Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול לחקור את ההשפעה של הביטול של גנים הקשורים הטעימה על תגובות חיסוניות נתרן גופרתי לתוספי (DSS)-induced מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי) מחלת העכבר מודל.
Abstract
מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי) הוא אחד הקשורים החיסון בהפרעות עיכול, לרבות קוליטיס ומחלת קרוהן, זה משפיע על איכות החיים של מיליוני אנשים ברחבי העולם. מחלת המעי הדלקתי תסמינים כוללים כאבי בטן, שלשול, דימום רקטלי, אשר עלולים להיגרם כתוצאה האינטראקציות בין הבטן microbiota, רכיבי מזון, תאי אפיתל המעי, תאים חיסוניים. זה חשיבות מיוחדת כדי להעריך כיצד כל אחד הגנים המרכזיים מבוטא בתאי אפיתל ואת המערכת החיסונית משפיעה על דלקת במעי הגס. G-חלבון בשילוב הטעם קולטנים, כולל יחידת משנה חלבון G α-gustducin וחלבונים איתות אחרים, נמצאו במעיים. כאן, אנו משתמשים α-gustducin כנציג. ומתארות נתרן גופרתי (DSS) לתוספי-המושרה מחלת המעי הדלקתי דגם כדי להעריך את ההשפעה של מוטציות הטעם על חסינות הרירית בטן ודלקת. שיטה זו משלבת טכנולוגיה נוקאאוט גנטי עם המודל מחלת המעי הדלקתי המושרה מבחינה כימית, ובכך יכול להיות מיושם כדי להעריך את התוצאה של ג'ין הטעם שהביטול, כמו גם אחרות הגנים exuberate או לצנן את התגובה החיסונית DSS-induced במעי הגס. עכברים מוטנטים המנוהלים באמצעות DSS במשך תקופה מסוימת שבמהלכה שלהם משקל הגוף בצואה, דימום רקטלי נמצאים תחת פיקוח והקליט. ב timepoints שונים במהלך ניהול, עכברים מורדמים, מידות ומשקולות של טחולים שלהם נקודתיים נמדדים ואז בטן רקמות נאספים וכוח מעובד עבור היסטולוגית וניתוחים ביטוי גנים. הנתונים מראים כי התוצאות נוקאאוט α-gustducin מוגזמת במשקל, שלשול, דימום פנימי, נזק לרקמות, ועכברים דלקת לעומת פראי-סוג. מאז חומרת דלקת המושרה מושפע העכבר זנים סביבת מגורים, תזונה, אופטימיזציה של DSS משך ריכוז וניהול טייס ניסוי חשוב במיוחד. על-ידי התאמת גורמים אלה, בשיטה זו ניתן להחיל כדי להעריך את שני אפקטים אנטי, פרו-דלקתיים.
Introduction
בשתי הצורות הגדולות של מחלות מעי דלקתיות (מחלת המעי הדלקתי), מחלת קרוהן (CD) ו קוליטיס (UC) מאופיינים remittent או מתקדמת התנאים דלקתית כרונית של המעי עם אטיולוגיה multifactorial1,2 . ההתפתחות של מחלת המעי הדלקתי תלוי גנטי וכן מסוימים גורמים סביבתיים כגון: תזונה, שימוש באנטיביוטיקה, חשוב, זיהומים פתוגניים. עם זאת, אטיולוגיה של הרגולציה המנגנונים המולקולריים שבבסיס מחלת המעי הדלקתי עדיין אינם ברורים. לפיכך, רבים כימית המושרה מחלת המעי הדלקתי מודלים בעלי חיים יש כבר נבנה ומוחלים ניסחו את פתוגנזה ואת מנגנוני הרגולציה ולהעריך את האפקטיביות של אדם הרפוי3.
קולטני טעם G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs), מסווגים לשני סוגים עיקריים: מסוג I (T1Rs), ו II (T2Rs) המאתרות מתוק, של אמאמי ותרכובות מרירה. לטעום איתות cascades מבוצעים על ידי איגוד tastant T1Rs או T2Rs, מפעיל את heterotrimeric חלבוני G המורכב α-gustducin ו דיימר Gβγ ולהוביל אל-שחרור subunits Gβγ. Moiety Gβγ בתורו מגרה את הזרם אפקטור האנזים phospholipase C-β2 (PLC-β2). בקר לוגי מיתכנת מופעל-β2 ואז הידרוליזה phosphatidylinositol-4.5-bisphosphate לתוך שני שליחים משניים תאיים [אינוזיטול-1,4,5-טריפוספט (IP3) ו- diacylglycerol], ואת ה-IP3 איגודים כדי לפתוח את ה-IP ערוץ קולטן3 R3, משחרר יוני הסידן מן רשתית תוך-פלזמית. זה מוביל בסופו של דבר את הפתיחה של תעלת יונים פוטנציאלי קולטן ארעי, Trpm5 ואת שחרורו של הנוירוטרנסמיטר מ- ATP על העצבים הטעם4,5,6,7. ובכל זאת, המסלולים איתות של טעם מלוח, חמוץ הם שונים ועצמאית מתוק, של אמאמי, טעם מריר8. בנוסף, מרכיבי טעם GPCRs וחלבונים במורד הזרם קיימים ברקמות שונות אקסטרה אוראלי. מחקרים שנעשו לאחרונה הצביעו α-gustducin הזה, המרכיב העיקרי של טעם איתות, נמצא להתבטא רירית המעי. מחקרים נוספים נדרשים להבין את הפונקציות של אלה טעם איתות רכיבים רקמות הפה במיוחד9,10.
השיטה המתוארת כאן נעשה שימוש כדי לאפיין פונקציות של החלבונים איתות הטעם לידי ביטוי רקמות הפה במיוחד. אנו משלבים קו העכבר הטרנסגניים שפותחו עבור בהתוויית מפלים איתות-בלוטות הטעם עם המודל קוליטיס כימית המושרה. במידה רבה בשל שלה פשטות פרוצדורלי פתולוגיים דמיון אנושי קוליטיס, לתוספי חומצה גופרתית נתרן (DSS)-מודל מחלת המעי הדלקתי המושרה כבר בשימוש נרחב ביותר בין ה מודלים שונים מבחינה כימית המושרה קוליטיס11. במחקר זה, השתמשנו חשוכת-α-gustducin עכברים כקו נציג העכבר כדי לחשוף את פונקציות הרומן של α-gustducin חסינות הרירית בטן ודלקת ע י 1) ניתוח שינויים מורפולוגיים ברקמה 2) assaying הבדלים בביטוי של ציטוקינים הקשורים לדלקת במעי הגס. בשיטה זו ניתן להשתמש באופן כמותי ובאופיו לקבוע את התרומות של חלבוני איתות הטעם (וגם לחלבונים אחרים הביעו בבטן) נזק לרקמות, דלקת מעיים, כאשר העכבר מהונדסים קווים על הגנים של הריבית הינם זמינים. היתרונות של שיטה זו הם המאפשר למשתמשים לקבל נתונים משולב הנובע פעולות הן כימי DSS ועל מחסור של הגן עניין. בשיטה זו ניתן לשפר עוד יותר כדי להגביר את הרגישות שלה לחשוף שינויים עדינים מעיים ברמות תאית ומולקולרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים מעורבים עכברים היו שנסקרו, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדות שימוש אוניברסיטה של ג'ה-ג'יאנג. מומלץ ללבוש ציוד מגן אישי המתאים לפני ביצוע פרוטוקול זה.
1. הכנת DSS ועכברים
- לשמור את עכברים knockout (α-gustducin- / -), גיל, מגדר- ושליטה הגוף מתאימים-משקל פראי-סוג (α-gustducin+ +) עכברים C57BL/6 בנפרד בכלובים נקי.
הערה: עכברים knockout backcrossed עם C57BL/6 עכברים במשך יותר מ 20 דורות ויש של כמעט 100% C57BL/6 הרקע הגנטי. - לפזר 30 גר' לתוספי סולפט נתרן (DSS) אבקה ב- 1 ליטר של מים בלוק. מערבבים עד הפתרון מתברר כדי להבטיח הריכוז בעבודה הסופית 3% (w/v).
הערה: הפתרון DSS ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר עד 1 לשבוע או ב 4 ° C עד השימוש.
2. אינדוקציה והערכה של DSS קוליטיס בעכברים
- שוקל והקלטה של עכבר כל משקל הגוף הראשונית. לחוד העכברים לתוך הכלובים פלסטיק סטנדרטי ויסמנו את הכלובים.
- החלף רגיל לשתות מים עם 3% DSS פתרון עבור סכום כולל של 7 ימים שאליו יש שתי קבוצות של עכברים לגשת ad libitum.
- למדוד את משקל הגוף של העכבר, להקליט DSS פתרון הצריכה, ו לאסוף ולבחון הצואה של העכבר בכל מדי יום במהלך הממשל DSS. שים לב לחומרת השלשול דימום רקטלי ולהמיר זה אינדקס מחלות DSS-induced12.
- במהלך הניסוי, האחוז של אובדן משקל לעומת משקל הראשוני, את אינדקס מחלות מחושבים כדי להעריך את הסימפטומים של קוליטיס כיבית.
הערה: מדד המחלה הוא הבקיע על ידי שילוב של תצפיות של שלשול, דימום רקטלי, מוגדרים כדלקמן: 0 (צואה רגילה, אין דם), 1 (צואה רכה, אין דם), 2 (צואה רכה, מעט דם), 3 (צואה רכה מאוד, דימום צנוע), ו- 4 (צואה מימית, דימום משמעותי)12. מדד המחלה הוא ניתח מדי יום עבור כל עכבר. - בסוף הטיפול DSS 7 ימים, להקריב את העכברים מאת נקע בצוואר הרחם והמשך עם הניסויים הנותרים.
3. הכנת דגימות רקמה
- הנח את העכבר במצב פרקדן, לנקות את העור של הבטן עם 70% אתנול. עושים חתך 3 ס מ באורך קו האמצע בבטן עם זוג מספריים קטנות כדי לחשוף את חלל הבטן.
- השתמש זוג מלקחיים בקפידה להפריד הטחול רקמות אחרות, ולאחר מכן להסיר את הטחול ולמדוד את גודלו.
- לזהות, הרם המעי הגס עם מלקחיים, להפריד אותו מצע המעי שמסביב. משוך החוצה את כל המעי הגס עד המעי האטום ופי הטבעת גלויים.
- לבודד את המעי הגס על ידי transecting זה השוליים colonocecal, עמוק בתוך האגן כדי לשחרר לקרע, הנקודתיים, בהתאמה. לאחר מכן, למדוד, תעדו את מימדיו של המעי הגס מבודד. יש להיזהר לא לגרום נזק לרקמת המעי הגס במהלך ההליך ויבתר.
- ריקון המעי הגס עם 10 מ ל תמיסת מלח קרה כקרח באגירה פוספט (PBS) בעזרת מזרק 10 מ ל מצויד עם מחט gavage להסיר את צואה ודם עד eluate נקי לחלוטין.
- עבור זיהוי היסטולוגית, לחלק את דגימות רקמה באופן שווה לשלושה חלקים: צינתור, האמצעי ו דיסטלי. . אז, את הרקמה עם 4% paraformaldehyde (PFA) בן לילה ב 4 º C.
- לניתוח של ביטוי ציטוקינים, להקפיא את המעי הגס כולו במהירות עם חנקן נוזלי, לאחסן אותו ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
4. היסטולוגית הערכת חומרת קוליטיס DSS-induced
- Hematoxylin ואאוזין (H & E) מכתים
- לאחר קיבוע, להטביע הרקמה בפתרון של 30% סוכרוז ב- PBS 1 x לילה בשפופרת 15 מ"ל כדי cryoprotect את הדגימות.
- להטביע את הרקמה טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) מתחם ולמקם אותו ב-20 ° C עד מחזק את ה-OCT.
- העברת הרחוב OCT המכיל רקמות cryostat, להגדיר חיוג עובי cryostat 12 מיקרומטר, פרוסה ולאסוף מיקרומטר בעובי 12 חלקים קפואים.
- מחממים את הסעיפים רקמות שנאספו מ- cryostat-65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות על פלטה חמה.
- לשטוף את המקטעים בקצרה במים מזוקקים. תכתים אותם עם hematoxylin מכתים פתרון עבור 5 דקות ולשטוף לאחר מכן עם הפעלת ברז מים במשך 5 דקות.
- להבדיל בין הסעיפים עם 0.5% חומצה הידרוכלורית-אתנול עבור 30 s ולשטוף אותם ריצה הקש מים 1 דקות. לאחר מכן, לבצע כביסה ב- PBS 1 x על 1 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם ברז מים במשך 5 דקות.
- ביצוע הכביסה של הסעיפים רקמות אלכוהול 70%, 75%, 80% ו-95%, עבור Counterstain ס' 10 ב eosin מכתים פתרון למשך 2 דקות.
- לבצע התייבשות דרך אלכוהול 95% ו- 2 שינויים של אלכוהול מוחלט למשך 5 דקות בכל פעם. ברור ב- 2 שינויים של קסילן במשך 5 דקות.
- ציון נזק לרקמות של המעי הגס צינתור, האמצעי ו דיסטלי של העכבר כל עבור נוקאאוט גנטי והן קבוצות פראי-סוג בהתבסס על התוצאות של הנ ל H & E ההכתמה.
הערה: האינדקס המחלה הוא ציון משולב של נזק אפיתל ודלקת רירית, submucosa, muscularis ו serosa אזורים, אשר מוגדר כדלקמן: 0 (אין נזק לרקמות ו דלקת), 1 (נזק לרקמות מוקד ודלקת), 2 (אחידה נזק לרקמות ודלקת), ו- 3 (נזק לרקמות ' מאטום לשקוף ' ודלקת)12,13. שלושה ציונים לכל בעכבר על החלקים צינתור, האמצעי ו דיסטלי של המעי הגס נמצאים ואז מסוכם כדי לקבל ניקוד הכולל עבור כל חיה. ממוצע הציונים של כל קבוצה ואז מחושבים.
- אימונוהיסטוכימיה14
- מחממים את הסעיפים רקמות שנאספו מ- cryostat-65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות על פלטה חמה. לשטוף את המקטעים בזמנים PBS 3 1 x, 10 דקות כל אחד. דגירה בסעיפים רקמות מי חמצן 3% 10 דקות לחסל peroxidase אנדוגני. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים נוספות. לחסום את הרקמות עם חסימת מאגר (3% BSA, דטרגנט ללא יונית 0.3%, 2% עז סרום, 0.1% אזיד הנתרן ב- 1 x PBS) בטמפרטורת החדר במשך 1 h או יותר.
- להחליף את המאגר חסימה עם פתרון המכיל תא החיסון הבא ייחודיים לסוג נוגדנים הראשי: CD45 של לויקוציטים, CD3 עבור T תאים, B220 עבור תאים B, CD11b עבור מקרופאגים, Ly6G עבור נויטרופילים. דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- להסיר את הנוגדנים העיקרי ממקטעים רקמות על ידי השאיפה. לשטוף את הסעיפים עם 1 x PBS 3 פעמים, למשך 10 דקות. דגירה הסעיפים עם נוגדן משני biotinylated, ואחריו הדגירה עם קומפלקס streptavidin-HRP בטמפרטורת החדר.
- דגירה הסעיפים 3, 3'-diaminobenziding (DAB) פתרון לפתח צבע חום בהיר או כהה, להמחיש את התאים immunoreactive.
- Counterstain הסעיפים עם hematoxylin ואמוניה 0.3% (v/v) מדולל. קח שדה בהיר תמונות בהגדלה X 10 תחת מיקרוסקופ.
- להשתמש תוכנית עיבוד התמונה כדי לזהות ולכמת את אוכלוסיית תאים חיסוניים מסומן האפיתל והן את פרופריה. מוסקולריס (מתחת האפיתל) על-ידי הגדרת מסכות 2: להשתמש המסיכה הראשונה בתכונה צבע-קוביית מבוססי לקביעת זיהוי צבע סף ולמדוד את תגובתי DAB אזורים צבעוניים; השתמש המסכה השניה כדי לקבוע אזורים הכולל של האפיתל, מוסקולריס למינריות במקטע שנבדקו. מבטאים את האוכלוסייה תא immunoreactive כיחס של אזור מכתימים התאים הסתנן אל אזור הכולל של הרקמות שנבדקו.
5. ג'ין הערכת ביטוי של DSS-induced קוליטיס
- הרקמות המעי הגס לאחזר נוקאאוט גנטי שטופלו DSS ועכברים פראי-סוג של מקפיא-80 ° C, להוסיף 0.6 מ"ל של פירוק מאגר 25 מ ג של רקמות, לאחר מכן homogenize ב מהמגן.
- פעלתי לפי הנהלים של ערכת חילוץ RNA כדי לחלץ את סך ה-RNA, ואת DNase I-משמשת כדי לחסל גנומית דנ משחיתה
- לרוץ עם ג'ל agarose כדי לבדוק את טיב הרנ א שחולצו. אם הלהקה RNA 28S שלה הוא בהיר יותר הלהקה 18S, זה שימושי. קח 1 µL של המדגם RNA כדי לקבוע ריכוז ה-RNA על microspectrophotometer.
- לערבב 1 µg של RNA הכולל עם µL 2.5 של 20 מ מ oligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 תחל, µL 1 של לוקמיה מאתר Moloney רוורס טרנסקריפטאז וירוס (MMLV). דגירה ב 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות להכין את cDNA.
- להגדיר תגובות PCR בזמן אמת על ידי ערבוב 1µL של cDNA עם 0.5 µL של qPCR ואחורה תחל עבור TNF, IFN-γ, IL-IL 5,-13, IL-10, TGF-β1 ו β-אקטין כפקד בנוסף 2 x הפלורסנט ירוק.
- הפעל את qPCR עם הפרמטרים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 45 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 10 s, 50 מעלות במשך 25 s, ו-72 מעלות 20 s.
- לחשב כימות היחסי של ביטוי גנים באמצעות ה 2–ΔΔCt שיטת15. יחסית לנתח את רמות ביטוי גנים נוקאאוט vs. פראי-סוג עכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הליך DSS-induced מחלת המעי הדלקתי הוקמה על ידי וניהול 3% DSS במי השתייה α-gustducin-נוק אאוט (KO), פראי-סוג (WT) עכברים. בהשוואה ל- WT עכברים, העכברים נוק הציג קוליטיס קשה יותר עם אובדן משקל יתר, שלשול לדימום במעי (איור 1). לאחר ניהול DSS 7 ימים, הבדלי רקמות תקינות נותחו באמצעות צביעת המטוקסילין כשיטת היסטולוגית, נזק לרקמות מחמירות יותר נמצאה נקודתיים צינתור, האמצעי ו דיסטלי של עכברים knockout מאשר בעכברים WT ( איור 2). יתר על כן, הפעלת מערכת החיסון מופרז הובילה קוליטיס עם חדירה של תאים דלקתיים שונים כגון macrophages, נויטרופילים. ניתוחים Immunohistochemical באמצעות מספר סמנים עבור תאים חיסוניים בוצעו כדי לקבוע אם מחסור α-gustducin מושפעות תא החיסון הסתננות. ניתוח השוואתי הראה כי החדירה של לויקוציטים, נויטרופילים ומקרופגים היה משמעותי מוגברת בעכברים נוקאאוט בהשוואה WT בקרת עכברים (איור 3). לבסוף, כמה רמות ביטוי ציטוקינים נקודתיים של קוליטיס DSS-induced עכברים היו נחושים באמצעות qPCR עם גנים ספציפיים תחל. תוצאות המחקר הראו כי בהשוואה לעכברים WT, העכברים נוקאאוט היו רמות גבוהות יותר ביטוי של TNF ו- IFN-γ אבל רמות נמוכות יותר ביטוי של IL-5, IL-13 ו IL-10; עם זאת, אין הבדל נראתה ברמת הביטוי של TGF-β1 בין נוקאאוט WT עכברים (איור 4).
איור 1 : DSS המינהל רינדור קוליטיס קשה יותר בα-gustducin הסתרה (KO). (א) אחוז ירידה במשקל הגוף: KO עכברים מוצגים באופן משמעותי יותר ירידה במשקל הגוף, החל מיום 3. (B) אינדקס מחלת קוליטיס בהתאם לחומרת השלשול דימום רקטלי: KO עכברים הראה מדדי המחלה גדול יותר באופן משמעותי מאשר WT פקדים. (ג) קולון (החלונית העליונה) וה טחול (לוחות התחתון) מהמינהל נציג WT ו KO עכברים 7 ימים פוסט-DSS: KO עכברים היה נמוך באופן משמעותי נקודתיים, טחולים גדול יותר. קווי שגיאה מייצגים SEM (* p < 0.05, * * p < 0.005, * * * p < 0.0005; אנובה עם לאחר הוק t-בדיקות). סרגל קנה מידה = 1 ס מ. דמות זו שונתה הפרסום הקודם13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : Α-gustducin KO עכברים רקמות פגועות. חמורות יותר לאחר הטיפול DSS. (א) H & E להכתים של המעי הגס רקמות של עכברים KO WT וα-gustducin אינו מטופל באמצעות DSS (מים) או שטופלו DSS במשך 7 ימים (DSS). (B) רקמת הפציעה ציונים בהתבסס על צביעת היסטולוגית של המעי הגס רקמות של עכברים WT ו קו 7 ימים לאחר DSS המינהל. טיפול DSS המושרה כמה נזק לרקמות ב WT נקודתיים, אשר היה גרועים בהרבה הדגימה KO. קווי שגיאה מייצגים SEM (* p < 0.05). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. דמות זו שונתה הפרסום הקודם13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : Α-gustducin KO עכברים להציג חדירה מוגברת של תאים חיסוניים קוליטיס DSS-induced. (א) תא החיסון מסיבית בחדירת נקודתיים של עכברים שטופלו DSS KO. (B) כימות של תאים חיסוניים מספרים: האחוז של אזורים immunostained מחולק שטח רקמת נמדד בהתבסס על ניתוח התמונה. קווי שגיאה מייצגים ב- SEM. סולם בר = 50 מיקרומטר. דמות זו שונתה הפרסום הקודם13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : Α-gustducin KO עכברים להציג רמות ביטוי שונה של ציטוקינים המערכת החיסונית קוליטיס DSS-induced. טיפול DSS גדל ביטוי של TNF ו- IFN-γ, ירד ביטוי של IL-5, IL-13, ו IL-10 ב נקודתיים עכברים קו בהשוואה WT עכברים. בזמן אמת RT-PCR כמותי בוצעה באמצעות תחל גנים ספציפיים. Β-אקטין שימש הגן בקרה פנימית. קווי שגיאה מייצגים SEM (* p < 0.05, * * p < 0.005). דמות זו שונתה הפרסום הקודם13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: רשימת צבעי יסוד בשימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשיטה זו יכול להיות מועסק כדי quantitively לקבוע את ההשפעה של מוטציות של גנים ספציפיים הטעם על דלקת במודל של עכברים DSS-induced מחלת המעי הדלקתי. כדי לנצל את מלוא היתרונות, אינדוקציה אופטימלית של מחלת המעי הדלקתי היא צעד המפתח. התפתחות דלקת המעי הגס מושפע במספר גורמים, כולל עכבר זן, סביבת דיור, microflora מעיים, כמו גם הגנים של עניין. מומלץ לבצע ניסוי הפיילוט עם מספר קטן של עכברים לבחון במינונים שונים ומשכי מינהל DSS. במהלך פיילוט, סימפטומים מגעיל כמו ירידה במשקל, שלשול, דימום במעיים ו שינויים מיקרוסקופיים מסוימים כגון נזק לרקמות, הדלקת הקשורה תא החיסון הסתננות, שינויים ברמת הביטוי של ציטוקינים צריך להיות מנותח, לעומת קבוצות הבקרה שיש מי שתייה ללא DSS16,17,18,19. ניתן לנטר חומרת קוליטיס המושרה ידי ניתוח יומי לשינויים במשקל הגוף העכבר ותוצאות של השרפרף שנאספו במהלך תקופת DSS-טיפול. לאחר הטיפול DSS, הרס הרקמה יכול להיות מוערך על ידי H & E מכתים במקטעי קפוא של המעי הגס, ואילו חדירה של תאים חיסוניים, רמות הביטוי של ציטוקינים ניתן לזהות, לכמת באמצעות אימונוהיסטוכימיה ו- qPCR. DSS המינון, ניהול ומשך לדיאטה יכול להיות מותאם כדי לחשוף תופעות עדינות של מוטציות גנטיות הטעם על התגובות החיסון חוקן. עם זאת, הרגישות של שיטה זו עדיין עלולה להגביל את תחולת מחקרים על ההשפעות מינימלי של כמה גנים אחרים. במקרה זה, מספר שינויים יכולים להיות מאומץ; לדוגמה, על-ידי מזעור המשתנים של אדם ספציפי microflora מעיים מאת וניהול אנטיביוטיקה.
המודל קוליטיס DSS-induced שימש הכי נרחב בקרב כימיות הנוצרות על-ידי הסוכן מחלת המעי הדלקתי מודלים, בעיקר בשל פשטותו, במהירות, הפארמצבטית, בקירות וצפיות, ודמיונו והכי חשוב כדי קוליטיס האנושי, אשר הוא שימושי בחינת האפקטיביות של אדם הרפוי2. חיסרון אחד החוקרים חייבים להיות מודעים T זה הינם תאים B אינם הכרחיים לצורך הפיתוח של קוליטיס, השונה מן ההתפתחות של המחלה אצל בני אדם. עם זאת, יתכן שימושי עבור לומד את התפקיד של מערכת החיסון מולדים בהתפתחות של קוליטיס חריפה2.
מחקר זה הקימה DSS-induced מחלת המעי הדלקתי מודל באמצעות עכברים חשוכת-α-gustducin, אשר יכול לשמש כדי לחקור פונקציות הרומן של יחידה α משנית חלבון G חסינות הרירית בטן ודלקת. התוצאות מציגות כי עכברים שחסרו α-gustducin רגישים יותר קוליטיס DSS-induced ומלווים על ידי סימפטומים חמורים יותר, לרבות נזק לרקמות, תגובות דלקתיות יתר ביטוי שונה של ציטוקינים חזק13. מסכים עם הממצאים האחרונים המציינת את המעורבות של מסלולים chemosensory טעם כמו ב II סוג החיסון התגובות טפילים במעיים20, α-gustducin וטעם אחרים איתות חלבונים ייתכן הרומן ופונקציות חשובים ב- המעי איזון מערכת החיסון. עם זאת, המנגנון המולקולרי המדויק שבבסיס תגובות חיסוניות מוטה אלה נשארים ולחשוף.
יתר על כן, יכול להיות מיושם בשיטה זו כדי ללמוד את השפעות אחרות הגנים הטעם באים לידי ביטוי במעי הגס (למשל, קולטן ארעי פוטנציאליים תעלת יונים Trpm5, אשר הוא קריטי כדי שטיפת המעי הגס מתבטאות האדם וטעמים מתוקים, המר של אמאמי תאים7). לבסוף, האסטרטגיה אותו ניתן לגלות פונקציות חדשות של חלבונים מפתח וגורמים חסינות מעיים, לעזור להעריך את האפקטיביות של טיפולים חדשניים למחלות בבני אדם מסוים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81671016, 31471008 ו 31661143030), מכוני הבריאות הלאומיים (DC010012, DC015819) על ידי קרן Siyuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), Unit 15 (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), New York, N.Y. 1329-1333 (2016).
