Summary
Denne protokollen mål å gi detaljerte eksperimentelle trinnene i en kald atmosfæriske plasma behandling på embryonale stamceller og immunofluorescence gjenkjenning for differensiering ekstrautstyr.
Abstract
Som utviklingen av fysiske plasma-teknologi, kaldt atmosfæriske plasmas (CAPs) har vært mye undersøkt i dekontaminering, kreftbehandling, sårheling, rotfylle, etc., danner et nytt forskningsfelt kalt plasma medisin. Å være en blanding av elektriske, kjemiske og biologiske reaktive arter, CAPs har vist sine evner til å forbedre nerve stamceller differensiering både i vitro og i vivo og er blitt en lovende måte nevrologisk sykdom behandling i fremtiden. Den mye mer spennende nyheten er at bruke CAPs kan innse ettrinns og trygt rettet, differensiering av nevrale stamceller (NSCs) for vev transport. Her viser vi detaljerte eksperimentelle protokollen bruker en Self-Made CAP jet enhet for å forbedre NSC differensiering i C17.2-NSCs og primære rotte nevrale stamceller, som observerer celle skjebnen av invertert og fluorescens mikroskopi. Med hjelp av immunofluorescence flekker teknologi, vi fant både NSCs viste en akselererende differensial hastighet enn gruppen ubehandlet, og ~ 75% av NSCs differensiert selektivt i neurons, som er hovedsakelig eldre, cholinergic og motor neurons.
Introduction
Rettet differensiering av NSCs i en bestemt avstamning for vev transport regnes som en av de mest lovende behandling for nevrodegenerative og neurotraumatic sykdommer1. For eksempel er catecholaminergic dopaminergic neurons spesielt ønsket Parkinsons sykdom (PD) behandling. Men har tradisjonelle metoder for å forberede ønsket cellene transport mange ulemper, som kjemiske giftighet, skjemmende arr eller andre, som i stor grad hindrer programmene i NSCs i regenerativ medisin2. Derfor er det svært nødvendig å finne en ny og sikker måte for NSC differensiering.
Plasma er den fjerde delstaten saker, følgende solid, væske og gass, og det utgjør mer enn 95% av saker i hele universet. Plasma er elektrisk nøytral med ubundet positive/negative og nøytrale partikler og genereres vanligvis av en høyspent utslipp i laboratoriet. I de siste to tiårene, har anvendelse av plasma i biomedisin fått stor oppmerksomhet over hele verden som utvikling av kaldt lufttrykk plasma-teknologi. Takket være denne teknikken, stabil lav temperatur plasma kan genereres i de omkringliggende luften på atmosfære uten bue dannelse og består av ulike reaktive arter, som reaktivt nitrogen arter (RNS), reaktive oksygen arter (ROS), ultrafiolett (UV) stråling, elektroner, ioner og elektriske feltet3. CAPs har unike fordeler for mikro-organisme inaktivering, kreft terapi, sårheling, behandling av hudsykdommer, celle spredning og celle differensiering4,5,6,7. I tidligere arbeid viste vi at kaldt atmosfæriske plasma jet kan styrke differensiering av NSCs i både murine nevrale stamceller C17.2 (C17.2-NSCs) og primære rotte nevrale stamceller, viser et stort potensial til å bli et kraftig verktøy til regissert differensiering av NSCs8. Selv om mekanismen av CAP forbedring av NSC differensiering ikke er fullt ut forstått ennå, ingen generert av CAPs har vist seg for å være en nøkkelfaktor i prosessen. I dette arbeidet, som mål å tilby detaljert eksperimentelle protokollen bruker en atmosfærisk trykk helium/oksygen plasma jet for behandling av NSCs i vitro, celle forberedelse og forbehandling, morfologi observasjon av invertert mikroskop, og fluorescens mikroskopi observasjon av immunofluorescence flekker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. celle kulturer og Predifferentiation
-
Nevrale stamceller kultur og predifferentiation
- Forberede poly-D-lysin-belagt coverslips. Sette et sterilt dekkglassvæske (20 mm i diameter) i en 12-vel plate. Strøk dekket glasset med poly-D-lysin, 0,1% w/v, i vann (Tabell for materiale) for bedre celle vedheft på coverslips ved å følge de neste trinnene.
Merk: Optimale forhold må bestemmes for hver celle linje og program.- Tas aseptisk coat overflaten av dekkglassvæske med poly-D-lysin, 0,1% w/v, i vann. Rock forsiktig å sikre en aften belegging av dekkglassvæske overflaten.
- Etter dyrking overnatting (~ 12 h) på 37 ° C, fjerne poly-D-lysine løsningen og skyll overflaten 3 x med 1 mL steril vann.
- Tørr celler minst 30 min før såing dem.
- Forberede poly-D-lysin-belagt coverslips. Sette et sterilt dekkglassvæske (20 mm i diameter) i en 12-vel plate. Strøk dekket glasset med poly-D-lysin, 0,1% w/v, i vann (Tabell for materiale) for bedre celle vedheft på coverslips ved å følge de neste trinnene.
-
Murine nevrale stamceller C17.2 (C17.2-NSC) kultur og predifferentiation
- Inkuber C17.2-NSCs i en 25 cm2 kolbe i Dulbeccos endret Eagle's medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS), 5% hest serum (HS) og 1% penicillin/streptomycin på 37 ° C og 5% CO2 for ~ 2-3 d.
- Når cellene nå 85% samløpet, fjerne mediet, vaske cellene med 1 mL av PBS og legger 1 mL av fersk trypsin (0,25%) i flasken. La den stå i 1 min; deretter legge til 1 mL av kultur medium kolbe og pipette opp og ned flere ganger for å sikre en enkeltcelle suspensjon.
- Telle tettheten av cellene i suspensjon ved hjelp av en hemocytometer. Beregne et bestemt volum av cellen suspensjon å gi en siste celle konsentrasjon av 2 x 104 celler/mL.
- Ætt av C17.2-NSCs på belagt coverslips i 12-vel plate med tettheten av ~ 2 x 104 celler per brønn. Merk cellen tetthet under et mikroskop.
Merk: For en bedre resultere, optimal celle tetthet må bli fastsatt før immunofluorescence eksperimentet. - Inkuber cellene på 37 ° C i en celle inkubator 12 h å tillate vedlegg.
- Vedlegg, vaskes cellene 2 x med 1 mL av PBS og dyrke cellene med differensiering mellom bestående av DMEM/F12 med 1% N2 supplement for 48 timer før plasma behandling.
-
Primære rotte nevrale stamceller kultur og predifferentiation
- Kultur primære rotte NSC suspensjon i rotte NSC vekstmediet i ubestrøket T25 flasker på en tetthet 5 x 105 celler.
Merk: Det primære rotten NSCs ble isolert følger protokollen av Xie et al. 9. - Sjekk dannelsen av neurospheres under en invertert mikroskop. Kontroller at morfologi av neurospheres utstillinger sfærisk og gjennomsiktig flercellet komplekser.
- Når neurospheres nå en diameter på 3 mm eller større, overføre neurosphere suspensjon 15 mL steril sentrifuge rør og la neurospheres slå av tyngdekraften.
- Fjerne nedbryting nøye for å la neurospheres i en minimal mengde medium.
- Skyll neurospheres 1 x med 5 mL PBS og la neurospheres slå av tyngdekraften. Fjerne nedbryting for å forlate en minimal mengde PBS.
- Legge til et passende antall differensiering medium for å justere celle tettheten til ~ 12-15 neurospheres per milliliter. Differensiering mediet for primære rotte NSCs består av DMEM/F12, 2% B27 og 1% FBS.
- Ætt 1 mL av neurosphere suspensjon på hver belagt dekkglassvæske i 12-vel plate.
Merk: Riste platen forsiktig for å sikre at neurospheres fordeles jevnt. Dette trinnet er viktig for en bedre immunofluorescence resultat. - Plasser platen i inkubator og la den predifferentiate for 24 timer før plasma behandling.
- Kultur primære rotte NSC suspensjon i rotte NSC vekstmediet i ubestrøket T25 flasker på en tetthet 5 x 105 celler.
2. utarbeidelse av Plasma Jets
- Velg en halv-åpen kvarts rør med en indre diameter på 2 mm og en ytre diameter på 4 mm. Sett inn en høy spenning wire med en diameter på 2 mm i røret.
- Sett inn kvarts røret med høy spenning wire 5 mL sprøyter til og bruke en til å montere den i midten av sprøyten. Angi avstanden mellom forseglet slutten av kvarts røret og sprøyte spissen på 1 cm.
- Koble et 1 m silikon gummi rør (med en diameter på 12 mm) til den åpne enden av sprøyten og deretter koble den til ventilen flowmeter og gass i rekkefølge.
3. oppkjøpet av Jets
- Koble krets som vist i figur 1. Koble ut ledningen av strømforsyningen til plasma jet enheten og deretter kobler spissen av høyspent sonde med utgang wire å oppdage spenningen. Koble den andre enden av høyspent sonden til oscilloskop informasjonen av utgangsspenning. Sjekk hele kretsen og kontroller strømforsyningen, oscilloskop og høyspent sonden er alle jordet.
- Sjekk gassledningen. Gassen røret har blitt koblet til plasma jet enheten. deretter åpner gassventilen helium (volum brøk, 99,999%) og oksygen (volum brøk, 99,999%) og satt gasstrømmen til 1 L:0.01 L/min (han: O2).
Merk: La gasstrømmen i flere minutter før du slår på strømforsyningen for første gang. - Angi puls amplitude, frekvens og pulsbredde som 8 kV, 8 kHz og 1600 ns, henholdsvis. Kontroller banen igjen, og deretter slå på output opprette en plasma jet.
FORSIKTIG: Berør ikke høy spenning wire når som helst.
4. plasma behandling nevrale stamceller
- Angi avstanden mellom munnstykket av sprøyten og celle godt hullet til 15 mm.
Merk: Avstanden er målt fra bunnen av plattformen der den 12-vel platen er plassert. - Ta 12-vel plate ut av inkubatoren og endre medium for de predifferentiated cellene til 800 µL av fersk differensiering medium.
- Dele cellene i tre grupper: en ubehandlet kontrollgruppen, en 60 s han-og-O2 (1%) gass flyt behandlingsgruppe og en 60 s plasma behandlingsgruppe.
Merk: Det er ikke opplagt flytende tap under forutsetning av behandling. - Plasser 12-vel platen under plasma jets, kontroller sprøyte munnstykket er fast i midten av hvert hull, og gi relevant behandling til de ulike gruppene som nevnt i trinn 4.3.
Merk: Ubehandlet kontrollene ble holdt i differensiering medium ved romtemperatur under eksperimentelle prosedyren slik ensartet behandling forhold. Han-og-O2 (1%) gass flyt behandling gruppen ble behandlet med bare en han og O2 (1%) gasstrømmen, uten plasma generasjon. Alle behandlinger skal utføres i tre eksemplarer.
5. nevrale stamcelleforskningen differensiering
- Etter behandling, fjerne det opprinnelige kulturen og legger 1 mL av nye differensiering medium i hver brønn.
- Inkuber cellene i kuvøse på 37 ° C og 5% CO2 til 6 d. endre mediet annenhver dag.
- Sjekk statusen differensiering for de ulike gruppene daglig under en invertert kontrast lys mikroskop. Tilfeldig velge minst 12 felt og ta bilder å registrere morfologiske endringene.
6. immunofluorescence flekker
-
Skylling
- Ta prøver av cellen inkubator og fjerne mediet av aspirasjon. Skyll cellene 1 x med 1 mL av PBS.
Merk: Etter differensiering, cellene er lett løsrevet. Det er nødvendig å legge PBS fra siden av kultur å unngå vaske av cellene.
- Ta prøver av cellen inkubator og fjerne mediet av aspirasjon. Skyll cellene 1 x med 1 mL av PBS.
-
Fiksering
- Fastsette cellene med 500 µL av 4% paraformaldehyde etter 20 min ved romtemperatur. Etter fiksering, forsiktig rense cellene 3 x med 1 mL av PBS, 5 minutter hver, fjerne de resterende 4% paraformaldehyde.
Merk: Det optimale tidspunktet for cellen fiksering må fastsettes etter celletyper. Etter fiksering, Legg 1 mL av PBS fra siden av kultur og la prøven på bordet for 5 min. Ikke bruk en lab shaker, for å sikre et minimalt tap av celler.
- Fastsette cellene med 500 µL av 4% paraformaldehyde etter 20 min ved romtemperatur. Etter fiksering, forsiktig rense cellene 3 x med 1 mL av PBS, 5 minutter hver, fjerne de resterende 4% paraformaldehyde.
-
Permeabilization
- Permeabilize prøvene med 0,2% TritonX-100 i PBS i 10 min ved romtemperatur. Etter permeabilization, skyll cellene forsiktig med 1 mL PBS til tre ganger, 5 minutter hver.
Merk: Det optimale tidspunktet for celle permeabilization må avgjøres ifølge celletyper. Etter permeabilization, Legg 1 mL PBS fra siden av kultur, La prøven på bordet for 5 min. Ikke bruk en lab shaker for å sikre minimalt tap av celler.
- Permeabilize prøvene med 0,2% TritonX-100 i PBS i 10 min ved romtemperatur. Etter permeabilization, skyll cellene forsiktig med 1 mL PBS til tre ganger, 5 minutter hver.
-
Blokkerer
- Legge til 1 mL av 10% geit serum i PBS hver prøve og la prøven på bordet for 1t blokkere eventuelle samhandlinger som er uspesifikke.
Merk: Ikke bruk en lab shaker, hindre at cellene frakobling fra lysbildet. En skylling er ikke nødvendig i dette trinnet.
- Legge til 1 mL av 10% geit serum i PBS hver prøve og la prøven på bordet for 1t blokkere eventuelle samhandlinger som er uspesifikke.
-
Inkubasjon med primære antistoff
- Fortynne det primære antistoffet bruke primære antistoff fortynning buffer.
Merk: For optimale resultater, siste fortynning forholdet mellom primære antistoffer må avgjøres av foregi. Fortynning prosenter av anti-Nestin (for udifferensierte stamceller), anti-β-Tubulin III (for Nevron), anti-O4 (for oligodendrocyte), anti-NF200 (for modne nevroner), anti-ChAT (for cholinergic nevroner), anti-LHX3 (for motor neurons), anti-GABA (for GABAergic neurons), anti-serotonin (for serotonergic nevroner) og anti-te (for dopaminergic nevroner) er 1:80, 1:200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1:200, 1: 100, 1:200 og 1: 100, henholdsvis. - 300 µL av utvannet primære antistoffer gjelde forskjellige prøver.
- Inkuber celle prøvene overnatting på 4 ° C.
Merk: Det anbefales å ruge primære antistoffer i 4 ° C å redusere bakgrunnen og spesifikk farging. - Fjern primær antistoffer og forsiktig rense cellene 3 x med 1 mL av PBS.
- Fortynne det primære antistoffet bruke primære antistoff fortynning buffer.
-
Inkubasjon med sekundær antistoff
- Fortynn Cy3-konjugerte eller Alexa Fluor 488-konjugerte sekundære antistoffer med 3% geit serum i PBS.
Merk: For optimale resultater, siste fortynning forholdet mellom sekundær antistoffer må avgjøres av foregi. - Bruke 300 µL av relevante sekundære antistoffer til å oppdage hver primære antistoff.
Merk: Alle etterfølgende trinnene må utføres i mørket hindre fluorescens slukker. - Inkuber celle prøven i mørket 2 timer ved romtemperatur.
- Fjern sekundær antistoffer og skyll cellene forsiktig med 1 mL av PBS i 10 min ved romtemperatur.
- Fortynn Cy3-konjugerte eller Alexa Fluor 488-konjugerte sekundære antistoffer med 3% geit serum i PBS.
-
Kjernefysisk flekker
- Bruke 500 µL av Hoechst 33258 fungerende løsning å fordype celle prøven.
- Inkuber celle prøven i mørket 8 min ved romtemperatur å merke kjerner.
- Forsiktig rense cellene 3 x med 1 mL av PBS, 10 min hver, beskyttet mot lyset.
Merk: For et minimalt tap av celler, optimal vask betingelsen må bestemmes empirisk.
-
Montering
- Plass en dråpe montering medium i midten av microslide.
- Ta av coverslips (med eksempler) ved hjelp av pinsett og plasser prøven på montering medium. Unngå luftbobler.
- Fjern eventuelle overskytende montering medium med tørkepapir.
-
Fluorescens mikroskopi observasjon
- Se eksemplene under fluorescens mikroskopi utstyrt med filtre for Hoechst 33258, Alexa Fluor 488 og Cy3. For hver prøve, tilfeldig velge minst 8-12 felt og ta bilder med et kamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celle morfologi ble observert under invertert mikroskopet hver dag etter CAP behandling. Figur 2 viser vanlige invertert kontrast lys mikroskop bilder av celledifferensiering i begge linjer. Gruppen plasma-behandlet utstillinger en akselerert differensiering hastighet og en høy differensiering sammenlignet med gruppen kontroll og gass flyt.
Immunofluorescent resultatene av C17.2-NSCs og primære rotte NSCs kultivert for 6 d etter behandling er vist i Figur 3 og Figur 4, henholdsvis. Nestin (+, grønn) redusert, β-Tubulin III (+ rød) betydelig økt, og O4 (+, grønn) litt økt i begge cellelinjer sammenlignet med kontrollgruppen. CAP behandlinger 60 s effektivt forbedret C17.2-NSCs til nevronale avstamning sammenlignet med kontrollgruppen og gass flyt behandling gruppen. Ren gasstrømmen hadde ingen synlig effekt på NSC differensiering.
Figur 5 viser neuronal skjebne spesifikasjonen i 60 s plasma behandling gruppen. Sterk uttrykk for NF200 (for eldre Nevron), ChAT (for cholinergic Nevron) og LHX3 (for motor neuron) ble observert. GABAergic og serotonergic neurons var sjelden sett, mens ikke dopaminergic neurons ble oppdaget.
Figur 1 : Skjematisk av den eksperimentelle set-up. Plasma jet enheten er koblet til utgang wire av høyspent strømforsyning. Høy spenning sonde med oscilloskop brukes til å oppdage utgangsspenning. Når arbeider gassene strømmer gjennom sprøyten og høy spenning på, plasma jet genereres og overføres i friluft. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Vanlige invertert kontrast lys mikroskop bilder for C17.2-NSCs og primære rotten NSCs. Dette tallet er tilpasset fra Xiong et al. 8 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Immunofluorescence påvisning av ubehandlet C17.2-NSCs (venstre), 60 s gass flyt-behandlet C17.2-NSCs (midten) og 60 s plasma-behandlet C17.2-NCSs (høyre) for 6 d kultur. Nestin (+ grønn) / Hoechst; Β-Tubulin III (+, rød) / Hoechst; O4 (+, grønn) / Hoechst. Kjernefysiske er farget med Hoechst 33258. Dette tallet er tilpasset fra Xiong et al. 8 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Immunofluorescence påvisning av ubehandlet primære rotte NSCs (venstre), 60 s gass flyt-behandlet primære rotte NSCs (midten) og 60 s plasma-behandlet primære rotten NSCs (til høyre) for 6 d kultur. Nestin (+ grønn) / Hoechst; Β-Tubulin III (+, rød) / Hoechst; O4 (+, grønn) / Hoechst. Kjernefysiske er farget med Hoechst 33258. Dette tallet er tilpasset fra Xiong et al. 8 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Neuronal skjebne spesifikasjon studerte ved immunofluorescence i 60 s plasma behandling gruppen. NF200 (+, rød) / Hoechst; ChAT (+ rød) / Hoechst; LHX3 (+, rød) / Hoechst; GABA (+ rød) / Hoechst; Serotonin (+ rød) / Hoechst; TH (+ rød) / Hoechst. Kjernefysiske er farget med Hoechst 33258. Dette tallet er tilpasset fra Xiong et al. 8 med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C17.2-NSCs er en type av udødeliggjort nevrale stamceller linje fra neonatal musen lillehjernen granulat laget celler, utviklet av Snyder og andre10,11. C17.2-NSCs kan skille i nerveceller, astrocyttene og oligodendrocytes og er mye brukt i nevrovitenskap12. I vår forrige undersøkelse, kan CAPs styrke differensiering av C17.2-NSCs i neurons. En bevis-av-prinsippet studie ble også gjennomført med primære rotte NSCs, og effekten av plasma eksponering på primære rotta NSCs var kvalitativt lik som C17.2-NSCs, med en sterkere differensiering av neurons. CAPs, en roman mekanisk-teknologi, kan representere en lovende verktøy for nevrologisk sykdom terapi, som Alzheimers sykdom, PD, ryggmargsskade og andre.
CAP behandling tilbyr en ettrinns måte å forbedre både C17.2 NSC og primære rotte NSC differensiering i vitro med en kort behandling tid og lite celleskader. Videre viste resultatene ~ 75% rettet differensiering inn neurons, som gjorde plasma behandling en lovende metode for fremtidige vev transplantasjoner i klinikken. Gjeldende protokollen rekruttert imidlertid bare én type CAP enheter for NSC differensiering. Begrensning av bruk av denne microplasma er nonuniformity når plasma plume behandler 12-vel platen. Fremtidig vil vurdere å bruke en stort volum plasma eller plasma-aktivert medium for ensartet behandling.
Det er flere viktige skritt i protokollen. Første må steg vask utføres nøye, for cellene er lett løsrevet etter differensiering. Prosedyrene for fiksering og permeabilization er andre viktige skritt i immunostaining. Fiksering er nødvendig å bevare morfologi og antigenicity celler13. Permeabilization lar antistoffer til å binde til intracellulær og kjernefysiske antigener14. Det optimale tidspunktet punkt for fiksering og permeabilization må avgjøres gjennom foregi. Immunofluorescence blokkerer og antistoff inkubasjon er viktig som mild vask trinn. Det anbefales å bruke dyr serum fra samme kilde som sekundær antistoffer for å dekke endogene uspesifikke bindende proteiner. For optimale resultater, må siste fortynning forholdet mellom antistoffer avgjøres av foregi. Som for plasma behandlingen, må plasma dosen brukes svært nøye. lang tid og intense plasma behandling vil indusere celle apoptose eller nekrose. Derfor må behandling tid og avstand være stresstestet.
I sammendraget, dette manuskriptet gir en trinnvis protokoll for inducing NSC differensiering ved hjelp av en atmosfæriske plasma jet og uthever kritiske problemer under hele prosessen. CAPs kan styrke differensiering av NSCs i nerveceller og vil åpenbart være gunstig for behandling av nevrologiske sykdommer. Det er også verdt å merke seg at gjeldende protokollen bare fokuserer på i vitro effekten av CAPs på NSCs. Det er nødvendig for fremtidige studier for å vurdere effekten av plasma i vivo med musen modeller av nerve skade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Huazhong Scholar programmet, uavhengige Innovation fondet Huazhong University av vitenskap og teknologi (nr. 2018KFYYXJJ071) og den National Natural Science Foundation i Kina (nr. 31501099 og 51707012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip | NEST | 801008 | |
| Poly-D-lysine | Beyotime | P0128 | |
| DMEM medium | HyClone | SH30022.01B | stored at 4 °C |
| DMEM/F12 medium | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| B27 supplement | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C and protect from light |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Donor Horse serum | HyClone | SH30074.03 | tored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Penicillin/Streptomycin | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| Trypsin | HyClone | 25300054 | stored at 4 °C |
| PBS solution | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| TritonX-100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Goat Serum Blocking Solution | Vector Laboratories | S-1000-20 | stored at 4 °C |
| anti-Nestin | Beyotime | AF2215 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-β-Tubulin III | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-O4 | R&D Systems | MAB1326 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| anti-NF200 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-ChAT | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti- LHX3 | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-GABA | Sigma | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-Serotonin | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| anti-TH | Abcam, Cambridge, MA | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing | |
| Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| Cy3 Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| Alexa Fluor 488- Labeled Goat | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| Anti-Mouse IgG | |||
| 12-well plate | corning | 3512 | |
| 25 cm2 flask | corning | 430639 | |
| Hoechst 33258 | Beyotime | C1018 | stored at -20 °C and protect from light |
| Mounting medium | Beyotime | P0128 | stored at -20 °C and protect from light |
| Light microscope | Nanjing Jiangnan Novel Optics Company | XD-202 | |
| Fluorescence microscopy | Nikon | 80i | |
| High – voltage Power Amplifier | Directed Energy | PVX-4110 | |
| DC power supply | Spellman | SL1200 | |
| Function Generator | Aligent | 33521A | |
| Oscilloscope | Tektronix | DPO3034 | |
| High voltage probe | Tektronix | P6015A |
References
- Temple, S. The development of neural stem cells. Nature. 414 (6859), 112-117 (2001).
- Rossi, F., Cattaneo, E. Neural stem cell therapy for neurological diseases: dreams and reality. Nature Reviews Neuroscience. 3 (5), 401-409 (2002).
- Graves, D. B. The emerging role of reactive oxygen and nitrogen species in redox biology and some implications for plasma applications to medicine and biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 45 (26), 263001 (2012).
- Weltmann, K. D., von Woedtke, T. Plasma medicine-current state of research and medical application. Plasma Physics and Controlled Fusion. 59 (1), 014031 (2017).
- Lloyd, G., et al. Gas Plasma: Medical Uses and Developments in Wound Care. Plasma Processes and Polymers. 7 (3-4), 194-211 (2010).
- Yousfi, M., Merbahi, N., Pathak, A., Eichwald, O. Low-temperature plasmas at atmospheric pressure: toward new pharmaceutical treatments in medicine. Fundamental & Clinical Pharmacology. 28 (2), 123-135 (2014).
- Xiong, Z., Roe, J., Grammer, T. C., Graves, D. B. Plasma Treatment of Onychomycosis. Plasma Processes and Polymers. 13 (6), 588-597 (2016).
- Xiong, Z., et al. Selective neuronal differentiation of neural stem cells induced by nanosecond microplasma agitation. Stem Cell Research. 12 (2), 387-399 (2014).
- Xie, Z., Zheng, Q., Guo, X., Yi, C., Wu, Y. Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats. Journal of Huazhong University of Science and Technology. [Med Sci]. 23 (2), 75-78 (2003).
- Ryder, E. F., Snyder, E. Y., Cepko, C. L. Establishment and characterization of multipotent neural cell lines using retrovirus vector-mediated oncogene transfer. Journal of Neurobiology. 21 (2), 356-375 (1990).
- Snyder, E. Y., Taylor, R. M., Wolfe, J. H. Neural progenitor cell engraftment corrects lysosomal storage throughout the MRS VII mouse brain. Nature. 374 (6520), 367-370 (1995).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (21), 11663-11668 (1997).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell Fixatives for Immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of Cell Membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
