring
- Toepassing 500 µL van Hoechst 33258 werkende oplossing om onder te dompelen van het monster van de cel.
- Incubeer het monster van de cel in het donker gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur op het etiket van de kernen.
- Spoel zachtjes de cellen 3 x met 1 mL PBS, 10 minuten elk, beschermd tegen licht.
Opmerking: Voor een minimaal verlies van cellen, de optimale wassen voorwaarde moet worden bepaald empirisch.
-
Montage
- Breng een druppel van montage medium in het midden van de microslide.
- Neem uit de coverslips (met voorbeelden) pincet gebruiken en plaats het monster op de top van het montage-medium. Vermijd luchtbellen.
- Verwijder alle overtollige montage medium met absorberend papier.
-
Fluorescentie microscopie observatie
- Observeer de monsters onder de fluorescentie microscopie uitgerust met filters voor Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 en Cy3. Voor elk monster, willekeurig selecteren ten minste 8-12 velden en record beelden met een camera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cel morfologie werd waargenomen onder de omgekeerde Microscoop elke dag na de behandeling van de CAP. Figuur 2 toont de gewone omgekeerde fase contrast lichte Microscoop beelden van de celdifferentiatie in beide cellijnen. De plasma-testgroep vertoont een versnelde differentiatie tarief en een hoge differentiatie-verhouding ten opzichte van de controle en gas flow-groep.
De immunefluorescentie resultaten van C17.2-NSCs en primaire rat NSCs gekweekt voor 6 d na de behandeling worden weergegeven in Figuur 3 en Figuur 4, respectievelijk. Nestin (+, groen) daalde, β-tubuline III (+, rood) aanzienlijk verhoogd, en O4 (+, groen) licht gestegen beide cellijnen in vergelijking met de controlegroep. CAP behandelingen van 60 s wezenlijk verbeterd de C17.2-NSCs in neuronale geslacht in vergelijking met de controlegroep en de groep van gas flow behandeling. Zuiver gasstroom had geen zichtbaar effect op het NSC-differentiatie.
Figuur 5 toont de neuronale lot specificatie in de 60 s plasma behandeling groep. Sterke uitdrukkingen van NF200 (voor volwassen neuron), ChAT (voor cholinerge neuron) en LHX3 (voor motor neuron) werden waargenomen. GABAergic en serotonerge neuronen werden zelden gezien, terwijl geen Dopaminerge neuronen werden ontdekt.
Figuur 1 : Schematische van de experimentele opstelling. Het plasma jet-apparaat is aangesloten op de draad van de uitvoer van de hoog-voltage power supply. De hoogspannings-sonde met oscilloscoop wordt gebruikt voor het detecteren van de uitgangsspanning. Wanneer de werken gassen zijn stroomt via de spuit en de hoogspanning brandt, de plasma-jet wordt gegenereerd en propageren in de open lucht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Gewone omgekeerde fase contrast lichte Microscoop beelden voor C17.2-NSCs en primaire rat NSCs. Dit percentage is aangepast van Xiong et al. 8 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Immunofluorescentie detectie van onbehandelde C17.2-NSCs (links), 60 s gas flow-behandeld C17.2-NSCs (midden), en 60 s plasma-behandeld C17.2-NCSs (rechts) voor 6 d van cultuur. Nestin (+, groen) / Hoechst; Β-tubuline III (+, rood) / Hoechst; O4 (+, groene) / Hoechst. De nucleaire is gekleurd met Hoechst 33258. Dit percentage is aangepast van Xiong et al. 8 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Immunofluorescentie opsporing van onbehandelde primaire rat NSCs (links), 60 s gas flow-behandelde primaire rat NSCs (midden), en 60 s plasma-behandelde primaire rat NSCs (rechts) voor 6 d van cultuur. Nestin (+, groen) / Hoechst; Β-tubuline III (+, rood) / Hoechst; O4 (+, groene) / Hoechst. De nucleaire is gekleurd met Hoechst 33258. Dit percentage is aangepast van Xiong et al. 8 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Neuronale lot specificatie studeerde met immunofluorescentie in de 60 s plasma behandeling groep. NF200 (+, rode) / Hoechst; ChAT (+, rood) / Hoechst; LHX3 (+, rode) / Hoechst; GABA (+, rood) / Hoechst; Serotonine (+, rood) / Hoechst; TH (+, rood) / Hoechst. De nucleaire is gekleurd met Hoechst 33258. Dit percentage is aangepast van Xiong et al. 8 met toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C17.2-NSCs is een soort van vereeuwigd neurale stamcellen lijn van neonatale muis cerebellaire granulaire laag cellen, ontwikkeld door Snyder en anderen10,11. C17.2-NSCs in de neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en kunnen onderscheiden en worden veel gebruikt in de neurowetenschappen12. In onze eerdere studie, kon CAPs de differentiatie van C17.2-NSCs in de neuronen verbeteren. Een bewijs-van-principe studie ook uitgevoerd met behulp van primaire rat NSCs, en het effect van de plasma-blootstelling op de primaire rat NSCs was kwalitatief vergelijkbaar met die van de C17.2-NSCs, met een sterkere differentiatie van neuronen. CAPs, een roman van de fysisch-chemische technologie, kunnen vertegenwoordigen een veelbelovend instrument voor neurologische ziekte therapie, zoals de ziekte van Alzheimer, PD, ruggenmerg letsel, en anderen.
Behandeling van de CAP biedt een one-step manier om zowel C17.2 NSC als primaire rat NSC differentiatie in vitro met een korte behandeltijd en weinig celbeschadiging. Bovendien, de resultaten vertoonden dat een ~ 75% geregisseerd differentiatie in neuronen, waardoor plasma behandeling een veelbelovende methode om toekomstige weefsel transplantaties in de kliniek. Het huidige protocol aangeworven echter slechts één soort CAP apparaten voor NSC differentiatie. De beperking van het gebruik van deze microplasma is de nonuniformity als de plasma rookpluim de 12-well-plaat behandelt. Toekomstige werkzaamheden zal overwegen met behulp van een groot volume plasma apparaat of plasma-activated medium voor uniforme behandeling.
Er zijn verschillende kritische stappen binnen het protocol. Eerst, elke stap van het wassen moet worden zorgvuldig uitgevoerd, voor de cellen zijn gemakkelijk uitneembaar na de differentiatie. De procedures van fixatie en permeabilization zijn andere kritische stappen in immunokleuring. De fixatie is nodig voor het behoud van de morfologie en de antigenicity van de cellen13. Permeabilization kunnen antilichamen te binden aan de intracellulaire en nucleaire antigenen14. De optimale tijd voor fixatie en permeabilization moet worden bepaald door middel van dit. Immunofluorescentie blokkeren en antilichaam-incubatie zijn even belangrijk als zachte wassen stappen. Het is aanbevolen om het gebruik van dierlijke serum uit dezelfde bron als het secundaire antilichaam ter dekking van de endogene niet-specifieke bindende proteïnen. Voor een optimaal resultaat moet de verhouding van de uiteindelijke verdunning van het antilichaam worden bepaald door dit. Wat betreft de behandeling van plasma, moet de plasma-dosering gelden zeer zorgvuldig; lange tijd en intense plasma behandeling zal veroorzaken cel apoptosis of necrose. Daarom moeten de behandeltijd en afstand worden pretested.
Kortom, dit manuscript een stapsgewijze protocol voorziet inducerende NSC differentiatie met behulp van een atmosferische plasma jet en hoogtepunten van kritieke problemen tijdens het hele proces. CAPs kunnen de differentiatie van NSCs in de neuronen verbeteren en duidelijk gunstig zal zijn voor de behandeling van neurologische aandoeningen. Het is ook de moeite waard om op te merken dat het huidige protocol alleen richt zich op het effect in vitro van CAPs op NSCs. Het is noodzakelijk voor toekomstige studies om te evalueren van het effect van plasma in vivo met behulp van Muismodellen van zenuw schade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de Huazhong geleerde programma, het onafhankelijke innovatiefonds van de Huazhong Universiteit voor wetenschap en technologie (nr. 2018KFYYXJJ071) en de nationale Natural Science Foundation van China (nrs. 31501099 en 51707012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
- Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
- Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
- Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
- Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
- Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
- Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
