Summary
味覚関連遺伝子の無効のデキストラン硫酸ナトリウム (DSS) の免疫反応に及ぼす影響を調査するためのプロトコルの紹介-炎症性腸疾患 (IBD) マウス モデルを誘発します。
Abstract
炎症性腸疾患 (IBD) は、潰瘍性大腸炎、クローン病、世界中の人々 の何百万人の生活の質に影響を与えるなど、免疫関連消化器疾患のひとつです。IBD の症状は腹痛, 下痢, と直腸出血を含む腸内細菌、食品成分、腸上皮細胞と免疫細胞間の相互作用から生じる。各キー遺伝子の腸上皮性および免疫細胞で発現が大腸の炎症をどのように影響するかを評価するために特に重要なのです。G タンパク質共役型味覚受容体は、G タンパク質サブユニット α-gustducin と他のシグナル伝達タンパク質を含むは、腸の中に発見されています。ここでは、代表として α-gustducin を使用、デキストラン硫酸ナトリウム (DSS) を記述-IBD 腸管粘膜免疫と炎症の味覚遺伝子の突然変異の効果を評価するモデルを誘発。このメソッドでは、化学的に誘導される IBD モデル遺伝子ノックアウト技術を組み合わせたもの、したがって味覚遺伝子が無効になるだけでなく、可能性があります exuberate またはコロンの DSS 誘発性免疫応答を抑制する他の遺伝子の結果を評価するために適用できます。変異マウスにより管理される DSS の体重や便、直腸出血が監視され、記録される中に、一定の期間。管理中に異なる縦長で一部のマウスは安楽死させて、サイズとコロン、脾臓の重量を測定し、腸組織を収集し、処理組織学的および遺伝子発現解析。データは過度の体重減少、下痢、腸出血、組織の損傷、炎症と野生型マウスの α gustducin ノックアウト結果を示します。誘発した炎症の重症度はいるマウス系統、住環境、食生活の影響、パイロット実験における DSS 濃度と投与期間の最適化は特に重要です。これらの要因を調整して、両方のアンチと炎症の影響を評価するためにこのメソッドを適用できます。
Introduction
潰瘍性大腸炎 (UC)、クローン病 (CD)、炎症性腸疾患 (IBD) の 2 つの主要な形式は多元的病因1,2 腸の弛張熱または進行性慢性炎症性条件によって特徴付けられます。.IBD の発達は遺伝的と同様、ある特定の環境要因食事療法、抗生物質の使用などに依存し、重要なは、病原性の感染症。しかし、病因と IBD の制御分子機構はまだ明らかではありません。したがって、多数の化学物質誘発 IBD 動物モデルが構築され適用された病因と規制メカニズムを表し、治療学3の有効性を評価します。
好みの受容器が G タンパク質共役受容体 (Gpcr) と 2 つの主要な種類に分類されます: タイプ I (T1Rs)、およびタイプ II (T2Rs) うま味、甘くて苦い化合物を検出します。味シグナル伝達カスケードは、G タンパク質 α gustducin と Gβγ の二量体で構成される、Gβγ のサブユニットのリリースにつながる T1Rs または、ヘテロ三量体のアクティブ化 T2Rs に伝達バインドによって開始されます。Gβγ 部分は、下流のエフェクター酵素ホスホリパーゼ C-β 2 (PLC β 2) を順番に刺激し。活性化 PLC β 2 が 2 つの細胞内二次メッセンジャー [イノシトール-1,4,5-三リン酸 (IP3) とジアシルグリセ ロール] に IP3バインド ホスファチジルイノシトール-4, 5-ビスリン酸を加水分解し、そのチャネル受容体 IP3 を開くR3、小胞体からのカルシウム イオンを放出します。これは最終的に一時的な受容器の潜在的なイオン チャネル Trpm5 の開口部と、味覚神経4,5,6,7に神経伝達物質 ATP の放出に します。まだ、塩辛い、酸っぱい味のシグナル伝達経路は、うま味、甘くて苦い味8から独立して別です。さらに、味 Gpcr のコンポーネントと下流蛋白質が様々 な口腔外組織に存在します。最近の研究では、その α gustducin を示されている、味がシグナル伝達の主成分が腸粘膜で表されることがわかった。シグナリングの口腔外組織9,10のコンポーネントこれらの好みの機能を理解するためにさらなる研究が必要です。
ここで説明したメソッドを使用して、口腔外組織で表される味覚シグナル伝達タンパク質の機能を特徴付けるため。味蕾化学物質誘発大腸炎モデルにおけるシグナル伝達カスケードの輪郭を描くために開発されたトランスジェニック マウスの線を組み合わせています。主に手続き型のシンプルさ、人間の潰瘍性大腸炎に病理組織学的類似性のため、デキストラン硫酸ナトリウム (DSS)-誘導の IBD モデルは様々 な化学物質誘発大腸炎モデル11本のうち最も広く使用されています。本研究で我々 は 1) 組織形態学的変化を分析し、2) の式の違いを試金によって腸粘膜免疫と炎症 α gustducin の新たな機能を明らかにするのに代表的なマウス線として α-gustducin-欠損マウスを使用大腸の炎症に関連するサイトカイン。このメソッドを使用して、遺伝子組み換えマウス ラインの遺伝子と量的そして質的を決定組織の損傷および腸の炎症に味覚シグナル蛋白 (および他のタンパク質が腸内で表現) の貢献できます。興味があります。この方法の利点は、化学の DSS の両方のアクションおよび興味の遺伝子の欠損の結果として統合されたデータを取得するユーザーを有効にします。このメソッドは、その感度を上げる、細胞・分子レベルで腸内の微妙な変化を明らかにするためさらに改善できます。
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Protocol
マウスを含むすべての実験は、見直しされ、機関動物ケアおよび使用委員会の浙江大学によって承認されました。このプロトコルを実行する前に適切な保護具を着用をお勧めします。
1. マウスと DSS の準備
- ノックアウト (α-gustducin-/-) マウスおよび年齢、性別 - と保つボディ重量をマッチさせた野生型制御 (α gustducin+/+) きれいなケージで個別に c57bl/6 マウス。
注: ノックアウト マウス c57bl/6 マウスと 20 代以上の目印されて持っているし、ほぼ 100 %c57bl/6 遺伝的背景を持っています。 - オートクレーブ処理した水 1 リットルにデキストラン硫酸ナトリウム (DSS) 粉末 30 g を溶かします。ソリューションの最終作業濃度が 3% (w/v) であることを確認する明確になるまで混ぜます。
注: DSS ソリューション格納できますまたは 4 ° C で 1 週まで間室温で使用するまで。
2. 誘導と DSS 腸炎モデルマウスにおける評価
- 検討し、それぞれのマウスの初期体重を記録します。標準的なプラスチック製ケージに個別にマウスを置くし、ケージにラベルを付けます。
- マウスの両方のグループが持っている 7 日間の合計のための 3 %dss ソリューションでの飲料水の定期的交換広告自由にアクセスします。
- マウスの体重を測定 DSS ソリューション消費を記録、収集し、DSS 投与中毎日各マウスの便を調べる。下痢や直腸出血の重症度を観察し、これを DSS 誘発疾患インデックス12に変換します。
- 実験では、初期重量と発病指数と比較して体重減少の割合は、大腸炎の症状を評価する計算されます。
注: 発病指数下痢や直腸出血の観察を組み合わせることによって獲得し、次のように定義されます: 0 (通常便、血)、1 (柔らかい便、血)、2 (柔らかい便、小さな血)、3 (非常に柔らかい便、ささやかな出血)、および 4 (水様便、重大な出血)12。発病指数は、各マウスを毎日分析します。 - 7 日間 DSS の治療の末、頚部転位によってマウスを犠牲にし残りの実験を続行します。
3. 組織試料作製法
- 仰臥位の位置にマウスを置き、70% エタノールで腹部の肌をきれい。腹腔内を公開する小さなはさみのペアと腹部で 3 cm 長い正中切開を行います。
- 慎重に他の組織から別の脾臓を脾臓を削除し、そのサイズを測定するには、鉗子のペアを使用します。
- 識別し鉗子でコロンを持ち上げ、周囲の腸間膜から分離します。盲腸と直腸が表示されるまで、大腸全体を引き出します。
- コロンを分離するには、colonocecal マージンと近位および遠位結腸をそれぞれ無料骨盤の奥深くにそれを transecting します。測定し、分離の大腸の長さを記録します。解離性のプロシージャの間に大腸の組織を損傷しないように注意します。
- 溶出液が完全にクリアされるまで、糞便や血液を削除する経口針装備 10 mL 注射器で 10 ml の冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のコロンをフラッシュします。
- 組織学的同定の 3 つの部分に同様に組織サンプルを分割: 近・中・遠位。その後、ティッシュで修正 4% パラホルムアルデヒド (PFA) 一晩 4 ° C で
- サイトカイン発現の解析、液体窒素で急速に全体のコロンを凍結し、使用するまで-80 ° C でそれを格納します。
4 DSS 誘発大腸炎の重症度の組織学的評価
- ヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色
- 固定後、cryoprotect にサンプル 15 mL チューブで一晩 1x PBS で 30% ショ糖溶液で組織が水没します。
- 最適な切削温度 (OCT) 化合物にティッシュを埋め込むし、OCT を硬くなるまで-20 ° C でそれを配置します。
- クライオスタットに組織を含む 10 月のブロックを転送、12 μ m とスライスするクライオスタットで厚さダイヤルを設定し、12 μ m 厚い凍結切片を収集します。
- ホット プレート上で 20 分間 65 ° c クリオスタットから収集されたティッシュ セクションを熱します。
- 蒸留水で簡単にセクションを洗います。ヘマトキシリン染色液を 5 分間で、それらを染色し、その後 5 分水道の流水ですすいでください。
- 0.5% 塩酸酸-エタノール 30 s とリンス水道水 1 分を実行中にそれらのセクションを区別します。1 分の 1 × PBS で洗浄を実行し、その後 5 分水道の流水ですすいでください。
- 70%、75%、80%、95% アルコール、エオシン染色液 2 分で s. 対比染色 10 ごとの組織切片の洗濯を実行します。
- たびに 5 分脱水 95% アルコールや無水アルコールの 2 つの変更を実行します。明らかに 5 分のキシレンの 2 つの変更。
- 各マウスの近・中・遠位結腸組織の損傷を遺伝子ノックアウトと、上記 H & E 染色の結果に基づいて野生型グループの両方のスコアします。
注: 発病指数は気道上皮の損傷や炎症、粘膜、粘膜下層、筋層、漿膜の地域で次のように定義されているの合計点数: 0 (組織の損傷や炎症)、1 (焦点組織の損傷や炎症)、2 (斑状組織の損傷や炎症)、および 3 (びまん性組織の損傷や炎症)12,13。マウスの結腸の近・中・遠位部分のあたりの 3 つのスコアは、各動物の合計スコアを取得する、合計されます。各グループの平均点を算出します。
- 免疫組織化学14
- ホット プレート上で 20 分間 65 ° c クリオスタットから収集されたティッシュ セクションを熱します。1 × PBS 3 回、各 10 分でセクションを洗浄します。内因性ペルオキシダーゼを排除するために 10 分間 3% 過酸化水素で切片を孵化させなさい。セクション 3 回以上を洗います。バッファー (3 %bsa、0.3% 非イオン性洗剤、2% ヤギ血清、1 × PBS では、0.1% アジ化ナトリウム) 1 時間室温でまたは複数ブロックで組織をブロックします。
- ブロック バッファーを置き換えます次免疫細胞の種類に固有の一次抗体を含むソリューション: 白血球の CD45、T 細胞の CD3、B220 B 細胞、マクロファージの CD11b と好中球の Ly6G。4 ° C で一晩インキュベートします。
- 吸引による組織切片から一次抗体を削除します。1 × PBS 3 回、各 10 分でセクションを洗います。セクションを室温でストレプトアビジン-HRP コンプレックスと孵化によって続いてビオチン化二次抗体とインキュベートします。
- 光またはダークブラウン色を開発し、陽性の細胞を可視化する 3, 3'-diaminobenziding (軽打) ソリューションをセクションを孵化させなさい。
- Counterstain ヘマトキシリンと 0.3% (v/v) 希釈アンモニア セクション。顕微鏡で 10 倍の倍率に明視野画像を取る。
- による画像処理プログラムを使用して識別し、上皮と粘膜 (上皮) の下の両方でマークされた免疫細胞の人口を定量化 2 マスクを設定: 色キューブ ベース機能の最初のマスクを使用して、色検出を設定しきい値; 色の軽打反応面積を測定し、上皮および検査セクションで層流粘膜固有層の合計領域を決定するのに 2 番目のマスクを使用します。検討組織の総面積に浸潤細胞の染色領域の比率として陽性細胞集団を表現します。
5. 遺伝子発現評価 DSS 誘発大腸炎
- DSS 投与遺伝子ノックアウト-80 ° C のフリーザーから野生型マウスから大腸組織を取得し、組織の 25 mg 0.6 mL の溶解バッファーを追加し、ホモゲナイザーの均質化します。
- 総 RNA と DNase I を使用する任意の汚染のゲノム DNA を除去するために抽出する RNA 抽出キットのプロトコルに従ってください。
- 抽出した RNA の品質をチェックする agarose のゲルを実行します。その 28 s RNA バンドが 18 歳のバンドよりも明るい場合、使用可能です。RNA のサンプルを顕に RNA 濃度を決定するための 1 μ L を取る。
- 20 mM オリゴ (dT)12,13,14,15,16,17,18プライマーの 2.5 μ L と 1 μ L モロニー マウス白血病の総 RNA のミックス 1 μ gウイルス (MMLV) 逆転写酵素。CDNA を準備に 60 分間、42 ° C で孵化させなさい。
- TNF, IFN-γ, イリノイの前方および逆の qPCR のプライマーの 0.5 μ L で cDNA の 1 μ l を混合することによってリアルタイム PCR の反作用を設定-5、IL-13、IL-10、TGF-β 1 および β-アクチン × 蛍光グリーン染料 2 に加えてコントロールとして。
- 次のパラメーターで、qPCR を実行: 95 ° C、10 分は続いて 45 サイクル 95 ° C の 10 s、25 ° C、50 s、および 20 の 72 ° C s。
- 152-ΔΔCt法を用いた遺伝子発現の相対的な定量化を計算します。比較的ノックアウト対における遺伝子発現レベルを分析します。野生型マウス。
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Representative Results
DSS 誘発 IBD プロシージャは 3% の管理によって設立された α-gustducin-ノックアウト (KO) と野生型 (WT) マウスに飲料水中の DSS。ノックアウト マウスは WT マウスと比較して、過度の体重減少、下痢、消化管出血 (図 1) とより重症の大腸炎を出展しました。7 日 DSS 投与後組織学的方法として H & E 染色を使用して組織の整合性の違いを分析し、ノックアウト マウスよりも WT マウス (の近・中・遠のコロンでより悪化の組織の損傷が見つかりました図 2)。さらに、過度の免疫活性は、マクロファージや好中球などさまざまな炎症性細胞の浸潤と大腸炎につながった。免疫細胞のマーカーの数を用いた免疫組織化学的解析は α gustducin 欠乏症に免疫細胞の浸潤が影響を受けるかどうか確認を行った。比較分析は、白血球、好中球とマクロファージの浸潤も WT マウス (図 3) と比較してノックアウト マウスで増加したことを示した。最後に、qPCR の遺伝子特定のプライマーを用いた DSS 誘発大腸炎マウスのコロンでいくつかのサイトカイン発現量を求めた。WT マウスと比較されたことを示した結果ノックアウト マウスを持っていた TNF の IFN-γ より高い発現レベルが il-5、IL-13 と IL-10; の低い発現レベルただし、ノックアウトと WT マウス (図 4) の TGF-β 1 の発現量に差は認められなかった。
図 1: DSS 投与より重篤な大腸炎 α gustducin ノックアウト (KO) をレンダリングします。(A) 体重減少率: KO マウスは 3 日目から始まって大幅に多く体重を表示します。(B) 大腸炎病気インデックス下痢や直腸出血の重症度に基づいて: KO マウスは WT コントロールよりも有意に大きい疾患指標を示した。(C) コロン (上部パネル) と代表の WT や KO マウスのポスト DSS の 7 日間管理から脾臓 (下のパネル): KO マウスは有意に短かったコロンと大きい脾臓。誤差範囲を表す SEM (* p < 0.05 * * p < 0.005 * * * p < 0.0005;分散分析と事後t-テスト)。スケール バー = 1 cm。この図は、以前の文書13から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: Α gustducin KO マウス DSS 投与より深刻な組織の損傷を示す。(A) H & E WT と α-gustducin の KO マウス DSS (水) と扱われないからコロンのティッシュの汚損または 7 日間 (DSS) DSS と扱われます。(B) 組織傷害スコアが DSS 投与後 7 日目の WT と KO マウスから結腸組織の組織染色に基づいて。DSS 治療は、多くの悪い KO 標本にされた WT コロンでいくつかの組織の損傷を誘発しました。誤差範囲を表す SEM (* p < 0.05)。スケールバー = 50 μ m。この図は、以前の文書13から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: Α gustducin KO マウスは、DSS 誘発大腸炎に免疫細胞の浸潤を増加を表示します。(A) コロンで DSS 処理 KO マウスの大規模な免疫細胞の浸潤。免疫細胞数 (B) の定量化: 画像解析に基づく immunostained エリア測定組織の総面積で割った値の割合。誤差範囲を表す SEM. スケール バー = 50 μ m。この図は、以前の文書13から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: Α gustducin KO マウスは、DSS 誘発大腸炎に免疫サイトカインの異なる発現レベルを表示します。DSS 治療 TNF および IFN-γ の発現を増加、IL-13 と IL-10 KO マウス コロンで WT マウスと比較された IL-5 の発現を減少させた。リアルタイム定量 PCR は遺伝子特定のプライマーを用いて行った。Β-アクチンは、内部統制の遺伝子として使われました。誤差範囲を表す SEM (* p < 0.05 * * p < 0.005)。この図は、以前の文書13から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1: 使用されるプライマーのリスト。
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Discussion
このメソッドは、曲率を用いることができる IBD の DSS 誘発マウス モデルにおける炎症の特定の味覚遺伝子の突然変異の効果を決定します。フル活用するには、IBD の最適な誘導は重要なステップです。大腸炎の開発はマウス緊張、住環境、腸内細菌叢、興味の遺伝子などいくつかの要因の影響を受けます。少数の異なる投与量をテストするマウスと DSS 投与期間パイロット実験を実行することをお勧めします。パイロット実験、体重減少、下痢、腸出血、組織の損傷などいくつかの顕微鏡的変化など総症状、免疫細胞浸潤に関連付けられている炎症とサイトカインの発現レベルの変化をする必要があります。分析し、DSS16,17,18,19なしの飲料水を持っている制御グループと比較して。誘発腸炎の重症度は、DSS 治療期間中に日々 の体重マウスと収集した便のスコアの変化を分析することによって監視できます。DSS 投与後は、免疫細胞の浸潤とサイトカインの発現レベル識別でき、免疫組織化学と qPCR を使用して量を示されるに対し、H & E 染色、コロンの凍結切片による組織の損傷を評価できます。DSS 投与量、投与期間、および食事は、大腸の免疫応答の味覚遺伝子変異の微妙な効果を明らかにする調整できます。ただし、このメソッドの感度はまだいくつかの他の遺伝子の最小限の影響に関する研究への応用を制限があります。この場合、いくつかの変更を採用することができます。たとえば、抗生物質を投与し、個人特定の腸内細菌叢から変数を最小します。
DSS 誘発大腸炎モデルは、主にそのシンプルさ、速さ、再現性、制御性、最も重要なことはひと潰瘍性大腸炎に類似のため、化学エージェントによる IBD モデルの中で最も広く使用されています治療学2の有効性の評価に有用。研究者は認識する必要があります 1 つの欠点は、T、B 細胞はヒトの病気の開発とは異なる大腸炎の開発のために必須ではありません。ただし、急性大腸炎2の開発における自然免疫の役割を研究するために役に立つ場合があります。
本研究では、α gustducin 欠損マウスは、腸管粘膜免疫と炎症の G タンパク質 α サブユニットの新たな機能を調査する使用ことができますを使用して IBD の DSS 誘発モデルを確立しています。Α gustducin に欠けているマウスが DSS 誘発大腸炎になりやすいが、伴われる組織の損傷、過度の炎症反応、サイトカインは、強力な13の発現の変化などのより重篤な症状を示した。タイプ II 免疫腸寄生虫20α-gustducin、小説との重要な機能、腸のかもしれない蛋白質シグナリング他の味の味のような嗅覚経路の関与を示す最近の調査結果に一致して免疫のバランス。ただし、これらの傾斜した免疫応答の基礎となる正確な分子機構は、覆いを取られるに残る。
コロンに表現される他の味覚遺伝子の効果を研究するこのメソッドを適用ことができますさらに、 (例えば、一過性受容体電位イオン チャネル Trpm5、うま味、苦味、甘い味と大腸で表された人間にとって重要であります。7をのセル)。最後に、腸管免疫で重要なタンパク質と要因の新しい機能を発見し、特定の人間の病気の新しい治療法の有効性を評価するのに役立つ同じ戦略を使用できます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、Siyuan 財団、国家自然科学基金、中国の (81671016、31471008、および 31661143030)、国立衛生研究所 (DC010012、DC015819) からの助成金によって支えられています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
References
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