Summary
빠르게 열 교대 분석 실험 및 차동 스캔 fluorimetry 나노 통해 조건의 다양 한 단백질의 열 안정성을 테스트 하는 프로토콜 제공 됩니다. 버퍼 시스템, 소금 및 첨가물, 함께 기능 및 구조 연구에 대 한 적당 한 버퍼를 식별 하는 단백질 분석은 3 독특한 안정성 화면 구성.
Abstract
Horizon2020 바이러스 X 프로젝트는 선택 된 극단적인 생활권의 virosphere를 탐구 하 고 새로운 바이러스 성 단백질을 발견을 2015 년에 설립 되었다. 이러한 단백질, 단백질의 분석의 잠재적인 공학적 가치를 평가 하 구조와 기능에이 프로그램 중앙 도전 이다. 단백질 샘플의 안정성은 의미 있는 분석 결과 제공 하는 대상의 crystallizability 증가 필수적 이다. 열 교대 분석 실험 (TSA), 형광 기반 기술, 단백질 안정성 높은 처리량에 대 한 조건을 최적화 하기 위한 인기 있는 방법으로 설정 됩니다. TSAs, 고용된 fluorophores에 외부, 환경에 민감한 염료. 대신, 비슷한 기술은 나노 단백질 천연 형광에 의존 하는 fluorimetry (nanoDSF), 검사 차동 이다. 선물이 여기 소설 osmolyte 화면, 예비 TSA 실험을 통해 결정 화 실험을 안내 하도록 설계 된 유기 첨가제의 96-조건 화면. 이전 개발 pH 및 소금 스크린, 3 스크린의 집합 버퍼 시스템 및 첨가제의 넓은 범위에서 단백질 안정성에 대 한 포괄적인 분석을 제공합니다. 스크린의 유틸리티는 lysozyme 단백질 X, 바이러스 X 프로젝트의 대상 단백질의 TSA와 nanoDSF 분석에서 보여 줍니다.
Introduction
바이러스 소스에서 발생 한 많은 biotechnologically 유용 효소와 같은 담배 엣지 바이러스 (TEV) 효소1 인간의 이노 입력 3 C (HRV 3 C) 프로 테아 제2. Horizon2020 바이러스 X 프로젝트 (그림 1)3. 이 프로그램의 목적은 (a) 알려진된 효소 가족의 속성의 범위를 확장 하 고 (b)를 아직 알 수 없는 함수 (효소 X)의 새로운 효소의 특성입니다. 결정학 구조 결정 단백질 시퀀스 인식4넘어 진화 했습니다 경우에 특히 대상 단백질 특성에 중추적인 역할을 하고있다. 단백질 안정성; 결정 화 과정에서 중요 한 요소 이다 샘플 양식 높은-품질, 결정 diffracting 시간의 기간 동안 conformationally 균질 성 및 구조적으로 소리 되어야 합니다. 또한, 단백질 또한 유리한 분자 환경에 의해 촉진 될 수 있습니다 그들의 활성 구조에 존재 하는 활동 분석 실험을 위해 필수적 이다.
Crystallographers에 사용할 수 있는 기술 개발에도 불구 하 고 단백질 결정 화 시간과 노동 집약적인 경험적 프로세스5남아 있습니다. 솔루션에서 단백질 안정성 향상을 위해 예비 생물 실험 단백질 결정 화에 대 한 더 나은 출발점을 명확 하 게 제공 하 고 일반적으로 비교적 적은 양의 단백질 샘플6,7, 소비 8,9. 이 프로젝트에서 공부 될 대상 단백질의 다 수 또한 확장성, 높은 처리량 안정성 분석을 필요로 합니다. 사전 결정 화 단백질의 생물 특성에 대 한 가장 인기 있는 방법 중 하나는 열 교대 분석 실험 (또한 TSA 또는 시차 fluorimetry, DSF)10,11.
TSAs는 단백질의 열 변성을 추적 하는 환경에 민감한 형광 염료를 사용 합니다. 많은 염료는 일반적으로 사용 되는 그들의 환경, 종종 소수 환경에서 높은 형광 출력을 표시 하지만 극 지 환경12에 냉각 하는 빠른 진행의 극성에 따라 가변 형광 활동. 단백질은 일반적으로 그들의 소수 성 중 핵 변성, 단백질 집계 (그림 2)을 시작으로 종종 매우 높은 온도에서 염료 형광 감소 다음 중 노출 될 염료 형광에서 뚜렷한 증가 일으킬.
Hydrophobicity에 민감한 염료는 종종 일반 사용 TSA 염료에 대 한 좋은 선택, 그것은 수 있습니다 종종 해롭게 높은 배경 형광 표시 하는 큰, 용 매에 노출 된 소수 성 영역 단백질에 적합. 작업의 다른 모드와 Fluorophores 존재 (내용 참조), 하지만 대신 nanoDSF와 본질적인 단백질 형광 통해 변성을 추적 하는 것이 좋습니다 있을 수 있습니다.
330의 방출 최대 형광 단백질의 비 극성 지구에 묻혀 있는 트립토판 잔류물 nm. 단백질 견본 펼쳐진다 고이 잔류물은 극 지 용 매에 노출 될, 그들의 방출 최대 350 nm13bathochromic 변화를 겪 습. nanoDSF 외부 fluorophores14에 대 한 필요 없이 단백질 샘플의 전개을 최대 방출에 있는이 교대를 이용 한다.
녹여 곡선 표시 단일 변성 단계 볼츠만 자형 모델에 데이터를 피팅 하 여 분석할 수 있습니다. 펼쳐진 전환 (Tm)의 굴절 점에서 온도 다른 조건의 favorability 비교 단백질 열 안정성의 정량적 측정 및 벤치 마크로 사용 됩니다.
다른 조건에서 동일한 단백질의 용융 곡선 때로는 볼츠만 자형 피팅 unfeasible 만들 수 있는 성분의 정도를 소유한 다. 고전적인 곡선 토폴로지에서 벗어나는 데이터에서 Tm 값을 분별, 수치 방법 나 미, 오픈-소스 TSA 데이터 분석 프로그램11에 같이 사용할 수 있습니다. 다른 열역학 프레임 워크 ProteoPlex 방법론15등 여러 변성 단계와 더 복잡 한 곡선 분석을 사용할 수 있습니다.
안정성 화면 빠르게 대상 단백질에 대 한 유리한 조건을 식별 하기 위해 TSA와 nanoDSF 실험에 사용 하기 위해 설계 되었습니다 (그림 3, 화면 구성을 사용할 수 있습니다는 보충 정보에). 결정학 파이프라인 등의 많은 단계에서 스크린으로 수집한 정보를 사용할 수 있습니다: 저장; 샘플 정화, 단백질 정화 과정; 전개를 통해 생산량 손실을 최소화 디자인, 강화 열 안정화 버퍼 및 마지막으로 결정 화, 합리적으로 설계 결정 화 실험을 지도 함께 활동 분석 실험에서 단백질 기능 분석
단백질 견본에 대 한 적당 한 버퍼 시스템으로 선택 하는 것은 매우 중요; 호환 되지 않는 pH 값 비활성화 또는 단백질의 변성 될 수 있습니다. 그러나, x 선 결정 구조 (표 1)의 많은 수에서 해결 하는 공동 결정된 버퍼 분자의 존재 또한 수은 간단한 pH 규정에 별도 화학 물질에서 비롯 된 대신 안정화 효과의 지표 버퍼 분자의 특징입니다.
다른 일반적으로 생물학적으로 호환 버퍼 시스템 함께 좋은 버퍼17,,1819 의 몇 가지를 사용 하 여 공식화, pH 화면에 버퍼 분자의 화학 효과 deconvolute 하도록 설계 결과 솔루션의 실제 pH에서 단백질 안정성. 각 버퍼 시스템에 대 한 세 가지 pH 값을 제공 하 고 pH 값 중복 서로 다른 시스템 간의 통합, 유리한 pH 값 및 대상 단백질에 대 한 유리한 버퍼 시스템 pH 화면 식별할 수 있습니다.
소금 스크린은 일반적으로 chaotropes, chelants, 중 금속 및 감소 시키는 대리인으로 실험실 소금 포함 되어 있습니다. 화면 높은 이온 힘을 가진 환경에 단백질 샘플의 선호도 대 한 일반적인 표시를 줄 수 있지만 화합물의 각 하위 그룹 또한 단백질의 잠재적인 구조에 정보를 제공할 수 있습니다. 예를 들어 크게 불안정 한 단백질 chelant 샘플 내에서 중요 한 구조상 금속을 나타내는 수 있습니다. 샘플 화면 내에서 금속 양이온에 의해 안정화도 강력 하 게 하는 경우이 추가 구조 실험에 대 한 유망한 출발점을 제공할 수 있습니다.
Osmolytes는 그들의 환경의 삼 투 속성에 영향을 주는 수용 성 화합물. 실제로, 그들은 무질서 단백질의 폴딩 및 스트레스 조건20,,2122에 특히 그들, 안정화 "화학 보호자"로 사용할 수 있습니다. 이러한 특성을 그들 매력적인 첨가제 단백질 결정학; 크리스탈 수확 하는 동안 cryoprotectants로 사용할 수, 장착 및 스토리지23을처리 합니다. Osmolytes의 잠재적인 사용은 또한 단백질의 정화를 확장합니다. 대장균 에서 표현 하는 재조합 형 단백질의 상당한 비율이 불용 성 고 표준 정화 방법을 사용 하 여 원래 상태에 복구 하기 어려운 될 수 있습니다. Osmolytes 안정화 및 불용 성 분수에서 단백질 회수를 사용할 수 있습니다, 그리고 증가 정화 수익률24.
Osmolyte 화면 설립된 화합물에 단백질 데이터 은행 항목25 및 Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated 경로 (DEOP)26 데이터베이스를 사용 하 여 설계 되었습니다 하 고 반복적으로 표준 단백질을 사용 하 여 최적화 된. 화면 osmolyte의 약 8 하위 만들어집니다: 글리세롤, 설탕과 폴리올, 비 세제 sulfobetaines (NDSBs), betaines 및 그들의 아날로그 organophosphates, dipeptides, 아미노산와 그들의 유도체 및 최종 기타 그룹. 여러 농도 용 해도 비교에 대 한 효과적인 농도 범위에 따라 각 osmolyte가 있습니다.
Protocol
1입니다. 단백질 샘플 준비
- 96 잘 블록에 500 µ L aliquots로 안정성 화면을 공식화 하 고 스토리지에 대 한 인감. (그림 4)시간을 절약할 수 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시의 해당 안정성 화면의 각 조건의 10 µ L를 전송 합니다.
- 적절 한 버퍼 시스템에는 약 1 밀리 그램 mL-1 단백질 해결책의 1 mL를 준비 합니다. 적절 한 버퍼의 구성은 각 단백질 샘플 따라 다르지만, 시도 하는 좋은 첫 번째 버퍼 10 m m 100 mm NaCl, pH 7.2 인산 나트륨 이다.
참고: 허용 가능한 단백질 농도-의해-경우, 다르지만 0.5-5 mg mL-1 의 농도 범위는 일반적으로 analyzable 커브를 생성 합니다. 희석 버퍼 각 조건의 효과 마스킹 하지 않으려면 안정성 스크린과 함께 사용 하기 위해 권장 됩니다. 일반적인 버퍼 구성 약 100 m m NaCl 약 10 mM 버퍼입니다. - TSA 실험을 수행 하는 경우 20 x의 최종 농도에 단백질 샘플을 SYPRO 오렌지 염료를 추가 합니다. 반전 또는 개요 vortexing에 의해 혼합.
- 준비 단계 1.1 (그림 4B)에서 96 잘 접시의 각 음에 단백질 해결책의 10 µ L를 전송 합니다.
- 봉인 하 고 원심 600 x g 단백질 샘플 및 화면 구성 요소 (그림 4C) 혼합 되도록 2 분에 대 한 96 잘 접시.
- 다시 seal 안정성 화면 깊은 우물 블록 하 고 최대 4 개월까지 4 ° C에서 화면을 저장 합니다. 일부 구성 요소는 감광 어둠 속에서 소금 화면을 저장 합니다.
- NanoDSF 실험을 수행 하는 경우 2 단계로 계속 합니다. TSA 실험을 수행 하는 경우 4 단계로 건너뜁니다.
2. nanoDSF 실험 준비
- 장비 샘플 랙 근처 먼지에 특히 주의 지불 하는 깨끗 한 있는지 확인 합니다. 시스템에 있는 경우 backscattering 거울, 에탄올과 보풀 티슈를 사용 하 여 그것을 청소.
- 오픈 서랍 버튼을 눌러 샘플 서랍을 엽니다. (그림 5A).
- 솔루션으로 모 세관의 한쪽 끝을 감동 하 여 96 잘 접시의 각 우물에서 약 10 µ L로 모세 혈관 로드 다음 샘플 랙 (그림 5B)의 해당 모 세관 소유자에 그들을 배치 합니다. 지문, 등은 모세 혈관의 중간을 오염 하지 않도록 주의 하십시오.이 실험을 통해 형광 신호를 방해할 수로.
- 마그네틱 씰링 스트립 (그림 5C) 모세 혈관 무력화
3. 프로그래밍 nanoDSF 실험
- 위치와 강도 증가 검색 검색 탭에서 검색 검색 시작 버튼을 누르면 각 모 세관의 검색 또는 감소까지 10%의 초기 전원에서 사고 여기 강도 예비 검사를 시작 합니다 모든 모 세관 검사의 피크는 4000-12000 단위 (그림 5D) 사이입니다.
- 샘플 접혀 이며 충분히 집중 되도록 가파른 온도 기울기와 초기 용융 검사 것이 좋습니다. 녹는 스캔 탭에서 녹아 7.0 ° C 분-1, 시작 온도 25 ° c와 최종 온도 95 ℃, 온도 기울기 옵션 설정 하 여 검색 다음은 nanoDSF를 실행 하는 프로그램은 를 눌러 실험 녹는 시작 버튼. 녹아 그 결과 곡선 표시 감지 곡점, 추가 샘플을 집중 또는 단백질 제대로 접혀 경우 검사를 고려 하십시오.
- 2.1-2.4 전체 실험에 대 한 샘플 준비 단계를 반복 합니다.
- 녹는 스캔 탭에서 눌러 녹아 1.0 ° C 분-1, 시작 온도 25 ° c와 최종 온도 95 ℃, 온도 기울기 옵션 설정 하 여 검색 다음은 nanoDSF를 실행 프로그램 실험 녹는 시작 버튼입니다.
4. TSA 실험 수행
- 윈도우의 오른쪽에 들여쓰기를 단단히 눌러 샘플 서랍을 엽니다. 다시 왼쪽 (그림 4D) 잘 a 1으로 RT-PCR 시스템에 96-잘 트레이 놓습니다.
- TSA 실험 설정을 시작 하려면 새로운 실험 버튼을 클릭 합니다.
- 실험 속성 탭에서 때 녹아 커브 옵션을 클릭 실험의 어떤 종류를 설정 하려면 원하는? 와 다른 옵션 때 는 시 약 검색 대상 시퀀스를 사용 하 여 원하는?
- 에 플레이트 설치 / 정의 목표와 샘플 탭, 대상의 이름을 입력 한 다음 기자 를 이용한 및 끄 는 None으로 설정.
- 에 플레이트 설치 대상 및 샘플 할당 / 탭을 이전 단계에서 입력 한 대상 이름에 96 잘 접시의 모든 잘 할당. 같은 탭에서 None으로 수동 참조로 사용 하 여 염료를 선택 을 설정 합니다.
- 실행 방법 탭에서 때까지 총 3 단계를 삭제 합니다. 시간 00:05; 25.0 ℃, 램프 비율 100%, 첫 번째 단계를 설정 95.0 ℃, 램프 속도 1%, 두 번째 단계 시간 01:00; 95.0 ℃, 램프 비율 100%, 제 3 단계 시간 00시 05분. 수집 데이터 드롭다운 메뉴를 사용 하 여 데이터를 수집 하도록 선택 하거나 데이터 컬렉션 아이콘 (그림 6).
- 20 µ L을 잘 당 반응 볼륨 을 설정 합니다.
- TSA 실험을 시작 하려면 실행 시작 버튼을 누릅니다.
5. 데이터 분석
- 파장으로 용융 곡선을 플롯을 선택 합니다. NanoDSF 실험, 330에 형광 강렬의 비율 및 350 nm (비 극성 및 극 지 환경에서 트립토판 각각 해당)13 일반적으로 사용 됩니다. 대부분 TSAs 염료 방출 최대는 용융 곡선 그래프에 적합 (SYPRO 오렌지의 방출 최대는 569 nm)12.
- 각 용융 곡선의 굴절 포인트를 확인 하 여 각 조건의 Tm 값을 계산 합니다. 대부분의 nanoDSF 시스템은 자동으로 데이터 수집 후 용융 곡선의 숫자 차별화 하 여 Tm 값을 계산합니다. 데이터 분석 및 다운스트림 처리는 heatmap 요약 Tm 을 생산 하는 옵션을 주는 나 미11 등, 무료, 대체 GUI 기반 소프트웨어 자동화할 수 있는 경우 사용 하는 소프트웨어는 자동으로 Tm 값을 계산 하지 않습니다, 전체에 대 한 값 (동반 기준 지침 및 리소스 데이터 처리를 제공 합니다 나 미와) 96-잘 실험.
- 조사는 모든 조건의 Tm 값을 비교 합니다. 안정성 화면 각 화면 (a 1과 A2)에 물만을 포함 하는 두 개의 우물을 포함 되어 있습니다. 벤치 마크로 서 물 전용 값을 가져와 δ Tm 값, 체계적인 오류를 해결 하 고 안정화 효과의 쉬운 비교를 허용의 계산을 허용 한다. Tm 값이 높을수록 하류 사용 하기 위해 권장 되는 열 안정화 조건을 나타냅니다. 유망한 조건 종종 그들의 안정화에 농도 의존을 보여줍니다.
Representative Results
Lysozyme 안정성 스크린으로 분석 했다 고 단백질 X, 바이러스 X 프로젝트에서 대상 단백질 osmolyte 화면으로 분석 했다. 일반적으로 생산 하는 두 단백질 녹여 TSA와 nanoDSF 실험 (참조 대표 곡선에 대 한 수치를 동반)에 명확 하 게 정의 된 변성 전환 곡선. 경우에는 몇 가지 샘플을 정의 된 변성 전환으로 해석할 커브를 생성 하지 않았다 변성 및에 포함 되지 않은 Tm 비교로 해석 되었다.
그림 7 열 stabilising 속성 lysozyme 향해 염화 암모늄의 예증 소금 화면에서 예제 결과 보여 줍니다. 위에 표시 된 것과 같은 농도 종속성 종종 유망한 조건의 표시 하지만 열 안정화에서 일반적으로 발생 하는 경우를 볼 몇 가지 다른 소금 이온 농도 증가의 결과 비교 하는 것이 유용할 수 있다는 버퍼 이온 강도에 증가 또는 추가 안정성 특정 이온의 존재에 수 여 하는 경우.
전화 화면 (그림 8)와 lysozyme의 Tm 값의 비교 두 가지를 정보를 보여준다. 첫째, pH 값을 감소와 안정성을 증가의 일반적인 추세가입니다. 둘째, 동일한 pH 값을 가진 서로 다른 버퍼 시스템을 사용 하 여 얻은 범위의 Tm 값은 중요 한 수 있습니다.
그림 8에서 데이터 제안 TSA와이 실험에서 nanoDSF 사이의 합의 일반적으로 좋은, 하지만 nanoDSF 보여줍니다 약간 높은 Tm 값을 식별 하는 경향이 TSA 보다 약간 더 큰 Tm 이동. 그러나, 8.5 위의 pH 값으로 어떤 우물 TSA와 nanoDSF에서 가져온 Tm 값 사이의 큰 차이 보여줍니다. 차이 다른 pH 값, 단백질의 변성을 잠재적으로 표시 될 수 수 있습니다. 예를 들어 hydrophobicity에 민감한 염료는 비교적 낮은 Tm 읽기 경우 단백질의 소수 성 영역 될 노출 용 매에 트립토판 잔류물 변화 환경 보다 훨씬 더 빨리 극성에 줄 수 있습니다.
그림 9 heatmap lysozyme osmolyte 화면을 사용 하 여 얻은 Tm 값을 보여 줍니다. 조건 제어 웰 스 (웰 스 a 1과 A2, 이온된 물 포함)에 비해 높은 Tm 증가와 진한 파란색 색깔은. 그림 9 에서 확인 된 특히 안정화 조건에는 글리세롤, 1 M D-솔 비 톨, 100 m m hypotaurine과 10mm Ala Gly (우물 A4 A6, A9, E7, F8, 각각) 포함 됩니다.
그림 10 heatmap 단백질 X. TSA와 가져온 Tm 값의 표시 및 Osmolyte 스크린 nanoDSF 실험 공개 osmolytes 테스트의 대부분 Tm (1 ° C) 이내에 어느 사소한 증가 게 또는 해로운 영향 에 단백질의 안정성. 특히, 10 mM (잘 D1)의 농도에 dipicolinic 산 변성 실 온에서 샘플을 나타납니다. TSA와 nanoDSF 결과 신속 하 게 단백질을 작업할 때 피해 야 하는 단백질 X에 대 한 호환 되지 않는 첨가물으로 dipicolinic 산을 식별 합니다. D-솔 비 톨의 arabinose (웰 스 A9 및 B9, 1 M에) 그럼에도 불구 하 고, 높은 농도 글리세롤와 TMAO (우물 A4 A6 및 E1, 각각) 열 안정화로 확인 되었다.
Lysozyme에 대 한 각 안정성 화면에서 가장 높은 Tm 값을 항복 조건의 조합 시너지 결합된 효과 대 한 조사를 테스트 했다. 그림 11 에서는 일반적인 증가 Tm 값 버퍼 시스템의 더 많은 구성 요소 (pH, 소금, osmolyte) 추가 됩니다. MES, 암모늄 염, D-솔 비 톨, 경우 Tm 10 ° C 관찰 될 수 있다 때 모든 구성 요소가 MES 혼자에 비해 큰 증가. 그림 11 개별 구성 요소는 버퍼의 최적화와 안정성 화면 함께 때 눈에 띄는 시너지 효과 발생할 수 있습니다 보여줍니다.
보다 일반적인 메모에서 그림 11 은 또한 TSA와 nanoDSF에서 실험 관찰 될 수 있다 δ Tm 값의 크기를 보여 줍니다. Δ Tm 달성의 크기 크게 단백질 시스템에 따라 다르지만 주위와 5 ° C 이상 δ Tm 값은 종종 도움이 안정화 효과 나타내는.
그림 1 : Bioprospecting. 바이러스-X 프로젝트에서 극단적인 환경에서 샘플 컬렉션입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: TSA 회로도. TSA 실험에서 얻은 전형적인 용융 곡선의 주석이 추가 된 예제. 이 커브는 고전적인 "2-상태" 단백질 전개의 특성, 감지 부분적으로 접혀 중간체 없이 변성 접혀 샘플 모집단에서 전환. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 안정성 워크플로 화면. 안정성 스크린을 사용 하 여 버퍼 최적화의 표준 워크플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : TSA 안정성 화면 실험 표준의 워크플로. 왼쪽에서 오른쪽: 96 잘 접시에 안정성 스크린의 Pipetting aliquots (A). (B) pipetting 접시에 형광 염료와 단백질 견본. (C) 원심 분리 하기 전에 접시를 바다 표범 어업. (D) RT-PCR 시스템에 접시를 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 표준 nanoDSF 실험의 워크플로. (A) 모 세관 랙 로드 여. (B) 선반에는 모세 혈관을 로드. (C) immobilizing 마그네틱 씰링 스트립 모세 혈관. (D) 실험 프로그래밍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : RT-PCR 시스템에 대 한 사용자 인터페이스. TSA 실험 프로그래밍 되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : 화면 샘플 데이터를 소금. (A) lysozyme과 라벨 무료 nanoDSF 실험에 대 한 350 nm 대 330 nm에 형광 강렬의 비율. 샘플 소금 화면 (1.5 M-염화 암모늄 0.2 M)의 C7 C12 우물에 해당합니다. 각 조건에 대해 계산 된 Tm 값은 줄거리에 겹쳐 있다. (Tm 값의 요약 B) 그림 7A에서 제공 된 데이터에서 계산. (C) 형광 강렬에서 590 nm lysozyme hydrophobicity에 민감한 기자 염료를 사용 하 여 TSA 실험에 대 한. 그림 7A, 처럼 샘플 소금 스크린의 C7 C12 우물에 해당합니다. 계산 된 Tm 값은 그래프에 겹쳐 있다. (D) Tm 값의 요약 데이터 그림 7C에 계산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 8: 전화 화면 샘플 데이터. 로 얻은 lysozyme 및 pH 화면 Tm 교대의 요약. 각 포인트는 독립적인 상태를 나타냅니다. 포인트 같은 pH 값에서 동일한 pH에 다른 버퍼 시스템입니다. Tm 교대 TSA 실험 68.0 ° C와 nanoDSF 실험 71.9 ° C의 제어 Tm 를 기준으로 계산 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 9 : Osmolyte 화면 샘플 데이터 (lysozyme). Tm 값 lysozyme와 osmolyte 화면의 각 잘 레이블 무료 nanoDSF 실험에서 얻은의 요약. Tm 값 (° C) 물 컨트롤을 포함 하는 우물 a 1과 a 2에 비교 됩니다. 히트 맵 비교 하는 δ Tm 값에 따라 생성 된 (블루 나타냅니다 Tm 증가 레드 Tm 감소). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 10: Osmolyte 화면 샘플 데이터 (단백질 X). (A) 단백질 X와 osmolyte 화면 라벨 무료 nanoDSF 실험에서 얻은 Tm 값의 요약. Tm 값은 웰 스에 a 1과 A2 물 컨트롤을 포함 하는 비교 됩니다. 히트 맵 비교 하는 δ Tm 값에 따라 생성 된 (블루 나타냅니다 Tm 증가 레드 Tm 감소). (B) nanoDSF 곡선 잘 A9에서 얻은 (1 M D-솔 비 톨, 안정화 조건) 및 D1 (10 mM dipicolinic 산, 불안정 상태). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 11 : Tm에 최적화 효과 버퍼. TSA Tm 값 lysozyme의 Tm에 가장 큰 증가 받으면 각 화면의 조건와 결합. 100 mM 아세트산, pH 4.2, 및 100 mM MES, pH 5.6, 1.5 M 염화 황산 염 소금으로 함께 버퍼 시스템으로 선정 됐다. Osmolyte 농도 osmolyte 화면에 동일 했다: 10mm Ala-Gly, 1 M D-솔 비 톨, 50 m L-리 신 m와 100 m m hypotaurine. 오차 막대는 6 개의 복제의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 분자 | PDB 코드 | 공동 띠는의 주파수 |
| 인산 염 | PO4 | 5132 |
| 아세테이트 | 법 | 4521 |
| 2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonic 산 (MES) | MES | 1334 |
| 트리 스 (hydroxymethyl) aminomethane (트리 스) | TRS | 1155 |
| 편대 | FMT | 1072 |
표 1: 단백질 데이터 은행 (PDB) 항목에서 버퍼 분자 공동 화 주파수의 요약. PDBsum16 144,868 항목 (12 년 5 월 18 일 현재로 정확한)의 총에서 통해 얻은 데이터입니다.
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Discussion
프로토콜 내에서 중요 한 측면에는 원심 분리 단계 및 TSA 실험 (단계 1.5)에 대 한 96 잘 접시의 적절 한 씰링 포함 됩니다. 원심 분리 하면 단백질 샘플 화면 상태 접촉 및 혼합. 또한, 봉인 되지 않은 접시 사용 하는 경우 TSA 실험에 대 한 실험을 통해 증발, 샘플 농도 있는 증가 일으키는 원인이 되 고 조 단백질 집단의 기회를 증가 하는 용 매에 상당한 위험이 있다.
TSAs와 nanoDSF는 의무가 다양 한 단백질 견본; 샘플의 대부분 hydrophobicity 기반 기자 염료 또는 염료 무료 nanoDSF 해석할 용융 곡선을 생성할 수 있습니다. 만약 표준 형광 소스 단백질에 적합 하지 않습니다, 탐구 될 수 있는 프로토콜에 대 한 간단한 수정 fluorophore의 선택입니다. 여러 대체 염료 TSA 실험에 적합 될 수 있습니다. 예로 N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM)는, thiol27, 및 4-반응 후 fluoresces 화합물 (dicyanovinyl) julolidine (DCVJ)를 기반으로 하는 형광 화합물은 환경, 그것의 형광 단백질 샘플으로 증가의 강성 펼쳐져28,29 (후자 염료는 종종 샘플의 높은 농도 필요).
용융 곡선 분석의 다른 방법 Tm 은 악기 소프트웨어에 의해 자동으로 계산 되지 않습니다 사용할 수 있습니다. 데이터는 동종을 하나만 변성 단계는 용융 곡선에서 잘린된 데이터 집합 다음 방정식으로 sigmoid 볼츠만에 맞을 수 있다:
온도 T에서의 형광 강도, F분 및최대 F F가 전에 형광 강렬 이며 변성 전환 후 각각 Tm 변성 전환 및 C의 중간점 온도 Tm에서 비탈길이 이다. 이 방법은 잘 간단한 2 단계 변성 과정, 하는 동안 복잡 한 용융 곡선 여러 전환 위해 적당 하다.
TSA의 주요 장점 중 하나는 접근; TSA 실험 고용 형광 염료에 대 한 적합 한 파장에서 필터 어떤 RT-PCR 시스템에서 수행할 수 있습니다. 이 소모품, 작업과 확인 TSA 프로젝트 비늘, 모두 업계와 학계에서의 광범위 한 귀중 한 기술, 필요한 단백질의 상대적으로 낮은 금액의 용이성의 저렴 한 비용으로 결합.
유리한 버퍼 상태를 나타내는 뿐만 아니라 화면 샘플 단백질 내의 구조 금속의 존재에 단서를 제공할 수 있습니다 일부 우물을 포함 되어 있습니다. 소금 화면에 특히 관심이 있을 수 있습니다 웰 스는 G6 G7, 5 mM EDTA 및 EGTA, 5mm를 각각 포함 하는. 이 우물에 상당한 열 불안은 chelants에 의해 분리 된 단백질에서 중요 한 금속 이온의 표시 될 수 있습니다. Osmolyte 화면 내에서 화합물 또한 잠재적으로 단백질의 기능에 단서를 제공할 수 있습니다. 화면에서 화합물의 많은 효소의 일반적인 기질 분자의 클래스에 속합니다. 예를 들어 lysozyme 대 saccharides (우물 A11-B10에에서 존재)에서 제공 하는 일반적인 안정화 효소, N-acetylglucosamine 올리고30의 설립된 기판에 그들의 구조적 유사성을 표시 될 수 있습니다.
위에서 설명한 TSA와 nanoDSF 프로토콜 또한 단백질-리간드 상호작용 연구에 적용할 수 있습니다. 단백질에 특히 묶는 ligands는 단지 내에 새로운 상호 작용을 도입 하 여 그것의 열 안정성을 높일 수 있습니다. 복용량-의존 긍정적인 변화 단백질 Tm 에 성공적인 단백질-ligand 상호 작용의 유망한 표시 이다. 속도, 처리량 및 낮은 비용 심사 TSAs 화합물 라이브러리의 했다 그것은 매우 인기 있는 방법을 초기 단계 약물 발견에.
대상 단백질 그리고 그들의 ligand 복합물의 버퍼 조건 최적화 될 수 있습니다 프로젝트의 성공을 위해 필수적인 많은 문학 예31,32,,3334를 보여 줍니다. 설치 시간 포함 2 시간 미만 복용 하는 일반적인 분석 결과 함께 TSAs 및 nanoDSF 안정성 화면 함께 버퍼 최적화를 위한 빠르고, 저렴 한 기술을 나타냅니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 프로젝트는 유럽 연합의 수평선 2020 연구와 혁신 프로그램 (보조금 계약 n ° 685778) 유럽 연구 회의 (ERC)에서 자금을 받았다. 이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회에 의해 지원 되었다 (BBSRC, 부여 번호 BB/M011186/1, BB/J014516/1). DB는 BBSRC 박사 교육 파트너십 뉴캐슬-리버풀-더 럼은 재학에 대 한 더 럼 대학 부의 생물 과학이이 자금으로 기여에 대 한 감사. 우리는 그의 도움에 대 한이 안 에드워즈와 더 럼 대학 부의 화학 질량 분석 학과 그들의 경 음악 분석을 위한 단백질 X 감사합니다. 우리는 대출 하 고이 프로젝트에 대 한 프로 메 테우 스 NT.48 시스템 지원에 대 한 바이러스-X 프로젝트, 그리고 클레어 Hatty를 NanoTemper GmbH에 또한 감사와 그의 작품에 대 한 Arnthor Ævarsson에 감사. 마지막으로, 감사 합니다 프랜시스 Gawthrop 하 Tozer 씨앗 BBSRC 회 어워드의 일환으로 그들의 지원에 대 한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lysozyme | Melford Laboratories | L38100 | Crystallised and lyophilised chicken egg white lysozyme. |
| The Durham pH Screen | Molecular Dimensions | MD1-101 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
| The Durham Salt Screen | Molecular Dimensions | MD1-102 | 96-well protein stability screen. See above for contents. |
| The Durham Osmolyte Screen | Various | #N/A | 96-well protein stability screen, not commercially available at the time of publication. See above for contents. |
| SYPRO Orange | Invitrogen | S6651 | Widely used fluorescent dye for protein staining in gels and DSF. |
| 96-well PCR Plate | Starlab | 1403-7700 | Semi-skirted clear plastic for use with AB 7500 Fast RT-PCR System. |
| 7500 Fast Real-time PCR System | Applied Biosystems | 4362143 | 96-well format RT-PCR system. Alternative systems can be used. Analysis of data performed using free, open-access software NAMI. AB software tailored to DSF experiments using the 7500 Fast available at additional cost. |
| Prometheus NT.48 | NanoTemper Technologies | #N/A | Label-free DSF system with up to 48-sample capacity. Can calculate unfolding temperatures (Tm and Tonset), critical denaturant concentrations (Cm), free folding energy (ΔG and ΔΔG), and aggregation results (Tagg) using built-in software. |
| Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries | NanoTemper Technologies | PR-C002 | Prometheus NT.48 Series nanoDSF Grade Standard Capillaries. "High sensitivity" variants are available at a higher cost for use with low-concentration samples (<200 µg ml-1). |
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