Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Différenciation des cellules souches nerveuses par un traitement d’un Plasma atmosphérique froid en une seule étape d' In Vitro

Published: January 11, 2019 doi: 10.3791/58663
Automatic Translation
*1, *2, 3
1State Key Laboratory of Advanced Electromagnetic Engineering and Technology, Huazhong University of Science and Technology, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Pathophysiology, Beijing Neurosurgical Institute/Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Ce protocole vise à fournir une procédure expérimentale détaillée d’un traitement plasma atmosphérique froid sur les cellules souches neurales et détection par immunofluorescence pour l’amélioration de la différenciation.

Abstract

Comme le développement de la technologie plasma physique, plasmas atmosphériques froids (CAPs) ont été largement étudiées dans la décontamination, le traitement du cancer, la cicatrisation des plaies, traitement de canal, etc., formant un nouveau champ de recherche nommé plasma médecine. Est un mélange d’espèces réactives électriques, chimiques et biologiques, casquettes ont montré leurs capacités à améliorer la différenciation des cellules souches nerveuses les deux in vitro et in vivo et sont devenant une voie prometteuse pour le traitement des maladies neurologiques dans l’avenir. Les nouvelles beaucoup plus excitants sont qu’utilisant des amorces à peut réaliser en une seule étape et en toute sécurité réalisé, différenciation des cellules souches neurales (CNS) pour le transport du tissu. Nous montrons ici le protocole expérimental détaillé d’utilisant un dispositif de CAP jet fait par soi-même afin d’améliorer la différenciation NSC C17.2-CNS et primaires de rats des cellules souches neurales, ainsi qu’observant le sort de la cellule par inversé et microscopie de fluorescence. Avec l’aide d’immunofluorescence souillant la technologie, nous avons trouvé les deux les CNS ont montré un taux de prime accéléré que le groupe non traité, et ~ 75 % des CNS sélectivement différencient en neurones, qui sont principalement des adultes, cholinergiques et moteur neurones.

Introduction

La différenciation dirigée des CNS en une certaine lignée pour le transport de tissus est considérée comme une des thérapies plus prometteuses de maladies neurodégénératives et Alhzeimer1. Par exemple, les neurones dopaminergiques catécholaminergiques sont particulièrement souhaitées dans le traitement de la maladie de Parkinson (MP). Cependant, les méthodes traditionnelles pour préparer les cellules souhaitées pour le transport ont beaucoup d’inconvénients, tels que la toxicité chimique, la formation de cicatrices ou autres, qui empêche en grande partie les demandes des CNS en médecine régénérative2. Par conséquent, il est très nécessaire de trouver un roman et un moyen sûr pour la différentiation de la NSC.

Le plasma est le quatrième état de la matière, suivant solides, liquides et gaz, et elle constitue plus de 95 % des affaires dans l’univers tout entier. Plasma est électriquement neutre avec non consolidé positif/négatif et de particules neutres et est généralement générée par une décharge haute tension en laboratoire. Dans les deux dernières décennies, l’application du plasma en biomédecine a attiré l’attention énorme dans le monde entier comme le développement de la technologie du plasma froid la pression atmosphérique. Grâce à cette technique, plasma à basse température stable peut être générée dans l’air ambiant à l’atmosphère sans formation de l’arc et se compose de diverses espèces réactives, comme les espèces réactives de l’azote (RNS), espèces réactives de l’oxygène (ROS), aux ultraviolets (UV) rayonnement, électrons, ions et champ électrique3. Casquettes ont des avantages uniques pour l’inactivation des micro-organismes, le traitement du cancer, la cicatrisation, traitement des maladies de la peau, la prolifération cellulaire et cellules différenciation4,5,6,7. Dans un travail antérieur, nous avons démontré que jet de plasma atmosphérique froid peut améliorer la différenciation des CNS dans les cellules souches neurales murin C17.2 (C17.2-CNS) tant primaires de rats des cellules souches neurales, présentant un grand potentiel pour devenir un outil puissant pour le réalisé différenciation des CNS8. Bien que le mécanisme de mise en valeur de CAP de la différenciation du NSC n’est pas entièrement compris encore, NO généré par CAPs a été prouvé d’être un facteur clé dans le processus. Dans ce travail, nous visons à fournir un plan expérimental détaillé de l’utilisation d’un plasma d’hélium/oxygène pression atmosphérique jet pour le traitement des CNS en vitro, préparation de cellules et prétraitement, observation de la morphologie par microscope inversé, et observation de microscopie par fluorescence d’immunofluorescence souillant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. cell Cultures et Predifferentiation

  1. Predifferentiation et la culture de cellules souches neurales
    1. Préparer les lamelles de poly-D-lysine-enduit. Mettre une lamelle stérile (20 mm de diamètre) dans une plaque de 12 puits. Recouvrir le couvercle en verre avec poly-D-lysine, 0,1 % p/v, dans l’eau (Table des matières) pour une meilleure adhérence de la cellule sur le couvre-objet en suivant les étapes suivantes.
      Remarque : Des conditions optimales doivent être déterminées pour chaque ligne de la cellule et la demande.
      1. Aseptiquement recouvrir la surface de la lamelle avec poly-D-lysine, 0,1 % p/v, dans l’eau. Rocher doucement pour assurer une couche uniforme de la surface de la lamelle couvre-objet.
      2. Après mise en culture pendant la nuit (~ 12 h) à 37 ° C, enlever la solution de poly-D-lysine et rincer la surface 3 x avec 1 mL d’eau stérile.
      3. Sécher les cellules au moins 30 min avant de les semer.
  2. Predifferentiation et des cellules souches neurales C17.2 (C17.2-NSC) culture
    1. Incuber C17.2-CNS dans un ballon jaugé de 25 cm2 au moyen de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 5 % de sérum de cheval (HS) et 1 % la pénicilline/streptomycine à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant environ 2-3 jours.
    2. Lorsque les cellules atteignent 85 % confluence, retirez le support, laver les cellules avec 1 mL de PBS et ajouter 1 mL de trypsine fraîche (0,25 %) dans le ballon. Laissez-le pendant 1 minute ; Ensuite, ajouter 1 mL de milieu de culture à la fiole et la pipette de monter et descendre plusieurs fois pour assurer une suspension monocellulaire.
    3. Compter la densité des cellules de la suspension à l’aide d’un hémocytomètre. Calculer le volume requis de suspension cellulaire pour donner une concentration finale de cellule de 2 x 104 cellules/mL.
    4. Semences C17.2-CNS sur les lamelles couché dans la plaque de 12 puits avec la densité de ~ 2 x 104 cellules par puits. Vérifiez la densité des cellules au microscope.
      Remarque : Pour un meilleur résultat, la densité cellulaire optimale doit être déterminée avant l’expérience de l’immunofluorescence.
    5. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur à cellules pendant 12 h permettant l’attachement.
    6. Après fixation, laver les cellules 2 x 1 ml de PBS et cultiver les cellules avec un moyen de différenciation consistant en DMEM/F12 avec supplément de 1 % N2 pendant 48 h avant le traitement du plasma.
  3. Predifferentiation et la culture de cellules souches neurales primaires de rat
    1. Culture de la suspension des primaires de rat NSC dans le milieu de croissance du rat NSC dans des flacons de T25 non couchés à une densité de 5 x 105 cellules.
      Remarque : La CNS primaires de rat ont été isolées suivant le protocole du Xie et al. 9.
    2. Vérifier la formation des neurospheres sous un microscope inversé. Veillez à ce que la morphologie de le neurospheres des pièces complexes multicellulaires sphériques et transparents.
    3. Lorsque les neurospheres atteindre un diamètre de 3 mm ou plus, transférer la suspension neurosphère dans un tube de centrifugation stérile de 15 mL et laisser les neurospheres s’installent par gravité.
    4. Retirez le surnageant soigneusement afin de laisser le neurospheres dans un volume minimal de support.
    5. Rincer les neurospheres 1 x 5 ml de PBS et laissez les neurospheres régler par gravité. Retirez le surnageant pour laisser un volume minimal de PBS.
    6. Ajouter un volume approprié de différenciation support pour ajuster la densité cellulaire à environ 12-15 neurospheres par millilitre. Le moyen de différenciation pour les primaires de rat CNS se compose de DMEM/F12, 2 % B27 et 1 % FBS.
    7. 1 mL de suspension neurosphère sur chaque lamelle couché dans la plaque de 12 puits de graines.
      NOTE : Secouer la plaque doucement pour faire en sorte que les neurospheres sont réparties uniformément. Cette étape est essentielle pour un meilleur résultat d’immunofluorescence.
    8. Placer la plaque dans l’incubateur et permettez-lui de predifferentiate pendant 24 h avant le traitement du plasma.

2. préparation des Jets de Plasma

  1. Choisir un tube de quartz semi-ouverte avec un diamètre intérieur de 2 mm et un diamètre extérieur de 4 mm. insérer un fil de haute tension avec un diamètre de 2 mm dans le tube.
  2. Insérez le tube de quartz d’un câble de haute tension dans une seringue de 5 mL et utilisez un support pour le monter à l’intérieur du centre de la seringue. Définir la distance entre l’extrémité scellée du tube quartz et l’embout de la seringue à 1 cm.
  3. Raccorder un tuyau de caoutchouc de silicone de 1 m (avec un diamètre intérieur de 12 mm) à l’extrémité ouverte de la seringue et, ensuite, connectez-le à la valve du débitmètre et du gaz dans l’ordre.

3. acquisition des Jets

  1. Raccordez le circuit tel qu’illustré à la Figure 1. Connectez le fil de sortie de l’alimentation à l’appareil de jet de plasma et, ensuite, connectez l’extrémité de la sonde haute tension avec le fil de sortie pour détecter la tension. Connectez l’autre extrémité de la sonde haute tension à l’oscilloscope pour enregistrer les informations de la tension de sortie. Vérifiez le circuit entier et assurez-vous que l’alimentation, l’oscilloscope et la sonde haute tension sont tous mis à la terre.
  2. Contrôler la conduite de gaz. Assurez-vous que le tube de gaz a été connecté à l’appareil de jet de plasma ; Ensuite, ouvrez le robinet de gaz de l’hélium (fraction volumique, 99,999 %) et l’oxygène (fraction volumique, 99,999 %) et régler le débit de gaz de 1 L:0.01 L/min (He : O2).
    Remarque : Laissez le débit de gaz pendant plusieurs minutes avant d’allumer l’alimentation électrique pour la première fois.
  3. Définir l’amplitude de l’impulsion, la fréquence et largeur d’impulsion comme 8 kV, 8 kHz et ns 1600, respectivement. Contrôler le circuit de nouveau et puis, mettez le bouton de sortie pour créer un jet de plasma.
    Attention : Ne pas toucher le fil haute tension à tout moment.

4. plasma traitement des cellules souches neurales

  1. Définir la distance entre l’embout de la seringue et le trou bien cellule à 15 mm.
    Remarque : La distance est mesurée à partir du bas de la plate-forme où se trouve la plaque de 12 puits.
  2. Prendre la plaque de 12 puits hors de l’incubateur et changer le support des cellules predifferentiated à 800 µL de milieu frais de différenciation.
  3. Diviser les cellules en trois groupes : un groupe témoin non traité, un groupe de traitement en flux 60 s He-et-O2 (1 %) gaz et un groupe de traitement plasma s 60.
    Remarque : Il n’y a aucune perte de liquide évidente en vertu de la condition de traitement.
  4. Placer la plaque de 12 puits sous les jets de plasma, assurez-vous que l’embout de la seringue est fixé au centre de chaque trou et donner le traitement pour les différents groupes mentionnés à l’étape 4.3.
    Remarque : Les témoins non traités étaient gardés dans moyen de différenciation à température ambiante pendant la procédure expérimentale pour assurer un traitement uniforme des conditions. Le groupe de traitement débit gaz He-et-O2 (1 %) a été traité avec seulement un il et le débit de gaz O2 (1 %), sans génération d’un plasma. Tous les traitements doivent être effectuées en trois exemplaires.

5. neural Stem Cell Differentiation

  1. Après le traitement, retirer la culture d’origine et ajouter 1 mL de milieu de différenciation nouvelle à chaque puits.
  2. Incuber les cellules dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2 pour 6 d. changer le support de tous les autres jours.
  3. Vérifier l’état de différenciation des différents groupes tous les jours sous un microscope optique à contraste de phase inversé. Au hasard, sélectionnez au moins 12 champs et prendre des photos pour enregistrer les modifications morphologiques.

6. immunofluorescence souillant

  1. Rinçage
    1. Effectue les prélèvements hors de l’incubateur de cellules et enlever le support par aspiration. Rincer les cellules 1 x 1 ml de PBS.
      Remarque : Après la différenciation, les cellules sont détachent facilement. Il est nécessaire d’ajouter le PBS du côté des puits de culture afin d’éviter de laver les cellules.
  2. Fixation
    1. Fixer les cellules avec 500 µL de paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 min à température ambiante. Après fixation, rincer doucement les cellules 3 x 1 ml de PBS, 5 min chacun, pour enlever la paraformaldéhyde résiduelle de 4 %.
      Remarque : Le moment optimal pour la fixation de la cellule doit être déterminée selon les types de cellules. Après fixation, ajouter 1 mL de PBS du côté des puits de culture et de laisser l’échantillon sur la table pendant 5 min. N’utilisez pas un agitateur lab, pour assurer une perte minimale de cellules.
  3. Perméabilisation
    1. Permeabilize les échantillons avec 0,2 % TritonX-100 en PBS pendant 10 min à température ambiante. Après perméabilisation, rincer les cellules doucement avec 1 mL de PBS de trois fois, 5 min chacun.
      Remarque : Le point de temps optimal de perméabilisation de la cellule doit être déterminé selon les types de cellules. Après perméabilisation, ajouter 1 mL de PBS du côté des puits de culture, laisser l’échantillon sur la table pendant 5 min. N’utilisez pas un agitateur de laboratoire pour assurer la perte minimale des cellules.
  4. Blocage
    1. Ajouter 1 mL de sérum de chèvre de 10 % dans du PBS à chaque échantillon et laisser l’échantillon sur la table pendant 1 h à bloquer les interactions non spécifiques.
      Remarque : N’utilisez pas un agitateur lab, pour empêcher les cellules de détacher de la diapositive. Un rinçage n’est pas nécessaire dans cette étape.
  5. Incubation avec l’anticorps primaire
    1. Diluer l’anticorps primaire à l’aide du tampon de dilution de l’anticorps primaire.
      Remarque : Pour des résultats optimaux, le coefficient de dilution finale de l’anticorps primaire doit être déterminé par prétest. Le taux de dilution de l’anti-Nestin (pour les cellules souches indifférenciées), anti-β-tubuline III (pour le neurone), anti-chat (pour les neurones cholinergiques), anti-LHX3 (pour les neurones moteurs), anti-GABA (pour anti-O4 (pour les oligodendrocytes), anti-NF200 (pour les neurones matures) Les neurones GABAergiques), anti-sérotoninergique (pour les neurones sérotoninergiques) et anti-TH (pour les neurones dopaminergiques) sont respectivement de 1 : 80, 1 : 200, au 1/100, 1/100, 1/100, 1 : 200, 1/100, 1 : 200 et 1/100.
    2. S’applique à 300 µL d’anticorps primaires dilués aux différents échantillons.
    3. Incuber les échantillons de cellules durant la nuit à 4 ° C.
      Remarque : Il est recommandé pour l’incubation des anticorps primaires à 4 ° C pour réduire le fond et la coloration non spécifique.
    4. Retirer les anticorps primaires et rincer doucement les cellules 3 x 1 ml de PBS.
  6. Incubation avec l’anticorps secondaire
    1. Diluer les anticorps secondaires conjugué Cy3 ou conjugué Alexa Fluor 488 à l’aide de sérum de chèvre de 3 % dans du PBS.
      Remarque : Pour des résultats optimaux, le coefficient de dilution finale de l’anticorps secondaire doit être déterminé par prétest.
    2. Appliquer 300 µL d’anticorps secondaires pertinents pour détecter chaque anticorps primaire.
      Remarque : Toutes les étapes subséquentes ont besoin sera effectué dans l’obscurité afin d’empêcher l’extinction de la fluorescence.
    3. Incuber l’échantillon cellulaire dans l’obscurité pendant 2 h à température ambiante.
    4. Retirer les anticorps secondaires et rincer les cellules doucement avec 1 mL de PBS pendant 10 min à température ambiante.
  7. La coloration des noyaux
    1. Appliquer 500 µL de solution de travail Hoechst 33258 de plonger l’échantillon cellulaire.
    2. Incuber l’échantillon cellulaire dans l’obscurité pendant 8 min à température ambiante pour étiqueter les noyaux.
    3. Rincer doucement les cellules 3 x 1 ml de PBS, 10 min chacun, abri de la lumière.
      Remarque : Pour une perte minimale de cellules, la condition de lavage optimale doit être déterminée empiriquement.
  8. Montage
    1. Déposer une goutte de milieu de montage dans le centre de la micro-lames.
    2. Sortir les lamelles couvre-objet (avec exemples) à l’aide de la pince à épiler et positionner avec soin l’échantillon sur le dessus du milieu de montage. Éviter les bulles d’air.
    3. Supprimer n’importe quel milieu de montage excédentaire avec du papier absorbant.
  9. Observation de la microscopie de fluorescence
    1. Observer les échantillons en vertu de la microscopie à fluorescence équipé de filtres pour Hoechst 33258 et Alexa Fluor 488 Cy3. Pour chaque échantillon, choisir au hasard au moins 8-12 champs et enregistrer des images avec un appareil photo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La morphologie cellulaire a été observée au microscope inversé tous les jours après le traitement de la CAP. Figure 2 montre les images de microscopie ordinaire inversé à contraste de phase de la différenciation cellulaire dans les deux lignées cellulaires. Le groupe imprégnées de plasma expose un taux de différentiation accélérée et un taux élevé de différenciation comparée au groupe contrôle et gaz flux.

Les résultats par immunofluorescence de C17.2-CNS et les primaires de rat CNS cultivés pendant 6 jours après le traitement sont indiqués dans la Figure 3 et Figure 4, respectivement. Diminué de nestin (+ vert), β-tubuline III (+, rouge), augmenté de façon significative, et O4 (+, vert) a légèrement augmenté dans les deux lignées comparées au groupe témoin de cellules. Traitements de CAP des 60 s améliorée efficacement les C17.2-CNS en lignée neuronale par rapport au groupe témoin et le groupe de traitement de flux de gaz. Débit de gaz pur n’eu aucun effet visible sur la différenciation de la NSC.

La figure 5 illustre la spécification neuronale sort dans le groupe de traitement plasma s 60. On a observé des affirmations vigoureuses du NF200 (pour les neurones matures), ChAT (pour les neurones cholinergiques) et LHX3 (pour les motoneurones). GABAergique et neurones sérotoninergiques ont été rarement vu, alors qu’aucun neurones dopaminergiques ont été détectés.

Figure 1
Figure 1 : Schéma de l’installation expérimentale. Le jet de plasma est connecté au fil de sortie de l’alimentation haute tension. La sonde haute tension avec oscilloscope sert à détecter la tension de sortie. Lorsque les gaz de travail sont circulant dans la seringue et la haute tension est activé, le jet de plasma sera généré et se propagent à l’air libre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Ordinaire inversé les images de microscopie à contraste de phase pour C17.2-CNS et les primaires de rat CNS. Ce chiffre est une adaptation de Xiong et al. 8 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Détection par immunofluorescence des CNS-C17.2 non traitées (à gauche), 60 gaz s flux traités C17.2-CNS (au milieu) et 60 s plasma imprégnées C17.2-SSCC (à droite) pendant 6 jours de culture. Nestin (+, vert) / Hoechst ; Β-tubuline III (+, rouge) / Hoechst ; O4 (+, vert) / Hoechst. Le nucléaire est taché de Hoechst 33258. Ce chiffre est une adaptation de Xiong et al. 8 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Détection par immunofluorescence de rat primaire non traitée CNS (à gauche), 60 s gaz flux primaire rat traité CNS (au milieu) et 60 s plasma primaire rat traité CNS (à droite) pendant 6 jours de culture. Nestin (+, vert) / Hoechst ; Β-tubuline III (+, rouge) / Hoechst ; O4 (+, vert) / Hoechst. Le nucléaire est taché de Hoechst 33258. Ce chiffre est une adaptation de Xiong et al. 8 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Spécification neuronale sort étudié par immunofluorescence dans le groupe de traitement plasma s 60. NF200 (+, rouge) / Hoechst ; ChAT (+, rouge) / Hoechst ; LHX3 (+, rouge) / Hoechst ; GABA (+, rouge) / Hoechst ; Sérotonine (+, rouge) / Hoechst ; TH (+, rouge) / Hoechst. Le nucléaire est taché de Hoechst 33258. Ce chiffre est une adaptation de Xiong et al. 8 avec permission. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C17.2-CNS est une sorte de ligne immortalisé les cellules souches neurales de cellules de souris néonatales couche granuleuse cérébelleuse, développé par Snyder et d’autres10,11. C17.2-CNS peuvent se différencier en neurones, astrocytes et oligodendrocytes et sont largement utilisés dans les neurosciences12. Dans notre étude précédente, casquettes pourraient favoriser la différenciation des C17.2-CNS en neurones. Une étude de démonstration des principes a été également réalisée avec CNS primaires de rat, et l’effet de l’exposition plasmatique sur les primaires de rat CNS était qualitativement semblable à celle des C17.2-CNS, avec une forte différenciation des neurones. Casquettes, une nouvelle technologie physico-chimique, peuvent représenter un outil prometteur pour la thérapie de maladies neurologiques, telles que la maladie d’Alzheimer, PD, la moelle épinière et d’autres.

Traitement du CAP offre un moyen d’en une seule étape pour améliorer C17.2 NSC et primaires de rat NSC différenciation in vitro avec un temps de traitement court et peu de dégâts cellulaires. En outre, les résultats ont montré qu'une ~ 75 % réalisé la différenciation dans les neurones, qui a fait le traitement au plasma une méthode prometteuse pour la transplantation de tissus future dans la clinique. Cependant, le protocole actuel recrutés uniquement un seul type de dispositifs de CAP pour la différentiation de la NSC. La limitation de l’utilisation de cette microplasma est la non-uniformité lorsque le panache de plasma traite la plaque de 12 puits. Travaux futurs envisagera d’utiliser un dispositif plasma grand volume ou un support activé par plasma pour uniformiser le traitement.

Il y a plusieurs étapes cruciales au sein du protocole. Tout d’abord, chaque étape de lavage doit être soigneusement réalisée, car les cellules sont détachent facilement après la différenciation. Les modalités de fixation et perméabilisation sont autres étapes critiques en immunohistochimie. La fixation est nécessaire pour respecter la morphologie et l’antigénicité des cellules13. Perméabilisation permet d’anticorps à lier les antigènes intracellulaires et nucléaire14. Le moment optimal pour la fixation et la perméabilisation doit être déterminé par prétest. Immunofluorescence bloquant et anticorps d’incubation sont aussi importants que les étapes de lavage doux. Il est recommandé d’utiliser le sérum animal de la même source que l’anticorps secondaire pour couvrir les protéines endogènes de liaison non spécifique. Pour des résultats optimaux, le coefficient de dilution finale de l’anticorps doit être déterminé par prétest. En ce qui concerne le traitement du plasma, le dosage plasmatique doit être appliqué très soigneusement ; traitement intense et de longue date de plasma induit apoptose ou nécrose. Par conséquent, la durée du traitement et la distance doivent être pré-testés.

En résumé, ce manuscrit fournit un protocole étape par étape pour induire la différenciation NSC en utilisant un jet de plasma atmosphérique et met en évidence des questions cruciales pendant tout le processus. Casquettes peuvent améliorer la différenciation des CNS en neurones et aura sans doute bénéfiques pour le traitement des maladies neurologiques. Il convient également de noter que le protocole actuel se concentre uniquement sur l’effet in vitro de casquettes sur CNS. Il est nécessaire pour de futures études évaluer l’effet du plasma in vivo à l’aide de modèles murins de la lésion nerveuse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Huazhong Scholar Program, le fonds d’Innovation indépendante de l’Université Huazhong des sciences et de technologie (n° 2018KFYYXJJ071) et la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (nos 31501099 et 51707012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Coverslip NEST 801008
Poly-D-lysine Beyotime P0128
DMEM medium HyClone SH30022.01B stored at 4 °C
DMEM/F12 medium HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
N2 supplement Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
B27 supplement Gibco 17504044 stored at -20 °C and protect from light
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Donor Horse serum HyClone SH30074.03 tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010 stored at 4 °C
Trypsin HyClone 25300054 stored at 4 °C
PBS solution HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
TritonX-100 Sigma T8787
Normal Goat Serum Blocking Solution Vector Laboratories S-1000-20 stored at 4 °C
anti-Nestin Beyotime AF2215 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-β-Tubulin III Sigma Aldrich T2200 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-O4 R&D Systems MAB1326 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-NF200 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-ChAT Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti- LHX3 Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-GABA Sigma stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-Serotonin Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
anti-TH Abcam, Cambridge, MA stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
Alexa Fluor 488- Labeled Goat Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
Anti-Mouse IgG 
12-well plate corning 3512
25 cm2 flask corning 430639
Hoechst 33258 Beyotime C1018 stored at -20 °C and protect from light
Mounting medium Beyotime P0128 stored at -20 °C and protect from light
Light microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics Company XD-202
Fluorescence microscopy Nikon 80i
High – voltage Power Amplifier Directed Energy PVX-4110
DC power supply Spellman SL1200
Function Generator Aligent  33521A
Oscilloscope Tektronix DPO3034
High voltage probe Tektronix P6015A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
  2. Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
  3. Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
  4. Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
  5. Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
  6. Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
  7. Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
  8. Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
  9. Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
  10. Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
  11. Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
  12. Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).

Tags

Plasmas atmosphériques froid génie numéro 143 gaz de décharge différenciation les cellules souches neurales immunofluorescence C17.2-CNS CNS primaires de rat
Différenciation des cellules souches nerveuses par un traitement d’un Plasma atmosphérique froid en une seule étape d' <em>In Vitro</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve… More

Xiong, Z., Zhao, S., Yan, X. Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro. J. Vis. Exp. (143), e58663, doi:10.3791/58663 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter