Summary
هنا يمكننا وصف أسلوب تقييم التعبير الرئة من ميرناس التي من المتوقع لتنظيم الجينات التحريضية استخدام الفئران المعرضة للأوزون أو تصفية الهواء في مراحل مختلفة من دورة الشبقية.
Abstract
التنميط ميكرورنا (ميرنا) أصبحت ذات الأهمية للباحثين العاملين في مختلف مجالات البحوث في علم الأحياء والطب. وتبين الدراسات الحالية واعدة مستقبلا من استخدام ميرناس في التشخيص ورعاية أمراض الرئة. هنا، علينا أن نحدد بروتوكول لميرنا التنميط لقياس الوفرة النسبية لمجموعة من ميرناس وتوقع لتنظيم الجينات التهاب في أنسجة الرئة من طراز الماوس التهاب مجرى الهواء الناجم عن الأوزون. لأنه قد ثبت أن تعميم مستويات هرمون الجنس يمكن أن تؤثر على تنظيم الحصانة الفطرية الرئة لدى الإناث، والغرض من هذا الأسلوب وصف ميرنا تحريضية التنميط البروتوكول في الفئران الإناث، آخذا في الاعتبار دورة الشبقية مرحلة كل حيوان في وقت التعرض للأوزون. ونحن أيضا معالجة النهج المعلوماتية المطبقة على ميرنا الاكتشاف والهدف التعرف على أساليب استخدام ليما، برنامج البحث والتطوير/بيوكوندوكتور، والمقترنة ببرامج التحليل الوظيفي لفهم السياق البيولوجي ومسارات التعبير ميرنا التفاضلية.
Introduction
ميكرورناس (ميرناس) هي قصيرة (19 إلى 25 النيوكليوتيدات)، تحدث بشكل طبيعي، غير الترميز جزيئات الحمض النووي الريبي. تسلسل ميرناس تطورية حفظت عبر الأنواع، مما يشير إلى أهمية ميرناس في تنظيم الوظائف الفسيولوجية1. ميكرورنا التعبير التنميط وقد ثبت أن تكون مفيدة لتحديد ميرناس التي تعتبر مهمة في تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات، بما في ذلك الاستجابة المناعية، وتمايز الخلية، والعمليات الإنمائية، والمبرمج2. في الآونة الأخيرة، قد تم الاعتراف ميرناس لاحتمال استخدامها في تشخيص الأمراض والمداواة. للباحثين الذين يدرسون آليات لتنظيم الجينات وقياس التعبير ميرنا يمكن أن ينير نماذج النظم مستوى العمليات التنظيمية، لا سيما عندما يتم دمج المعلومات ميرنا مع التنميط مرناً وغيرها بيانات الجينوم-مقياس3. من ناحية أخرى، أظهرت أيضا أن تكون أكثر استقرارا من مرناس في مجموعة من أنواع العينات ميرناس وهي أيضا قابلة للقياس بقدر أكبر من الحساسية من بروتينات4. وادي ذلك إلى اهتمام كبير بتطوير ميرناس كالمؤشرات الحيوية للتطبيقات التشخيصية الجزيئية المختلفة، بما في ذلك أمراض الرئة.
في الرئة، ميرناس دوراً هاما في عملية التنمية والحفاظ على التوازن. وعلاوة على ذلك، قد تم التعبير عنها غير طبيعي المرتبطة بالتنمية والتقدم لمختلف الأمراض الرئوية5. مرض التهاب الرئة الناجمة عن تلوث الهواء قد أثبتت خطورة أكبر والتشخيص الأكثر فقراً في الإناث، مما يشير إلى أن تنظم الهرمونات والدورة الشبقية الرئة الفطرية التعبير الحصانة وميرنا في الاستجابة للتحديات البيئية 6-في هذا البروتوكول، نستخدم التعرض للأوزون، وهو عنصر رئيسي لتلوث الهواء، للحث على شكل من أشكال التهاب الرئة في الفئران الإناث التي تحدث في غياب مناعة التكيفية. باستخدام الأوزون، هي أننا حفز تنمية هايبرريسبونسيفينيس مجرى الهواء الذي يقترن بتلف الخلايا الظهارية مجرى الهواء وزيادة العَدلات ووسطاء التهابات في الخطوط الجوية الدانية7. حاليا، لا توجد بروتوكولات وصف جيد لوصف وتحليل ميرناس عبر دورة الشبقية في الفئران المعرضة للأوزون.
أدناه، ونحن تصف طريقة بسيطة لتحديد مراحل دورة الشبقية والتعبير ميرنا في أنسجة الرئة للفئران الإناث المعرضة للأوزون. علينا أيضا أن تعالج النهج الفعالة المعلوماتية الحيوية لتحديد الهدف واكتشاف ميرنا، مع تركيز على علم الأحياء الحسابي. نحن نحلل البيانات ميكرواري باستخدام ليما، برنامج R/بيوكوندوكتور التي توفر حلاً متكاملا لتحليل البيانات المستمدة من تجارب التعبير الجيني8. تحليل PCR صفيف بيانات من ليما له ميزة من حيث القدرة على اختبار t على أساس الإجراءات عند استخدام عدد صغير من الصفائف/عينات لمقارنة التعبير. لفهم سياق ميرنا التعبير النتائج البيولوجية، ثم استخدام برمجيات التحليل الوظيفي. من أجل فهم الآليات التي تنظم التغييرات النسخي والتنبؤ بالنتائج المحتملة، يجمع البرنامج ميرنا-التعبير مجموعات البيانات والمعارف من الأدب9. هذه هي ميزة مقارنة مع البرامج التي تبحث فقط عن تخصيب الإحصائية في تداخل لمجموعات من ميرناس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ولاية بنسلفانيا.
1-تقييم مرحلة دورة الشبقية
- كبح جماح أنثى الفأر C57BL/6 (8-9 أسابيع من العمر) باستخدام الماوس بيد واحدة ضبط النفس الأسلوب الموصوفة في ماكهولز et al.10بشكل صحيح.
- ملء الماصة البلاستيكية العقيمة مع 10 ميكروليتر من المياه النقية فائقة.
- إدخال تلميح الماصة البلاستيكية في المهبل.
- تدفق السائل برفق في 4 – 5 مرات لجمع العينة.
- ضع دافق النهائية التي تحتوي على السوائل المهبلية على شريحة زجاج.
- مراقبة تدفق المهبلية أونستينيد تحت مجهر خفيفة ذات هدف 20 x.
ملاحظة: الحيوانات التي لا تظهر دورات منتظمة بسبب بسيودوبريجنانسي أو أسباب أخرى تحتاج إلى أن تستبعد من التجربة. من المستحسن القيام بالافرازات المهبلية اليومية على الأقل ثلاث دورات متتالية للتأكد من سيكليسيتي.
2-التعرض للأوزون
- مكان كحد أقصى 4 الفئران في حاويتين زجاج 1.2 لتر مع الأغطية شبكة الأسلاك، والمياه ad متواصلة.
- وضع حاوية زجاجية واحدة في دائرة الأوزون والآخر في قاعة التعرض الجوية التي تمت تصفيتها.
- ضبط تركيز الأوزون إلى مستويات الأوزون 2 جزء في المليون ورصدها بانتظام.
ملاحظة: جهاز الأوزون، يسلم تدفق الهواء تنظيم (> 30 الهواء التغييرات/h) مع التحكم في درجة الحرارة (25 درجة مئوية) ورطوبة نسبية (50%). يقوم النظام بإنشاء الأوزون أوزونيزير تفريغ كهربائي، وهو رصد ويسيطر محلل الأوزون الأشعة فوق البنفسجية ووحدات التحكم بالتدفق الجماعي، كما هو موضح سابقا11. - إزالة حاويات الزجاج بعد ح 3 من التعرض للأوزون/تصفية الهواء. إرجاع الحيوانات قفص مع الأسرة والغذاء والمياه ad متواصلة.
3-المجموعة الرئة
- ح 4 بعد التعرض، تخدير الحيوانات مع حقن داخل الكيتامين/xylazine كوكتيل (90 ملغ/كغ الكيتامين، xylazine 10 مغ/كغ).
ملاحظة: للتأكد من مستوى مناسب من التخدير، تحقق الماوس دواسة منعكس (قرصه إصبع ثابتة) وضبط المخدر حسب الحاجة. - يضعف الجلد الماوس مع الإيثانول 70%.
- جعل شق خط الوسط 2 سم استخدام مقص التشغيل والملقط الجراحي لفضح الأجوف فينا.
- التضحية الفئران التي ترانسيكشن الوريد الأجوف والشريان الاورطي. إذا لزم الأمر، أدخل إبرة قياس ز 21 في الأجوف فينا أعلاه الأوردة الكلوية لجمع الدم قبل اكسسانجوينيشن. وبدلاً من ذلك، جمع الدم عن طريق ثقب القلب عقب البروتوكولات القياسية.
- استخدام مقص جراحي لقص فتح تجويف البطن وإزالة العضلات الجلد/العلوي، تتحرك صعودا نحو الأضلاع.
- استخدام مقص جراحي لثقب الحجاب الحاجز.
ملاحظة: سوف تنهار الرئتين بعيداً عن الحجاب الحاجز. - قص بعيداً في القفص الصدري باستخدام مقص جراحي لكشف القلب والرئتين.
- استخدام الملقط، تتخذ من 1.5 مل خالية رناسي أنبوب ميكروسينتريفوجي وتغرق في النتروجين السائل لملء الأنبوب.
ملاحظة: استخدام نظارات واقية وقفازات واقية للتعامل مع النتروجين السائل. - إزالة الرئتين ووضعها في أنابيب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي خالية من رناسي مليئة بالنيتروجين السائل الأداة الإضافية-تجميد الأنسجة، وانتظر بضع ثوان حتى يتبخر السائل.
- إغلاق غطاء أنبوب وتخزين الأنسجة في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. إعداد الجيش الملكي النيبالي
- يطحنون الرئتين كله الطاحن أنسجة الفولاذ المقاوم للصدأ باستخدام.
ملاحظة: موزع الأنسجة يجب أن يوضع في النتروجين السائل قبل استخدامها. تنظيف موزع بعد كل استعمال مع الحل رناسي. - تقسيم الرئتين المسحوق ووضع في أنبوبين 1.5 مل (نصف الرئة في كل).
- إضافة 500 ميليلتر من ثيوسيانات جوانيدينيوم كل أنبوبة العينة ومزيج. مجانسة كل عينة باستخدام ز 18 و 21 ز ز 23 الإبر، على التوالي.
ملاحظة: يمكن أن تكون ارتفعت عينات مع 5.6 × 108 نسخ الرنا الصغيرة سبايك في التحكم (من أنواع مختلفة) قبل الشروع في الاستخراج. - إضافة 500 ميليلتر من الإيثانول لكل عينة ودوامه لمدة 15 ثانية.
- تجاهل تحميل الخليط في عمود دوران في أنبوب جمع وأجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز للحد الأدنى 1-التدفق عبر.
-
الدناز أنا العلاج (في عمود)؛
- إضافة 400 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي يغسل المخزن المؤقت والطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 1 دقيقة.
- في أنبوب رناسي خالية، إضافة 5 ميليلتر الدناز أنا وميليلتر 75 1 × هضم الحمض النووي المخزن المؤقت ومزيج. إضافة هذا المزيج مباشرة إلى مصفوفة العمود.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 400 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي بروش الحل إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي في س 12,000 ز لدقيقة 1 تجاهل التدفق عبر وكرر هذه الخطوة.
- إضافة 700 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي يغسل المخزن المؤقت إلى العمود وتجاهل أجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز للحد الأدنى 1-التدفق عبر.
- الطرد المركزي في 12,000 س ز 2 دقيقة لإزالة المتبقية في المخزن المؤقت. تحويل العمود إلى أنبوب رناسي مجاناً.
- إلى الوت الجيش الملكي النيبالي، إضافة 35 ميليلتر من الماء خالية من الدناز/رناسي مباشرة إلى مصفوفة العمود وأجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز ل 1.5 دقيقة.
- قياس مجموع تركيز الحمض النووي الريبي (260 nm) والنقاء باستخدام جهاز المطياف الضوئي. اتبع الإرشادات لإجراء التقدير الكمي الجيش الملكي النيبالي في عينة ميليلتر 1.5 الكوة. فارغة في الصك مع المياه خالية من الدناز/رناسي المستخدمة شطف.
ملاحظة: نسبة 260/280 ~2.0 المقبول عموما ك "الصرفة" للجيش الملكي النيبالي. تركيز الحمض النووي الريبي نموذجي يتراوح عادة بين 750 و 2,500 نانوغرام/ميليلتر. - مخزن في-80 درجة مئوية.
5. ميرنا التنميط
-
للرجعية-نسخ صغيرة الكشف، استخدام 200 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي.
- إعداد مزيج رد فعل عكسي-النسخ على الجليد (إجمالي حجم كل رد فعل هو 20 ميليلتر). لكل رد فعل، إضافة 4 ميليلتر من 5 x المخزن المؤقت، 2 ميليلتر من 10 x ميكس النيوكليوتيدات، 2 ميليلتر من المنتسخة العكسية، و 2 ميليلتر من المياه خالية من رناسي. مزيج جميع المكونات وقاسمه في 600 ميليلتر خالية رناسي أنابيب بلاستيكية (10 ميليلتر من مزيج كل رد فعل).
ملاحظة: مزيج الرئيسي النسخ العكسي تحتوي على كافة المكونات المطلوبة لتوليف كدنا حبلا أول ما عدا قالب الجيش الملكي النيبالي.
ملاحظة: حساب حجم الزائدة (10%) عند إعداد مزيج الرئيسي. - إضافة قالب الحمض النووي الريبي (200 نانوغرام في 10 ميليلتر) لكل أنبوبة تحتوي على مزيج الرئيسي النسخ العكسي. مزيج، أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ق في س 1,000 ز، وتخزينها على الجليد حتى وضع في ثيرموسيكلير أو كتلة جافة.
- احتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- احتضان لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية ووضع الأنابيب على الجليد.
- تمييع كدنا بإضافة 200 ميليلتر من المياه خالية من رناسي لكل رد فعل عكسي-النسخ 20 ميليلتر.
- إعداد مزيج رد فعل عكسي-النسخ على الجليد (إجمالي حجم كل رد فعل هو 20 ميليلتر). لكل رد فعل، إضافة 4 ميليلتر من 5 x المخزن المؤقت، 2 ميليلتر من 10 x ميكس النيوكليوتيدات، 2 ميليلتر من المنتسخة العكسية، و 2 ميليلتر من المياه خالية من رناسي. مزيج جميع المكونات وقاسمه في 600 ميليلتر خالية رناسي أنابيب بلاستيكية (10 ميليلتر من مزيج كل رد فعل).
-
إجراء PCR الوقت الحقيقي باستخدام الماوس الاستجابة الالتهابية والمناعة الذاتية ميرنا مصفوفة PCR.
- إعداد مزيج رد فعل (إجمالي حجم 1100 ميليلتر): لكل رد فعل، إضافة ميليلتر 550 من مزيج الرئيسي x PCR 2 ميليلتر 110 من 10 x ميكس التمهيدي العالمي، ميليلتر 340 من المياه خالية من رناسي وميليلتر 340 من قالب كدنا (رد الفعل المخفف من الخطوة 5.1.5).
- إضافة 10 ميليلتر من رد فعل مزيج لكل بئر من ميرنا محملة مسبقاً PCR صفيف باستخدام بيبيتور متعدد القنوات.
- ختم ميرنا لوحة "بكر الصفيف" مع الفيلم لاصقة الضوئية.
- الطرد المركزي لوحة لمدة 1 دقيقة في 1,000 س ز في درجة حرارة الغرفة لإزالة الفقاعات.
- برنامج cycler في الوقت الحقيقي، خطوة التنشيط الأولى بكر لمدة 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية، وتمسخ 3-الخطوة تحتوي على ركوب الدراجات لمدة 15 ق في 94 درجة مئوية، والصلب لمدة 30 s 55 درجة مئوية، والتمديد لمدة 30 s عند 70 درجة مئوية 40 دورات عدد.
ملاحظة: تتبع الشركة المصنعة لركوب الدراجات شروط تعليمات لإعداد cycler في الوقت الحقيقي. نفذ الخطوة منحنى تفارق في صلب البرنامج cycler في الوقت الحقيقي. - القيام بتحليل البيانات.
6-بيانات التحليل
- استخراج القيم Ct من البرمجيات PCR الوقت الحقيقي لكل عينة في برنامج تحليل.
ملاحظة: ويعتبر التصوير المقطعي بقيمة 34 كقطع. إذا كانت العينات تحتوي على المصطلحات الخاصة في عنصر تحكم (مثل، الجوف-مير-39)، تطبيع القيم المقطعية لارتفاع عنصر التحكم لكل عينة. قيم العتبة قد تحتاج إلى تعيين يدوياً. يتم تلقائياً تعيين قيم الأساس. - تطبيع القيم الأشعة المقطعية Ct متوسط ستة عناصر التحكم في التدبير المنزلي ميرنا: SNORD61، SNORD68، SNORD72، SNORD95، SNORD96A، RNU6-2، باستخدام المعادلة التالية:
ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping) - لإضعاف تغيير العمليات الحسابية، وحساب قيم ΔΔCt باستخدام عينة محددة كعنصر تحكم، باستخدام معادلة التعبير النسبي12:
ميرنا التعبير النسبي:
2-∆∆Ct، أين-∆∆Ct =-[اختبار ∆Ct-∆Ct مراقبة]
ملاحظة: ويعتبر تغيير حظيرة 200 كقطع. - إضعاف الصادرات تغيير قيم التعبير لإجراء التحليل الإحصائي في البحث والتطوير باستخدام حزمة ليما في بيوكوندوكتور8.
- تصحيح لمقارنات متعددة باستخدام أسلوب بينجاميني-هوشبيرغ13.
ملاحظة: تتوفر نسخة من البرنامج النصي للبحث والتطوير في: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. مجموعات البيانات، وتحليل البيانات متاحة أيضا في "الجامع التعبير الجيني" تحت رقم GSE111667، https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.
7-بيانات التحليل: التحليل الوظيفي البرمجيات
- ترتيب dataset. وتشمل ميرناس مع تعبير كل منهما سجل النسب والقيم ف. انظر الجدول 1 لتنسيق البيانات المحددة.
- برمجيات التحليل وظيفية مفتوحة (الإصدار 01-10).
- تحميل البيانات استخدام التنسيق التالي: تنسيق الملف: تنسيق "مرنة"، ويحتوي على رأس العمود: "نعم"، حدد نوع المعرف: "ميرباسي (ناضجة)"، منصة صفيف المستخدمة لإجراء التجارب: اختيار منصة الصفيف.
ملاحظة: قبلت بتنسيقات ملفات.txt (علامة التبويب فواصل ملفات نصية)،.xls (ملفات أكسل)، و.diff (ملفات كوفديف). - حدد "استنتاج الملاحظات" وتحقق من صحة العلامات المجموعة التجريبية.
- انتقل إلى "ملخص Dataset" إعادة النظر في مبلغ إجمالي قدرة ميرناس المعينة وغير المعينة.
-
انقر على الزر "جديد" في الجزء العلوي الأيسر من البرنامج. حدد "عامل التصفية المستهدفة MicroRNA الجديدة" وتحميل microRNA dataset.
- تعيين المصدر: ميريكوردس تارباسي، "من البراعة الخبراء النتائج التي توصلت إليها"،.
- تعيين الثقة: لوحظ تجريبيا أو عالية (توقع).
- حدد "إضافة الأعمدة" ليشمل مجموعة متنوعة من المعلومات البيولوجية حول الأهداف مثل الأنواع والأمراض والأنسجة، ومسارات والمزيد.
- التركيز على الأهداف التي تغيرت التعبير في التجربة، حدد "إضافة/استبدال dataset مرناً". استخدام "تعبير الأقران" لتحديد موقع ميكرورناس مع مستويات التعبير نفسه أو مختلفة.
ملاحظة: سوف توفر تحليل عامل التصفية ميكرورنا الأسماء والرموز، والأهداف مرناً، المصدر الذي يصف العلاقة المستهدفة، ومستوى الثقة في العلاقة المتوقعة (الشكل 2).
- انقر فوق "إضافة إلى بي الطريق" إرسال البيانات التي تمت تصفيتها إلى قماش مسار واستكشاف المزيد من العلاقات البيولوجية.
- استخدام "مصمم المسار" لإنشاء نموذج نشر الجودة من آثار ميكرورنا.
-
خيار بديل لإنشاء إجراء تحليل أساسية.
- بالنسبة لنوع التحليل الأساسي، حدد "تحليل التعبير".
- بالنسبة لنوع القياس، حدد "Expr سجل نسبة".
- ملخص تحليل عامل التصفية: النظر فقط الجزيئات و/أو العلاقات حيث: (الأنواع = الماوس) (الثقة = لوحظ تجريبيا) (مصادر بيانات = "براعة الخبراء النتائج التي توصل إليها"، "الإبداع اكسبيرتاسيست النتائج التي توصل إليها"، "ميريكوردس"، "تارباسي"، أو " تارجيتسكان الإنسان ").
- حدد قطع قيمة p = 0.05.
- قم بتشغيل التحليل.
ملاحظة: وسوف يتضمن التقرير: مسارات المتعارف عليه، تحليل المنظمين المنبع، الأمراض ووظائف، آثار منظم، شبكات، والجزيئات وأكثر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تستخدم أنواع مختلفة من الخلية لوحظ في مسحات لتحديد مرحلة دورة الشبقية الماوس (الشكل 1). يتم تعريف هذه بواسطة مورفولوجيا الخلايا. أثناء بروستروس، خلايا حصرا تقريبا مجموعات مستدير، وشكل جيد الأنوية الخلايا الظهارية (الشكل 1A). عندما يكون الماوس في مرحلة السفاد، الخلايا هي الخلايا الظهارية الحرشفية كورنيفيد، وموجودة في مجموعات سكانية معبأة (الشكل 1B). أثناء ميتيستروس، وينظر كورنيفيد الخلايا الظهارية والكريات البيض النوى (الشكل 1). في ديستروس، هي الكريات البيضاء (خلايا صغيرة) عموما أكثر انتشارا (الشكل 1).
نحن استخراج الحمض النووي الريبي من أربعة الماوس الرئتين بعد البروتوكول السابق ذكره. تركيزات الحمض النووي (نانوغرام/ميليلتر) يتراوح بين 1197.9 و 2178.1 بمتوسط قدرة ± 1583.1 215 (الجدول 1). متوسط نسبة A260/A280 تقلبت من 2.010 إلى 2.020 مع متوسط 2.016 ± 0.002. من ناحية أخرى، أن نسب A260/A230 الملاحظة تأرجحت بين 2.139 و 2.223 مع متوسط 2.179 ± 0.018.
ويبين الجدول 2 نتائج التعبير التفاضلية مع ليما على ر. قمنا بحساب أعلى ميرناس أعرب متفاوتاً بين الفئران المعرضة للأوزون أو تصفية الهواء في بروستروس (باستخدام توبتابل الأمر)14. العمود الأول يعطي قيمة التغيير إضعاف إضعاف log2 في التعبير ميرنا بين الأوزون ومصفاة الهواء تعرض الحيوانات. T عمود يمثل معتدلة إحصائية t المحسوبة لكل ميرنا في المقارنة. أعمدة p.value و adj.p.value تمثل القيم ف المقترنة لكل مقارنة قبل وبعد التعديل اختبار متعددة، على التوالي. تم التعديل لمقارنات متعددة مع بينجاميني وهوشبيرغ في طريقة للتحكم في معدل اكتشاف كاذبة15. وأعرب العمود B يمثل السجل-الاحتمالات هو ميرنا الأثران8.
أجرينا ميرنا المستهدفة الأساسية وتصفية التحليل الذي يشمل تحليل مسار الإثراء. بعد تحميل قائمة من 14 ميرناسويث نسبة تسجيل التعبير هامة وقيمة p، كل منهم تم تعيينها قبل التصفية المستهدفة ميرنا (الجدول 3). النتائج تم تصفيتها وفرزها للوصول إلى مسارات معينة، في هذه الحالة "الاستجابة المناعية الخلوية". التحليل الأساسية معلومات حول مسارات الكنسي والأمراض ووظيفة والمنظمين والشبكات (الجدول 4). تنتج برمجيات التحليل الوظيفي شبكة تحليل أن يبين العلاقة بين ميرناس الفائدة والجزيئات الأخرى (الشكل 3).
رقم 1: تحديد مراحل دورة الشبقية. (أ) بروستروس (الخلايا الظهارية الأنوية الغالب)؛ (ب) السفاد (غالباً أنوكليتيد كورنيفيد الخلايا)؛ (ج) ميتيستروس (كل ثلاثة أنواع من الخلايا)؛ وديستروس (د) 2 (الأغلبية من الكريات البيضاء). شريط المقياس = 100 ميكرومتر. التكبير = 20 x. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نتائج التحليل وظيفية البرمجيات الممثل: التصفية المستهدفة ميرنا. لمحة شاملة عن ميرناس في مراحل مختلفة من دورة الشبقية. بعد القيام بتصفية ميرنا، يسلم البرنامج قوائم مفصلة للجينات ومركبات المتورطين في الأمراض وغيرها تعمل، الذي يمكن أن يكون عامل التصفية والفرز للوصول إلى مسارات معينة، في هذه الحالة "الاستجابة المناعية الخلوية". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: نتائج التحليل وظيفية البرمجيات الممثل: شبكات- تصفية مقارنة للشبكات المتأثرة بالتعرض للهواء أو الأوزون في الإناث في مراحل مختلفة من دورة الشبقية. رسم تخطيطي لشبكات البيولوجية المرتبطة ميرناس في الرئتين من الإناث الفئران المعرضة للهواء المصفاة مقابل الأوزون في بروستروس (A) أو المراحل غير بروستروس (ب). وقد تم تعديل هذا الرقم فوينتيس et al.6. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| معرف | الحمض النووي (نانوغرام/ميليلتر) | A260/A280 | A260/A230 |
| عينة 1 | 1197.930 | 2.015 | 2.192 |
| عينة 2 | 1355.703 | 2.018 | 2.223 |
| نموذج 3 | 2178.104 | 2.020 | 2.163 |
| نموذج 4 | 1600.837 | 2.010 | 2.139 |
| في المتوسط | 1583.144 ± 215 | 2.016 ± 0.002 | 2.179 ± 0.018 |
الجدول 1: مثال لتركيزات الحمض النووي الريبي ونسب امتصاص في 260 و 230 و 280 نيوتن متر من عينات أنسجة الرئة المنقي من الفئران الأربعة. تم قياس تركيزات مع جهاز المطياف الضوئي.
| لوجفك | t | P.Value | الصفة. P.Val | ب | |
| mmu-مير-694 | 1.492 | 4.071 | 0.000153 | 0.009514 | 0.759 |
| ف mmu-مير-9-5 | 0.836 | 3.916 | 0.000254 | 0.009514 | 0.289 |
| ف mmu-مير-221-3 | 0.385 | 3.106 | 0.003014 | 0.075361 | -1.982 |
| mmu-مير-د 181-5 ف | 0.597 | 2.891 | 0.005516 | 0.103424 | -2.526 |
| ف mmu-مير-98-5 | 0.558 | 2.699 | 0.009243 | 0.138649 | -2.987 |
| ف mmu-مير-712-5 | 0.667 | 2.563 | 0.013169 | 0.164609 | -3.299 |
| mmu-مير-106a-5 ف | -0.528 | -2.412 | 0.019278 | 0.206547 | -3.632 |
الجدول 2: ليما وينتج عن تحليل ميرناس خلطات المعرب عنها في الإناث اللائي تعرضن للأوزون مقابل -تصفية الهواء في مرحلة بروستروس.
| معرف ميرناس | الملاحظة 1 | الملاحظة 1 | الملاحظة 2 | الملاحظة 2 |
| سجل Expr نسبة | قيمة P | سجل Expr نسبة | قيمة P | |
| mmu-مير-694 | 1.492 | 0.000153 | 0.543319208 | 0.0021385 |
| ف mmu-مير-9-5 | 0.836 | 0.000254 | 0.677595421 | 0.004997439 |
| ف mmu-مير-221-3 | 0.385 | 0.003014 | ||
| mmu-مير-د 181-5 ف | 0.597 | 0.005516 | 0.342276659 | 0.106467657 |
| ف mmu-مير-98-5 | 0.558 | 0.009243 | 0.455392799 | 0.034724699 |
| ف mmu-مير-712-5 | 0.667 | 0.013169 | ||
| mmu-مير-106a-5 ف | -0.528 | 0.019278 |
الجدول 3: تنسيق مثال لتحميل المراقبة المتعددة لمجموعات البيانات إلى برمجيات التحليل الوظيفي- يمكن تجميعها في جدول واحد وحملت تعبيرات التفاضلية تجريبية متعددة، ويمكن إضافة العديد من الملاحظات حسب الحاجة. الأعمدة: معرف 1) ميرناس؛ 2) الملاحظة 1: سجل Expr نسبة؛ 3) الملاحظة 1: قيمة P؛ 4) الملاحظة 2: سجل Expr نسبة؛ 5) الملاحظة 2: قيمة P.
| عدم بروستروس | بروستروس | ||||
| ألف وأعرب الجينات المستهدفة بخلطات ميرناس | |||||
| CAMK2N1 | PAFAH1B2 | SEC23A | ABCB9 | FGD4 | SLC25A27 |
| السيارات | PDE4B | SNX5 | أبوو | FRMD4B | SLC38A1 |
| CYP24A1 | PDE7A | SYT4 | ARHGEF38 | GPR137B | TMCC1 |
| DBF4 | PGM3 | THAP12 | AVEN | همبس | TRIM71 |
| HMGN2 | الحزب الوطني التقدمي | TMED7 | CASP3 | METAP1 | XKR8 |
| KMT5A | REV1 | TNFAIP2 | ككنج | ميتف | ZCCHC11 |
| LRRC17 | RPS19BP1 | TNFRSF10C | CMTR2 | حركة | ZIM3 |
| MDH2 | رراد | TP53 | كنمد | رجمب | ZNF181 |
| MIS18A | SEC62 | UBE2V2 | DSCR8 | SLC14A1 | |
| ZNF420 | |||||
| باء الاختلافات في أعلى من الأمراض وبيوفونكشنز | |||||
| الأمراض والاضطرابات | قيمة P | الأمراض والاضطرابات | قيمة P | ||
| مرض التهاب | 3.84E-02-3.84E-05 | الضرر العضوي وشذوذ | 4.96E-02-2.77E-14 | ||
| الاستجابة الالتهابية | 3.84E-02-3.84E-05 | أمراض الجهاز التناسلي | 2.15E-02-2.77E-14 | ||
| الضرر العضوي وشذوذ | 4.17E-02-4.17E-05 | سرطان | 4.96E-02-1.27E-10 | ||
| جيم وظائف كبار الجزيئية والخلوية | |||||
| وظائف الجزيئية والخلوية | ف القيمة | وظائف الجزيئية والخلوية | ف القيمة | ||
| تطوير الهاتف الخلوي | 2.05E-02-5.26E-07 | حركة خلوية | 3.77E-02-4.47E-07 | ||
| وسط الخلوية | 3.75E-04-3.75E-04 | الموت الخلوي والبقاء على قيد الحياة | 4.91E-02-5.61E-06 | ||
| دورة الخلية | 2.62E-03-2.62E-03 | تطوير الهاتف الخلوي | 4.97E-02-1.38E-06 | ||
| د أعلى تطوير النظام الفسيولوجية والدالة | |||||
| التنمية والدالة | ف القيمة | التنمية والدالة | ف القيمة | ||
| التنمية العضوي | 4.17E-02-1.31E-03 | التطور الجنيني | 3.30E-02-2.12E-05 | ||
| التطور الجنيني | 1.29E-02-1.29E-02 | تطوير النسيج الضام والدالة | 1.79E-02-6.10E-05 | ||
| تطوير النسيج الضام والدالة | 1.93E-02-1.93E-02 | مورفولوجيا الأنسجة | 7.88E-05-7.88E-05 | ||
| أعلى هاء المرتبطة مهام شبكة الاتصال | |||||
| مهام الشبكة المرتبطة | نقاط | مهام الشبكة المرتبطة | نقاط | ||
| تطوير الهاتف الخلوي، ومرض التهاب، الاستجابة الالتهابية | سرطان إصابة وشذوذ، أمراض الجهاز التناسلي، العضوي | ||||
| 6 | 19 | ||||
الجدول 4: برمجيات التحليل الوظيفي ملخص الإناث اللائي تعرضن للأوزون في غير بروستروس مقابل بروستروس المراحل. يسمح برنامج التحليل الوظيفي بتحليل مسارات الكنسي الأعلى والمنظمين المنبع، الأمراض & وظائف، وظائف أعلى، منظم تأثير الشبكات والمزيد. وقد تم تعديل هذا الجدول فوينتيس et al.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MicroRNA التنميط أسلوب مفيد لتشخيص الأمراض والأبحاث الميكانيكية. في هذه المخطوطة، حددنا بروتوكولا لتقييم التعبير عن ميرناس الذي يتوقع أن تنظم جينات التهاب في الرئتين من الإناث الفئران المعرضة للأوزون في مراحل مختلفة من دورة الشبقية. أساليب لتحديد دورة الشبقية، مثل طريقة الكشف البصري، قد وصف16. ومع ذلك، هذه تعتمد على القياسات مرة واحدة، ولذلك لا يمكن الاعتماد عليها. لتحديد بدقة جميع مراحل دورة الشبقية في الإناث أن دورة بانتظام، ينصح بالطريقة الموضحة هنا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول البسيط لتقدير غير مباشر التقلبات الهرمونية يوميا في الفئران. لتجنب تنشيط الاستجابات التحريضية غير مرغوب فيه بسبب التهاب المهبل، أخذ عينات من الاحتياجات التي يتعين القيام بها مرة واحدة فقط يوميا. بسبب التغير في طول دورة والإسكان التأثيرات، من المهم تنفيذ البروتوكول لسنتين أو ثلاث دورات كاملة قبل استخدام الحيوانات في تجربة النظر في مرحلة دورة.
لاستخراج الحمض النووي الريبي ناجحة من أنسجة الرئة، إجراء دقيقة حرجة. هذا البروتوكول وصف أسلوب يوما واحداً لعزل الحمض النووي الريبي من أنسجة الرئة التي تعطي الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة. يلزم إجراء تعديلات على البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة لكفاءة استخراج الحمض النووي الريبي من الرئتين. وأضاف نحن خطوة الطرد المركزي إضافية بعد إضافة المخزن المؤقت الغسيل لإزالة المخزن المؤقت قدر الإمكان. ونحن أيضا الوتيد الجيش الملكي النيبالي مع 35 ميليلتر من الماء خالية من الدناز/رناسي، سينتريفوجينج في عمود 1.5 دقيقة لضمان مستويات عالية من التركيز. وأكدت نتائج سبيكتروفلوروميتير فعالية لدينا بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي. نسبة امتصاص في 260 و 280 نانومتر (نسبة A260/280) كثيرا ما يستخدم لتقييم نقاء استعدادات الجيش الملكي النيبالي. امتصاص الحد الأقصى للأحماض النووية 260 و 280 نيوتن متر، على التوالي. من المقبول ك "نقية" للجيش الملكي النيبالي إذا كانت النسبة 2.0 حوالي17. وبالمثل، لأن نسبة امتصاص التلوث A260/A230، من قيم النقاء في نطاق 2.0 – 2.218. في هذه الدراسة، كان متوسط نسب A260/A280 و A260/A230 ولاحظ ± ± 0.002 و 2.179 2.016 0.018، على التوالي (الجدول 1). لذلك، لدينا بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي كانت ناجحة. وهناك ميزة أخرى للبروتوكول المستخدم هو إضافة معاملة الدناز. هذا أمر مهم لتجنب تلويث الحمض النووي19. حد لهذا البروتوكول عزل الحمض النووي الريبي هو استخدام أعمدة تنقية للتخلص من النفايات من خلال هطول الأمطار باستخدام الكحول لأن بعض الحطام الرئة قد تؤدي إلى عرقلة الغشاء أما جزئيا أو بالكامل، مما أدى إلى انخفاض حجم الغلة. أيضا، إذا لم يتم تنفيذ الخطوة التجانس بعناية، كميات كبيرة من الرئة الجيش الملكي النيبالي يمكن بسهولة فقدت أو تدهورت. إذا كان يتم الحصول على انخفاض الغلال الجيش الملكي النيبالي، ويمكن إعادة تنقية الحمض النووي الريبي والتيد في حجم أصغر. وبدلاً من ذلك، يمكن أن تكون الحمض النووي الريبي سرع بين عشية وضحاها التالية البروتوكولات المنشورة20.
ميكرواري التكنولوجيات المطبقة على التنميط ميرنا أدوات واعدة في العديد من المجالات البحثية. في دراستنا، قمنا باستخدام صفائف بكر، التي توفر ميزة أعلى من عتبة الكشف، واستراتيجيات التطبيع للكشف عن ميرناس أعرب عن خلطات مقابل غيرها من التكنولوجيات مثل صفائف المستندة إلى المسبار ميرنا21. حد من هذا البروتوكول أنه يتطلب الحد أدنى من ابتداء من مادة الحمض النووي الريبي، وتوافر مجموعات محددة من كبسولة تفجير ميرناس الاهتمام، خلافا لغيرها من التقنيات المتاحة مثل رناسيق. ميزة أخرى من صفائف المستندة إلى PCR هو خيار استخدام الجينات مرجع غير ميرنا لتطبيع qPCR (مثل الكشف النوية الصغيرة أو سنوردس) لحساب التعبير التفاضلية من ميرناس. وأخيراً، استخدام صفائف PCR يوفر العديد من الخيارات لتحليل البيانات، التي تتراوح من أدوات الإنترنت المقدمة من الشركات المصنعة، إلى الأساليب التقليدية للكشف عن التعبير التفاضلية على الرغم من "بكر في الوقت الحقيقي". التحليل الإحصائي مع ليما مريحة لكلا من [ميكروارس] وصفائف المستندة إلى بكر ويستخدم ال تجريبية بايز أدار-إحصائيات و22. هنا، نحن تظهر أنه يمكن الحصول على قيم p وقيم q (تعديل لاختبار متعددة) مع توبتابل الأمر ضبط عتبة معدل اكتشاف كاذبة وتحديد الأثران أعرب عن ميرناس.
برمجيات التحليل الوظيفي تطبيق المستندة إلى ويب لتحليل البيانات في سياق المسار. ويعطي البرنامج الباحثين قدرات بحث قوية يمكن أن تساعد على مجموعات البيانات الإطار أو أهداف محددة في سياق، في صورة أكبر من الأهمية البيولوجية. على الرغم من أن البيئة برامج مرنة لأنواع مختلفة من التحليل (أي جميع، بطانات، البروتيوميات، ميكرورنا، وعلم السموم، إلخ)، وهدفنا هنا تسليط الضوء على جوانب التحليل ميرنا. بعد تحميل قائمة من 14 ميرناس مع التعبير كبير سجل نسب وقيم p-، كل ما تم تعيينها البرنامج. ونحن أداء ميرنا المستهدفة الأساسية وتصفية التحليل، الذي يشمل تحليل مسار الإثراء. ومع ذلك، تنظر هذه التحليلات الجينات التي من المتوقع ميرناس 14 للهدف ولا ميرناس أنفسهم. يسرد المقطع نتائج المخرجات مثل: مسارات المتعارف عليه، والأمراض، ودالة، الجينات المستهدفة بخلطات أعرب ميرناس وتطوير النظام الفسيولوجية والمنظمين والشبكات (الجدول 4). يتم إظهار المرئيات المسار تحت علامة التبويب شبكة الاتصال، حيث أظهرت ميرناس والجزيئات كنقر العقد التي يتم ربطها بالمعلومات المرتبطة بالجينات للفائدة (الشكل 3). ميزة برمجيات التحليل الوظيفي هو النتائج المتصلة بميرنا عالية الجودة، بما في ذلك التفاعلات تم التحقق من صحتها تجريبيا والمتنبأ بها. وتشمل قواعد البيانات برمجيات التحليل الوظيفي: مرناً microRNA تم التحقق من صحتها تجريبيا التفاعلات بين قواعد البيانات23،24، مرناً microRNA توقع التفاعل قاعدة البيانات مع التفاعلات الثقة المنخفضة (على سبيل المثال، تستبعد مسح الهدف)25والإنسان تم التحقق من صحتها تجريبيا والفئران، والماوس microRNA مرناً التفاعلات بين قواعد البيانات (مثلاً، ميريكوردس)26والأدب النتائج (مثل، ميكرورنا المتعلقة النتائج التي توصل إليها تنسيق يدوياً من الكتابات المنشورة حسب الخبراء العلميين). وتؤكد دراسات أخرى مقارنة فعالية وقابلية الاستخدام لأدوات المعلوماتية الحيوية لتحليل المسارات المقترنة بالتعبير ميرنا فعالية هذا البرنامج27. الأساليب الحسابية عموما، وهي فعالة من حيث التكلفة، وأقل استهلاكاً للوقت، ويمكن أن يتم التحقق من صحة بسهولة بالأساليب الجزيئية. ومع النمو المستمر وتراكم البيانات الطبية الحيوية، سوف تصبح أساليب المعلوماتية الحيوية قوية على نحو متزايد في الكشف عن آليات وساطة ميرنا للعمليات البيولوجية والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا البحث المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة K01HL133520 (PS) و K12HD055882 (PS). يشكر المؤلفون الدكتور جوانا فلورس للمساعدة مع تجارب التعرض للأوزون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7 mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10x and 20x objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10 mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21 G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1 mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50 mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μL reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
References
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
