Summary
En protokol præsenteres du kan hurtigt teste den termiske stabilitet af proteiner i en række betingelser gennem termisk Skift assays og nano differential scanning fluorimetry. Buffersystemer, salte og tilsætningsstoffer, sammen er bestående af tre enestående stabilitet skærme, analyseret med proteiner til at identificere egnede buffere for funktionelle og strukturelle studier.
Abstract
Projektets Horizon2020 Virus-X blev etableret i 2015 at udforske virosphere af udvalgte ekstrem biotoper og opdage nye virale proteiner. For at vurdere den potentielle biotekniske værdien af disse proteiner, analyse af protein er strukturer og funktioner en central udfordring i dette program. Stabiliteten af protein prøven er vigtigt at give meningsfulde assay resultater og øge crystallizability af målene. Termisk Skift assay (TSA), et fluorescens-baseret teknik, er etableret som en populær metode til at optimere betingelserne for protein stabilitet i høj overførselshastighed. I TSAs er de erhvervsdrivende fluorophores ydre, miljømæssigt følsomme farvestoffer. Alternativt lignende teknik er nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF), som er afhænger af protein naturlig fluorescens. Her præsenterer vi en roman osmolyte skærm, en 96-tilstand skærmen af økologisk tilsætningsstoffer designet til at guide krystallisering forsøg gennem foreløbige TSA eksperimenter. Sammen med tidligere udviklet pH og salt skærme indeholder tre skærme sæt en omfattende analyse af protein stabilitet i en bred vifte af buffersystemer og tilsætningsstoffer. Nytte af skærmene er demonstreret i TSA og nanoDSF analysen af lysozym og Protein X, et mål protein af Virus-X-projektet.
Introduction
Mange bioteknologien nyttige enzymer stammer fra viral kilder, såsom tobak etch virus (TEV) protease1 og menneskelige rhinovirus type 3 C (HRV 3 C) protease2. Horizon2020 Virus-X projekt (figur 1)3. Formålet med dette program er (a) at udvide rækkevidden af egenskaberne for kendte enzym familier og (b) at karakterisere romanen enzymer af endnu ukendt funktion (enzym X). Krystallografiske struktur vilje spiller en central rolle i målet protein karakterisering, navnlig i de tilfælde, hvor protein-sekvenser har udviklet sig ud over anerkendelse4. Protein stabilitet er en nøglefaktor i krystallisering processen; prøverne skal være for homogen og strukturelt lyd over en periode at form lang-seriøs, diffracting krystaller. Derudover er det afgørende for aktivitet assays, der proteinerne, der findes i deres aktive kropsbygning, som kan også lettes ved en gunstig molekylære miljø.
Trods udviklingen i den teknologi til rådighed for crystallographers forbliver protein krystallisering en tidskrævende og arbejdskrævende empiriske proces5. Foreløbige biofysiske eksperimenter for at forbedre protein stabilitet i opløsning give klart et bedre udgangspunkt for protein krystallisering og forbruge som regel kun en forholdsvis lille mængde protein prøve6,7, 8,9. Det store antal mål proteiner til at blive undersøgt i dette projekt nødvendiggør også skalerbare, høj overførselshastighed stabilitet assays. En af de mest populære metoder til pre krystallisering biofysiske karakterisering af proteiner, er termiske Skift assay (også kendt som TSA eller differential scanning fluorimetry, DSF)10,11.
TSAs ansætte en miljømæssigt følsomme fluorescerende farvestof til at spore den termiske denaturering af protein prøver. Mange almindeligt anvendte farvestoffer har variabel fluorescens aktivitet afhængigt af polariteten af deres miljø, ofte vise en høj fluorescens output i hydrofobe miljøer, men undergår hurtige quenching i polar miljøer12. Proteiner generelt forårsage udtalt stigninger i dye fluorescens som deres hydrofobe kerner blive udsat for under denaturering, ofte efterfulgt af en nedgang i dye fluorescens ved meget høje temperaturer som proteiner begynder at aggregat (figur 2).
Mens en hydrophobicity-følsomme farvestof er ofte et godt valg for et almindeligt brug TSA farvestof, kan det være uegnet for proteiner med store, opløsningsmiddel-eksponerede hydrofobe regioner, som ofte viser negativt høj baggrund fluorescens. Fluorophores med alternative transportformer aktion findes (Se diskussion), men det kan i stedet være ønskeligt at spore denaturering gennem iboende protein fluorescens med nanoDSF.
Tryptofan restkoncentrationer, der er begravet i upolære regioner af en protein fluorescerer med en emission maksimum på 330 nm. Som en protein prøve udfolder og disse rester bliver udsat for et polært opløsningsmiddel, gennemgår deres maksimale emission en bathochromic Skift til 350 nm13. nanoDSF udnytter dette skift i emission maksimale at sonde udfoldelsen af et protein prøve uden behov for ydre fluorophores14.
Smelt kurver viser enkelt denaturering trin kan analyseres ved at montere data til en Boltzmann sigmoide model. Temperatur på vendepunkt af udfoldelsen overgangen (Tm) bruges som en kvantitativ måling af protein termisk stabilitet og et benchmark for at sammenligne gunstighed af forskellige betingelser.
Smelt kurver af den samme protein i forskellige betingelser besidder undertiden en grad af heterogenitet, der kan gøre en Boltzmann sigmoide montering uigennemførlige. For at skelne Tm værdier fra data, der afviger fra den klassiske kurve topologi, kan numeriske metoder bruges som dem ansat i NAMI, en open source TSA data analysis program11. Alternative termodynamiske rammer kan også bruges til at analysere mere komplekse kurver med flere denaturering trin, som ProteoPlex metode15.
Stabilitet skærme var designet til brug i TSA og nanoDSF eksperimenter til hurtigt at identificere gunstige betingelser for en target protein (figur 3, skærmen kompositioner er tilgængelige i de supplerende oplysninger). Oplysninger, der indsamles med skærmene kan bruges i mange faser af krystallografiske pipeline, herunder: prøve opbevaring; rensning, minimere udbyttetab gennem protein udspiller sig under rensningsprocessen; analysen design, styrke protein funktionalitet i aktivitet assays med termisk stabilisering af buffere og endelig krystallisering, vejlede rationelt designet krystallisering forsøg.
At vælge en passende buffer system grundlag for et protein prøve er afgørende; uforenelige pH værdier kan føre til deaktivering eller denaturering af et protein. Men tilstedeværelsen af co krystalliseret buffer molekyler løst i et stort antal X-ray krystal strukturer (tabel 1) kunne også være vejledende for en stabiliserende effekt, der er særskilt til simple pH forordning og i stedet stammer fra kemiske funktioner af buffer-molekylet.
Formuleret med flere af gods buffere17,18,19 sammen med andre almindeligt biologisk-kompatible buffersystemer, er pH-skærmen designet til at deconvolute den kemiske virkning af en buffer molekyle på protein stabilitet fra den faktiske pH af den resulterende løsning. Ved at give tre pH-værdier for hver buffersystem og indarbejde pH værdi redundans mellem forskellige systemer, kan pH-skærmen identificere både gunstige pH værdier og gunstige buffersystemer for en target protein.
Skærmbilledet salt indeholder almindeligt laboratorium salte samt chaotropes, chelants, tungmetaller og reduktionsmiddel. Skærmen kan give en generel angivelse af affiniteten af et protein prøven til miljøer med høje Joniske styrker, men hver undergruppe af forbindelser kan også give oplysninger om den potentielle strukturen af et protein. For eksempel kunne en chelant betydeligt destabiliserende et protein være vejledende for vigtige strukturelle metaller i prøven. Hvis prøven er også kraftigt stabiliseret af en metal kation inden for skærmen, kan dette give en lovende udgangspunkt for yderligere strukturelle eksperimenter.
Osmolytes er opløselige forbindelser, der påvirker de osmotiske egenskaber af deres miljø. I naturen, kan de bruges som "kemiske chaperoner", håndhæve foldning af uordnede proteiner og stabilisere dem, især i stress betingelser20,21,22. Disse egenskaber gør dem attraktive tilsætningsstoffer i Proteinkrystallografi; brugbare som cryoprotectants i crystal høst, montering og opbevaring processer23. Osmolytes' potentielle anvendelse omfatter også rensning af proteiner. En betydelig del af rekombinante proteiner udtrykt i E. coli kan være uopløselige og vanskeligt at inddrive i den native tilstand ved hjælp af standard rensning metoder. Osmolytes kan bruges til at stabilisere og redde proteiner fra uopløselige fraktioner, stigende rensning giver24.
Skærmbilledet osmolyte var designet ved hjælp af etablerede forbindelser til stede i Protein Data Bank poster25 og Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated veje (DEOP)26 database og optimeret iterativt ved hjælp af standard proteiner. Skærmen er bygget omkring otte underklasser til osmolyte: glycerol, sukker og polyoler, ikke-rengøringsmiddel sulfobetaines (NDSBs), betaines og deres analoger, organofosfater, dipeptider, aminosyrer og deres derivater og en sidste diverse gruppe. Hver osmolyte er til stede i flere koncentrationer baseret på dets opløselighed og effektiv koncentrationsintervaller for sammenligning.
Protocol
1. forberedelse af Protein prøve
- Formulere stabilitet skærme som 500 µL delprøver i 96-brønd blokke og forsegle til opbevaring. Overfør 10 µL af hver betingelse af en skærm, stabilitet i de tilsvarende godt af en 96-brønd plade ved hjælp af en multi-kanal pipette til at spare tid (figur 4A).
- Forberede 1 mL af en ca. 1 mg mL-1 protein løsning i en passende buffersystem. Mens sammensætningen af en passende buffer varierer med hver prøve, protein, er en god første buffer til at prøve 10 mM natriumfosfat med 100 mM NaCl, pH 7,2.
Bemærk: Acceptabel protein koncentrationer variere fra sag, men koncentrationsintervaller af 0,5 - 5 mg mL-1 typisk producere analyzable kurver. Fortyndet buffere anbefales til brug med stabilitet skærme at undgå afmaske effekterne for hver betingelse. Typiske buffer kompositioner er ca 10 mM buffer med omkring 100 mM NaCl. - Hvis udfører en TSA eksperiment, skal du tilføje SYPRO Orange farvestof til protein prøven til en endelig koncentration på 20 x. Bland enten ved inversion eller korte vortexing.
- Overføre 10 µL af opløsningen protein til hvert hul i 96-brønd pladen forberedt i trin 1.1 (fig. 4B).
- Forsegle og centrifugeres 96-brønd plade for 2 min på 600 x g at sikre protein prøve og skærmen komponent er blandet (fig. 4C).
- Re forsegle skærmbilledet stabilitet dyb brønd blok og gemme skærmbilledet ved 4 ° C i op til 4 måneder. Gemme skærmbilledet salt i mørket, som nogle komponenter er lysfølsomme.
- Hvis udfører en nanoDSF eksperiment, skal du fortsætte tiltrin 2. Hvis udfører en TSA eksperiment, springe til trin 4.
2. udarbejde en nanoDSF eksperiment
- Sikre, at udstyret er ren, med særlig vægt på støv nær prøve rack. Hvis systemet har et backscattering spejl, rense det med ethanol og en fnugfri serviet.
- Åbne prøve skuffen ved at trykke på knappen Åbn kasseskuffe . (Figur 5A).
- Indlæse kapillærer med ca. 10 µL fra hver brønd af 96-brønd plade af rørende ene ende af kapillar oploesningen, derefter placere dem i de tilsvarende kapillær indehavere af prøven rack (figur 5B). Vær omhyggelig med ikke at forurene midten af kapillærer med fingeraftryk, osv., da dette kan forstyrre fluorescens aflæsninger under hele forsøget.
- Immobilisere kapillærer med forsegling magnetstriben (figur 5C).
3. programmering en nanoDSF eksperiment
- Lancere en indledende scanning for at afsløre holdning og intensiteten af hver kapillær ved at trykke på knappen Start Discovery Skan i fanen Opdagelse Skan stigning eller formindske hændelse excitation styrken fra en indledende magt på 10% indtil den toppen af hver kapillær scanning er mellem 4.000-12.000 enheder (fig. 5D).
- For at sikre, at prøven er foldet og tilstrækkeligt koncentreret, anbefales en indledende smelte scanning med en stejl temperaturgradient. I fanen Smeltende Skan program en smelte Skan ved at angive indstillingen Temperatur skråning til 7,0 ° C min-1, Start temperatur til 25 ° C og Slutningen temperatur til 95 ° C, så lancere nanoDSF eksperiment ved at trykke på Start smeltende knappen. Hvis den resulterende smelte kurver viser ikke en påviselig vendepunkt, overveje at koncentrere prøvens yderligere eller kontrol, hvis proteinet er foldet korrekt.
- Gentag trin 2.1-2.4 at forberede prøverne til en fuld eksperiment.
- I fanen Smeltende Skan program en smelte Skan ved at angive indstillingen Temperatur skråning til 1,0 ° C min-1, Start temperatur til 25 ° C og Slutningen temperatur til 95 ° C, så lancere nanoDSF eksperiment ved at trykke på knappen Start smelter .
4. udfører en TSA eksperiment
- Åbn prøve skuffe ved fast ved at trykke på led på højre side af skuffen. Anbring 96-brønd bakke i RT-PCR-system med godt A1 til back-venstre (figur 4D).
- Klik på knappen Nyt eksperiment for at begynde at oprette en TSA eksperiment.
- I fanen Eksperimentere egenskaber skal du klikke på indstillingen Smelte kurve når du bliver spurgt hvilken type eksperiment vil du konfigurere? og anden muligheden, når du bliver spurgt som reagenser vil du bruge til at opdage mål sekvens?
- I den plade Setup / definere mål og prøver fanen, indtaste en target navn derefter indstille Reporter som ROX og Quencher som ingen.
- I den plade Setup / tildele mål og prøver fanen, tildele hver brønd af 96-brønd plade til target navn angivet i forrige trin. I den samme tab, indstille valg farvestof til brug som passiv reference som ingen.
- I fanen Kør metode slette trin indtil der er i alt tre. Angiv det første skridt til 25,0 ° C, rampe sats 100%, tid 00:05; det andet skridt at 95.0 ° C, rampe sats 1%, tid 01:00; det tredje skridt til 95.0 ° C, rampe sats 100%, tid 00:05. Vælge at indsamle data ved hjælp af rullemenuen Indsamle Data eller ved at trykke på ikonet Dataindsamling (figur 6).
- Indstille reaktion volumen pr. brønd til 20 µL.
- Tryk på knappen Start Kør at begynde TSA eksperiment.
5. dataanalyse
- Vælge en bølgelængde afbilde en smelte kurve med. For nanoDSF eksperimenter, forholdet mellem fluorescens intensiteter på 330 nm og 350 nm (svarende til tryptofan i upolære og polar miljøer, henholdsvis)13 er almindeligt anvendt. For de fleste TSAs, farvestof emission maksimale er velegnet til smelte kurve plotte (emission maksimalt SYPRO Orange er 569 nm)12.
- Beregn Tm værdierne for hver betingelse ved at bestemme bøjning point (s) af hver smelte kurve. De fleste nanoDSF systemer beregne automatisk Tm værdier af numeriske differentiering af smelte kurver efter dataopsamling. Hvis den anvendte software ikke beregnes automatisk Tm værdier, kan frie, alternative GUI-drevet software som NAMI11 automatisere dataanalyse og nedstrøms behandling, giver mulighed for at producere et heatmap sammenfatter Tm værdier for hele 96-brønd eksperiment (den ledsagende reference indeholder vejledning og ressourcer for databehandling med NAMI).
- Sammenligne Tm værdier af alle de adspurgte. Stabilitet-skærme indeholder to brønde på hver skærm (A1 og A2), der indeholder kun vand. Tager de kun vand-værdier som benchmark giver beregningen af ΔTm værdier, adressering systematiske fejl og giver mulighed for nem sammenligning af stabiliserende virkninger. Højere Tm værdier angiver termisk stabiliserende betingelser, som er anbefalet til efterfølgende brug. Lovende betingelser vise ofte en koncentration afhængighed i deres stabilisering.
Representative Results
Lysozym blev analyseret med stabilitet skærme og Protein X, en target proteinet i projektets Virus-X blev analyseret med skærmbilledet osmolyte. Begge proteiner generelt produceret smelte kurver med klart definerede denaturering overgange i både TSA og nanoDSF eksperimenter (Se ledsager tallene for repræsentative kurver). I nogle få tilfælde hvor de prøver, der gjorde ikke producere fortolkelige kurver med en defineret denaturering overgang blev fortolket som denatureret og ikke inkluderet i Tm sammenligninger.
Figur 7 viser prøveresultater fra skærmbilledet salt eksemplificere egenskaberne termisk stabilisering af ammoniumklorid mod lysozym. Koncentration afhængigheder som vist ovenfor er ofte tegn på lovende betingelser, men det kan være nyttigt at sammenligne resultaterne af ion koncentration med flere forskellige salte at se hvis termisk stabilisering generelt opstår fra en stigning i buffer ionisk styrke eller hvis tilstedeværelsen af specifikke ioner giver ekstra stabilitet.
Sammenligning af Tm værdier af lysozym med pH-skærmen (figur 8) afslører to stykker af information. For det første, der er en generel tendens til øget stabilitet med faldende pH værdier. For det andet, de vifte af Tm værdier opnået med forskellige buffersystemer med identiske pH værdier kan være betydelige.
Data Figur 8 tyder på, at aftalen mellem TSA og nanoDSF i dette eksperiment er generelt god, men nanoDSF viser en tendens til at identificere lidt højere Tm værdier og lidt større Tm skifter end TSA. Men nogle brønde med pH værdier over 8,5 viser store forskelle mellem Tm værdier fremstillet af TSA og nanoDSF. Forskelle kunne potentielt tilskrives denaturering mekanisme af protein ved forskellige pH-værdier; for eksempel, kunne en hydrophobicity-følsomme farvestof give en forholdsvis lav Tm læsning hvis hydrofobe regioner af en protein blive udsat for opløsningsmidler betydeligt hurtigere end miljøet af tryptophan restkoncentrationer ændringer i polaritet.
Figur 9 viser en heatmap Tm værdier opnået med lysozym ved hjælp af skærmbilledet osmolyte. Betingelser med de højeste Tm stigninger i forhold til kontrolhullerne (wells A1 og A2, indeholdende deioniseret vand) er farvet mørk blå. Især stabiliserende betingelser fremgår af figur 9 omfatter glycerol, 1 M D-sorbitol, 100 mM hypotaurine og 10 mM Ala-Gly (brønde A4-A6, A9, E7 og F8, henholdsvis).
Figur 10 viser en heatmap Tm værdier opnået med Protein X. TSA og nanoDSF eksperimenter med skærmbilledet Osmolyte afslører at størstedelen af osmolytes testet give enten en mindre stigning i Tm (inden for 1 ° C) eller have en skadelig virkning på Protein X'er stabilitet. Dipicolinic syre i en koncentration på 10 mM (godt D1) forekommer især at denaturere prøve ved stuetemperatur. TSA og nanoDSF resultaterne identificere hurtigt dipicolinic syre som tilsætningsstof uforenelig for Protein X, som bør undgås, når du arbejder med protein. Ikke desto mindre høje koncentrationer af D-sorbitol og arabinose (wells A9 og B9, begge på 1 M) samt glycerol og TMAO (brønde A4-A6 og E1, henholdsvis) blev identificeret som termisk stabilisering.
For Lysozym, blev kombinationer af betingelser giver de højeste Tm værdier fra hver stabilitet skærm testet til at probe for en kombineret synergieffekt. Figur 11 viser en generel stigning i Tm værdier som mere komponenter af buffersystem (pH, salt og osmolyte) er tilføjet. I tilfælde af MES, ammoniumsulfat og D-sorbitol, en Tm øge så store som 10 ° C kan observeres når alle komponenter er til stede i forhold til MES alene. Figur 11 viser, at en mærkbar synergistisk effekt kan opstå, når individuelle komponenter af en buffer er optimeret og kombineret med stabilitet skærme.
En mere generel bemærkning illustrerer Figur 11 også omfanget af ΔTm værdier, som kan observeres i TSA og nanoDSF eksperimenter. Omfanget af ΔTm opnåelige varierer betydeligt baseret på protein-systemet, men enhver ΔTm værdi omkring og over 5 ° C er ofte tegn på en gavnlig stabiliserende virkning.
Figur 1 : Bioprospecting. Prøvetagning fra en ekstrem omgivelser i Virus-X-projektet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: TSA skematisk. Kommenterede eksempel på en typisk smelte kurve fremstillet af en TSA eksperiment. Denne kurve er karakteristisk for klassiske "to-stats" protein udfoldning, hvor befolkningens prøve overgange fra foldet til denatureret uden påviselige delvist foldet mellemprodukter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Stabilitet skærme arbejdsproces. Standard arbejdsproces af buffer optimering ved hjælp af stabilitet-skærme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Arbejdsproces af standard TSA eksperimentere med stabilitet skærme. Fra venstre mod højre: (A) Pipetting delprøver af stabilitet skærme til en 96-brønd plade. B pipettering protein prøve med fluorescerende farvestof i pladen. C plombering plade inden centrifugering. (D) at placere pladen i et RT-PCR-system. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: arbejdsproces af en standard nanoDSF eksperiment. (A) åbning kapillær loading rack. (B) indlæsning kapillærerne i racket. C immobilisere kapillærer med forsegling magnetstriben. (D) programmering et eksperiment. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Brugergrænseflade til ordningen RT-PCR. En TSA eksperiment er programmeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Salt skærmen eksempeldata. A forholdet mellem fluorescens intensiteter på 350 nm vs 330 nm for en etiket-fri nanoDSF eksperiment med lysozym. Prøverne modsvarer wells C7-C12 af skærmbilledet salt (1,5 M - 0,2 M ammoniumklorid). Beregnede Tm værdier for hver betingelse er overlejret på plottet. (B) oversigt over Tm værdier beregnet ud fra de data, der er præsenteret i figur 7A. C fluorescens intensiteter på 590 nm for en TSA eksperiment ved hjælp af lysozym med en hydrophobicity-følsomme reporter farvestof. Som figur 7Amodsvarer prøverne wells C7-C12 af skærmbilledet salt. Beregnede Tm værdier er overlejret på grafen. D Resumé af Tm værdierne beregnet ud fra data, der findes i figur 7C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: pH skærm eksempeldata. Resumé af Tm forskydninger fremstillet med lysozym og pH-skærmen. Hvert punkt repræsenterer en uafhængig tilstand; punkter på samme pH-værdien er af forskellige buffersystemer på samme pH. Tm forskydninger beregnes i forhold til en kontrol Tm 68.0 ° C for TSA eksperimenter og 71.9 ° C for nanoDSF eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 : Osmolyte skærmen eksempeldata (lysozym). Oversigt over Tm værdier fra et label-fri nanoDSF eksperiment med lysozym og hver brønd i skærmbilledet osmolyte. Tm værdier (i ° C) er i forhold til brøndene A1 og A2, som indeholder vand som en kontrol. Et heatmap blev genereret baseret på ΔTm værdier sammenlignet (blå betegner en Tm stigning og red et Tm fald). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Osmolyte skærm eksempeldata (Protein X). (A) Resumé af Tm værdier opnået fra en etiket-fri nanoDSF eksperiment med Protein X og skærmbilledet osmolyte. Tm værdier sammenlignes brønde A1 og A2, som indeholder vand som en kontrol. Et heatmap blev genereret baseret på ΔTm værdier sammenlignet (blå betegner en Tm stigning og red et Tm fald). (B) nanoDSF kurver fremstillet af godt A9 (1 M D-sorbitol, en stabiliserende tilstand) og D1 (10 mM dipicolinic syre, en destabiliserende tilstand). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11 : Buffer optimering effekt på Tm. TSA Tm værdier af lysozym kombineret med betingelserne for hver skærm, der giver den største stigning i Tm. 100 mM eddikesyre, 100 mM MES, og pH 4.2 pH 5.6, blev valgt som buffersystemer sammen med 1,5 M ammoniumsulfat som salt. Osmolyte koncentrationer var identiske med dem som findes på skærmbilledet osmolyte: 10 mM Ala-Gly, 1 M D-sorbitol, 50 mM L-lysin og 100 mM hypotaurine. Fejllinjer udgør standardafvigelsen af seks replikater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Molekyle | FBF kode | Hyppigheden af co krystallisation |
| Fosfat | PO4 | 5132 |
| Acetat | ACT | 4521 |
| 2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonic syre (MES) | MES | 1334 |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane (tris) | TRS | 1155 |
| Formate | FMT | 1072 |
Tabel 1: oversigt over buffer molekyle Co krystallisering frekvens i Protein Data Bank (FBF) poster. Oplysninger indhentet gennem PDBsum16 fra ialt 144,868 poster (korrekt fra 12-5-18).
Supplerende oplysninger. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 1. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 2. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Supplerende tabel 3. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Kritiske aspekter inden for protokollen omfatter centrifugering trin og korrekt forsegling af 96-brønd plade for TSA eksperimenter (trin 1,5). Centrifugering sikrer, at protein prøve og skærm tilstand komme i kontakt og bland. Desuden, hvis en ulukkede plade der bruges til en TSA eksperiment, der er en betydelig risiko for Opløsningsmidlet fordamper hele eksperimentet, forårsager en stigning i stikprøven koncentration og øge risikoen for for tidlig protein sammenlægning.
TSAs og nanoDSF er indstillet til en bred vifte af protein prøver; langt størstedelen af prøver kan producere fortolkelige smelte kurver med en hydrophobicity-baseret reporter farvestof eller gennem dye-fri nanoDSF. Hvis standard fluorescens kilder ikke er egnet til din protein, er den enkleste ændring af den protokol, der kunne udforskes nærmere valget af fluorophore. Flere alternative farvestoffer kunne være egnet til TSA eksperimenter. Eksempler kan nævnes N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM), et stof, der fluorescerer efter reagerer med en thiol27, og 4-(dicyanovinyl) julolidine (DCVJ), et stof, der varierer sin fluorescens, baseret på den stivhed af dens miljø, øge sin fluorescens som et protein prøve udfolder28,29 (sidstnævnte farvestoffet kræver ofte høje koncentrationer af prøven).
Alternative analysemetoder smelte kurve er tilgængelige, hvis Tm ikke beregnes automatisk instrument software. Hvis data er homogen og kun én denaturering skridt er tilsyneladende i smelte kurver, kan en afkortet datasæt monteres på en Boltzmann sigmoid med følgende ligning:
Hvor F er fluorescens intensitet ved temperaturen T, Fmin og Fmax er fluorescens intensiteter før og efter denaturering overgangen, Tm er henholdsvis midtpunktet temperatur denaturering overgang og C er hældningen på Tm. Denne metode fungerer godt for simpel totrins denaturering processer, men det er uegnet til komplekse smelte kurver med flere overgange.
En af de store fordele ved TSA er dens tilgængelighed; TSA eksperimenter kan udføres i ethvert system, RT-PCR med filtre ved passende bølgelængder til fluorescens dye ansat. Dette kombineret med de lave priser på forbrugsvarer, nem betjening og relativt lav mængde protein behov, gøre TSA en værdifuld teknik til en bred vifte af projektet skalaer, både i industrien og den akademiske verden.
Og med angivelse af gunstige buffer betingelser indeholder skærmene nogle brønde, der kan give fingerpeg til tilstedeværelsen af strukturelle metaller i en stikprøve protein. Brønde, der kan være af særlig interesse i skærmbilledet salt er G6 og G7, som indeholder 5 mM EDTA og 5 mM EGTA, henholdsvis. Betydelig termisk destabilisering i disse brønde kan være tegn på vigtige metalioner i proteinet, der er afsondret af chelants. Forbindelser inden for osmolyte skærmen kan også potentielt give fingerpeg til funktionen af et protein. Mange af forbindelser i skærmen tilhører klasser molekyle, der er fælles substrater af enzymer. For eksempel, kunne den generelle stabilisering af saccharider (findes i brøndene A11-B10) for lysozym tilskrives deres strukturelle lighed med etablerede substrater af enzymet, N-acetylglukosamin oligomerer30.
De TSA og nanoDSF protokoller skitseret ovenfor kan også tilpasses studere protein-ligand interaktioner. Ligander, der bindes specifikt til et protein kan øge sin termiske stabilitet ved at indføre nye interaktioner i komplekset. En dosisafhængig positive forskydning i protein Tm er et lovende tegn på en vellykket protein-ligand interaktion. Hastighed, overførselshastighed og lave omkostninger ved screening sammensatte biblioteker med TSAs har gjort det en meget populær metode i tidlige drug discovery.
Optimere buffer ordningens mål proteiner og deres ligand komplekser kan være afgørende for et projekts succes, da mange litteratur eksempler demonstrerer31,32,33,34. Med en typisk analyse tager under 2 h herunder opstillingstid, repræsenterer TSAs og nanoDSF kombineret med stabilitet skærme en hurtig, billig teknik til buffer optimeringer.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette projekt har modtaget støtte fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forskning og innovation program (grant aftale n ° 685778). Dette arbejde blev støttet af bioteknologi og biologiske Sciences Research Council (BBSRC, grant numre BB/M011186/1, BB/J014516/1). DB tak den BBSRC ph.d.-uddannelse partnerskab Newcastle-Liverpool-Durham for en studentship og Durham Universitet Institut for Biosciences for bidrager mod finansieringen dette arbejde. Vi takke Ian Edwards for hans hjælp og Durham Universitet Institut for kemi-massespektrometri Institut for deres instrumentale analyse for Protein X. Vi er taknemmelige til Arnthor Ævarsson for hans arbejde med Virus-X projekt og tak også til Claire Hatty og NanoTemper GmbH for udlån og bistå med Prometheus NT.48 systemet til dette projekt. Endelig tak til Frances Gawthrop og Tozer frø for deres støtte som en del af BBSRC iCASE award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysozyme | Melford Laboratories | L38100 | Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme. |
| The Durham pH Screen | Molecular Dimensions | MD1-101 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
| The Durham Salt Screen | Molecular Dimensions | MD1-102 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
| The Durham Osmolyte Screen | Various | #N/A | 96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents. |
| SYPRO Orange | Invitrogen | S6651 | Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF. |
| 96-well PCR Plate | Starlab | 1403-7700 | Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System. |
| 7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | 96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost. |
| Prometheus NT.48 | NanoTemper Technologies | #N/A | Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software. |
| Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries | NanoTemper Technologies | PR-C002 | Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1). |
References
- Kapust, R. B., Waugh, D. S. Controlled intracellular processing of fusion proteins by TEV protease. Protein Expression and Purification. 19 (2), 312-318 (2000).
- Cordingley, M. G., Register, R. B., Callahan, P. L., Garsky, V. M., Colonno, R. J. Cleavage of small peptides in vitro by human rhinovirus 14 3C protease expressed in Escherichia coli. Journal of Virology. 63 (12), 5037-5045 (1989).
- Hjorleifsdottir, S., Aevarsson, A., Hreggvidsson, G. O., Fridjonsson, O. H., Kristjansson, J. K. Isolation, growth and genome of the Rhodothermus RM378 thermophilic bacteriophage. Extremophiles. 18 (2), 261-270 (2014).
- Alva, V., Nam, S. Z., Söding, J., Lupas, A. N. The MPI bioinformatics Toolkit as an integrative platform for advanced protein sequence and structure analysis. Nucleic Acids Research. 44, Issue W1 410-415 (2016).
- McPherson, A. Protein Crystallization. Methods in molecular biology. 1607, Clifton, N.J. 17-50 (2017).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- Reinhard, L., Mayerhofer, H., Geerlof, A., Mueller-Dieckmann, J., Weiss, M. S. IUCr Optimization of protein buffer cocktails using Thermofluor. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 69 (2), 209-214 (2013).
- Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).
- Kozak, S., Lercher, L., Karanth, M. N., Meijers, R., Carlomagno, T., Boivin, S. Optimization of protein samples for NMR using thermal shift assays. Journal of Biomolecular NMR. 64 (4), 281-289 (2016).
- Semisotnov, G. V., Rodionova, N. A., Razgulyaev, O. I., Uversky, V. N., Gripas', A. F., Gilmanshin, R. I. Study of the "molten globule" intermediate state in protein folding by a hydrophobic fluorescent probe. Biopolymers. 31 (1), 119-128 (1991).
- Grøftehauge, M. K., Hajizadeh, N. R., Swann, M. J., Pohl, E. Protein-ligand interactions investigated by thermal shift assays (TSA) and dual polarization interferometry (DPI). Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 71, 36-44 (2015).
- Steinberg, T. H., Jones, L. J., Haugland, R. P., Singer, V. L. SYPRO Orange and SYPRO Red Protein Gel Stains: One-Step Fluorescent Staining of Denaturing Gels for Detection of Nanogram Levels of Protein. Analytical biochemistry. 239, 223-237 (1996).
- Burstein, E. A., Vedenkina, N. S., Ivkova, M. N. Fluorescence and the location of tryptophan residues in protein molecules. Photochemistry and Photobiology. 18 (4), 263-279 (1973).
- Haffke, M., Rummel, G., Boivineau, J., Münch, A., Jaakola, V. -P. nanoDSF: label-free thermal unfolding assay of G-protein-coupled receptors for compound screening and buffer composition optimization. Application Note NT-PR-008. , (2016).
- Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparsematrix screening of chemical space. Nature Methods. 12 (9), 859-865 (2015).
- Laskowski, R. A. PDBsum: summaries and analyses of PDB structures. Nucleic Acids Research. 29 (1), 221-222 (2001).
- Good, N. E., Winget, G. D., Winter, W., Connolly, T. N., Izawa, S., Singh, R. M. Hydrogen ion buffers for biological research. Biochemistry. 5 (2), 467-477 (1966).
- Good, N. E., Izawa, S. Hydrogen ion buffers. Methods in enzymology. 24, 53-68 (1972).
- Ferguson, W. J., et al. Hydrogen ion buffers for biological research. Analytical biochemistry. 104 (2), 300-310 (1980).
- Welch, W. J., Brown, C. R. Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding. Cell stress & chaperones. 1 (2), 109-115 (1996).
- Diamant, S., Eliahu, N., Rosenthal, D., Goloubinoff, P. Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses. The Journal of biological chemistry. 276 (43), 39586-39591 (2001).
- Yancey, P. H. Organic osmolytes as compatible, metabolic and counteracting cytoprotectants in high osmolarity and other stresses. Journal of Experimental Biology. 208 (15), 2819-2830 (2005).
- Garman, E. F., Owen, R. L. Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 62 (1), 32-47 (2006).
- de Marco, A., Vigh, L., Diamant, S., Goloubinoff, P. Native folding of aggregation-prone recombinant proteins in Escherichia coli by osmolytes, plasmid- or benzyl alcohol- overexpressed molecular chaperones. Cell Stress & Chaperones. 10 (4), 329 (2005).
- Berman, H. M., et al. The protein data bank. Nucleic acids research. 28 (1), 235-242 (2000).
- Bougouffa, S., Radovanovic, A., Essack, M., Bajic, V. B. DEOP: A database on osmoprotectants and associated pathways. Database. 2014 (0), 1-13 (2014).
- Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale Fluorescent Thermal Stability Assay for Membrane Proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
- Kung, C. E., Reed, J. K. Fluorescent molecular rotors: a new class of probes for tubulin structure and assembly. Biochemistry. 28 (16), 6678 (1989).
- Iio, T., Itakura, M., Takahashi, S., Sawada, S. 9-(Dicyanovinyl)julolidine binding to bovine brain calmodulin. Journal of biochemistry. 109 (4), 499-502 (1991).
- Veros, C. T., Oldham, N. J. Quantitative determination of lysozyme-ligand binding in the solution and gas phases by electrospray ionisation mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21 (21), 3505-3510 (2007).
- Kean, J., Cleverley, R. M., O'Ryan, L., Ford, R. C., Prince, S. M., Derrick, J. P. Characterization of a CorA Mg2+ transport channel from Methanococcus jannaschii using a Thermofluor-based stability assay. Molecular membrane biology. 25 (8), 653-661 (2008).
- Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes. Acta Crystallographica Section F. 68 (5), 596-600 (2012).
- Morgan, H. P., Zhong, W., McNae, I. W., Michels, P. A., Fothergill-Gilmore, L. A., Walkinshaw, M. D. Structures of pyruvate kinases display evolutionarily divergent allosteric strategies. Royal Society open science. 1 (140120), (2014).
- Moretti, A., Li, J., Donini, S., Sobol, R. W., Rizzi, M., Garavaglia, S. Crystal structure of human aldehyde dehydrogenase 1A3 complexed with NAD+ and retinoic acid. Scientific reports. 6 (35710), (2016).
