Summary
Qui presentiamo un protocollo per studiare l'effetto di annullamento dei geni legati al gustazione sulle risposte immunitarie in un sodio del solfato del dextrano (DSS)-infiammatorie intestinali (IBD) la malattia del mouse modello indotto.
Abstract
Malattia infiammatoria intestinale (IBD) è uno dei disturbi gastrointestinali immuno-correlati, tra cui la colite ulcerosa e morbo di Crohn, che incide sulla qualità di vita di milioni di persone in tutto il mondo. IBD sintomi includono dolore addominale, diarrea e sanguinamento rettale, che possono derivare da interazioni tra microbiota dell'intestino, componenti alimentari, cellule epiteliali intestinali e le cellule immunitarie. È di particolare importanza per valutare come ogni gene chiave espressa in cellule epiteliali ed immune intestinale colpisce l'infiammazione del colon. Recettori del gusto accoppiati a proteine G, tra cui G proteina subunità α-gustducin e altre proteine di segnalazione, sono stati trovati nell'intestino. Qui, usiamo α-gustducin come rappresentante e descrivere un sodio del solfato del dextrano (DSS)-modello IBD per valutare l'effetto delle mutazioni del gene gustativo su immunità mucosa dell'intestino e infiammazione indotto. Questo metodo combina la tecnologia di knockout del gene con il modello IBD chimicamente indotto e quindi può essere applicato per valutare l'esito della nullificazione gene gustativo come pure altri geni che possono exuberate o smorzare la risposta immunitaria indotta da DSS nel colon. Topi mutanti vengono somministrati con DSS per un certo periodo durante il quale loro peso corporeo, sgabello e sanguinamento rettale sono monitorati e registrati. Presso diversi punti temporali durante l'amministrazione, alcuni topi sono euthanized, quindi le dimensioni e i pesi dei loro milze e i due punti sono misurati e tessuti dell'intestino sono raccolti e trattati per istologico e analisi dell'espressione genica. I dati mostrano che i risultati di knockout di α-gustducin in eccessiva perdita di peso, diarrea, sanguinamento intestinale, danno tissutale e topi infiammazione vs wild-type. Poiché la gravità dell'infiammazione indotta è influenzata da diversi ceppi di topi, habitat e dieta, ottimizzazione della durata di concentrazione e amministrazione di DSS in un esperimento pilota è particolarmente importante. Regolando questi fattori, questo metodo può essere applicato per valutare sia gli effetti anti - e pro-infiammatorie.
Introduction
Le due forme principali di malattia infiammatoria intestinale (IBD), morbo di Crohn (CD) e colite ulcerosa (UC) sono caratterizzate da condizioni infiammatorie croniche remittente o progressive dell'intestino con eziologia multifattoriale1,2 . Lo sviluppo delle IBD dipende dalla genetici, nonché determinati fattori ambientali quali dieta, uso di antibiotici e soprattutto, infezioni da patogeni. Tuttavia, l'eziologia e la regolamentazione dei meccanismi molecolari implicati IBD sono ancora poco chiari. Da qui, numerosi modelli animali chimicamente indotte di IBD sono stati costruiti e applicati per delineare la patogenesi e meccanismi di regolamentazione e valutare l'efficacia terapeutica umana3.
Recettori del gusto sono recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e sono classificati come due tipi principali: (T1Rs), tipo I e II (T2Rs) che consentono di rilevare composti amari, dolce e umami. Cascate di segnalazione del gusto vengono avviate da tastant T1Rs o T2Rs, attivando l'eterotrimerica G proteine leganti composto α-gustducin e un dimero Gβγ e che porta al rilascio delle subunità Gβγ. La frazione Gβγ a sua volta stimola l'effettore a valle dell'enzima fosfolipasi C-β2 (PLC-β2). Attivato PLC-β2 quindi idrolizza il fosfatidilinositolo 4,5-bisphosphate in due messaggeri intracellulari secondarie [inositolo-1,4,5-trisfosfato (IP3) e diacilglicerolo] e IP3 si lega a e aprire il suo canale-ricevitore IP3 R3, rilasciando ioni calcio dal reticolo endoplasmatico. Questo conduce infine all'apertura del canale di ioni potenziale transitorio del ricevitore Trpm5 e rilascio del neurotrasmettitore ATP sui nervi gustativo4,5,6,7. Ancora, le vie di segnalazione del gusto salato ed acido sono diversi e indipendenti da sapori amari8, dolce e umami. Inoltre, i componenti di gusto GPCR e proteine a valle esistono in vari tessuti extra-orali. Recenti studi hanno indicato quello α-gustducin, il componente principale del gusto di segnalazione, è trovato per essere espresso nella mucosa intestinale. Ulteriori studi sono necessari per comprendere le funzioni di questi gusto segnalazione componenti in tessuti extra-orali9,10.
Il metodo qui descritto è usato per caratterizzare le funzioni delle proteine di segnalazione gustative espresse in tessuti extra-orali. Uniamo una linea di topi transgenici sviluppata per la delineazione di Cascate di segnalazione in papille gustative con il modello di colite indotta chimicamente. In gran parte grazie alla sua semplicità procedurale e patologiche somiglianze alla colite ulcerosa umana, il Destrano solfato di sodio (DSS)-indotto IBD modello è stato più ampiamente utilizzato tra i vari modelli colite indotta chimicamente11. In questo studio, abbiamo usato i topi α-gustducin-carente come una linea di rappresentante del mouse per rivelare nuove funzioni di α-gustducin immunità mucosa dell'intestino e infiammazione 1) analizzando i cambiamenti morfologici nel tessuto e 2) analizzando le differenze nell'espressione di citochine legate alla infiammazione del colon. Questo metodo può essere utilizzato per determinare quantitativamente e qualitativamente i contributi di proteine di segnalazione gustativi (e altre proteine espresse nell'intestino), a danno di tessuto e l'infiammazione intestinale, quando topi geneticamente modificati per linee per i geni di interesse sono disponibili. Vantaggi di questo metodo sono consentendo agli utenti di ottenere integrata dei dati derivanti dalle azioni del DSS chimica e deficit del gene di interesse. Questo metodo può essere ulteriormente migliorato per aumentare la sua sensibilità e rivelare i cambiamenti sottili intestinali a livello cellulare e molecolare.
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Protocol
Tutti gli esperimenti coinvolgenti topi sono stati esaminati e approvati dal istituzionale Animal Care e comitati di uso dell'Università di Zhejiang. Si consiglia di indossare adeguati dispositivi di protezione personali prima di eseguire questo protocollo.
1. preparazione di topi e DSS
- Tenere i topi knockout (α-gustducin- / -) ed età - sesso- e controllo di selvaggio-tipo di pari peso di corpo (α-gustducin+ +) topi C57BL/6 singolarmente in gabbie pulite.
Nota: I topi knockout sono stati backcrossed con topi C57BL/6 per più di 20 generazioni e hanno uno sfondo di genetica C57BL/6 di 100% quasi. - Sciogliere 30 g di polvere di Destrano solfato sodio (DSS) in 1 L d'acqua in autoclave. Mescolare fino a quando la soluzione diventa chiara per garantire che la concentrazione di lavoro finale è del 3% (p/v).
Nota: La soluzione DSS può essere conservata a temperatura ambiente per 1 settimana o a 4 ° C fino all'utilizzo.
2. induzione e la valutazione di colite DSS in topi
- Pesare e registrare il peso corporeo iniziale di ogni mouse. Posizionare i topi singolarmente nelle gabbie di plastica standard ed etichettare le gabbie.
- Sostituire regolarmente l'acqua potabile con soluzione DSS 3% per un totale di 7 giorni a cui entrambi i gruppi di topi hanno accesso ad libitum.
- Misurare il peso corporeo del mouse, registrare il consumo di soluzione DSS e raccogliere ed esaminare lo sgabello di ogni mouse ogni giorno durante l'amministrazione di DSS. Osservare la severità di diarrea e sanguinamento rettale e convertire questo al DSS indotta malattia indice12.
- Durante l'esperimento, la percentuale di perdita di peso rispetto al peso iniziale e l'indice di malattia vengono calcolati per valutare i sintomi di colite.
Nota: L'indice di malattia è segnato dalla combinazione di osservazioni di diarrea e sanguinamento rettale e sono definiti come segue: 0 (normale delle feci, senza sangue), 1 (feci molli, senza sangue), 2 (feci molli, poco sangue), 3 (feci molto molli, modesto sanguinamento) e 4 (feci acquose, spurgo significativo)12. L'indice di malattia viene analizzato ogni giorno per ogni mouse. - Entro la fine del trattamento di 7 giorni DSS, sacrificare i topi da dislocazione cervicale e procedere con gli esperimenti restanti.
3. preparazione dei campioni di tessuto
- Posizionare il mouse nella posizione supina e pulire la pelle dell'addome con etanolo al 70%. Fare un'incisione di 3 cm di lunghezza della linea mediana nell'addome con un paio di piccole forbici per esporre la cavità addominale.
- Utilizzare un paio di pinze per attentamente separare la milza da altri tessuti, quindi rimuovere la milza e misurare le sue dimensioni.
- Identificare e sollevare i due punti con il forcipe e separarla dal mesentery circostanti. Tirare fuori tutto il colon fino a quando l'intestino cieco e del retto sono visibili.
- Isolare il colon transecting esso al margine colonocecal e profondità nel bacino gratuita del colon prossimale e distale, rispettivamente. Quindi, misurare e registrare la lunghezza del colon isolato. Fare attenzione a non danneggiare il tessuto colico durante la procedura di dissezione.
- Sciacquare il colon con 10 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) e ghiacciata con una siringa da 10 mL dotata di un ago sonda gastrica per rimuovere le feci e il sangue finché l'eluato è completamente chiaro.
- Per identificazione istologica, dividere in parti uguali i campioni di tessuto in tre parti: prossimale, medio e distale. Quindi, fissare il tessuto con paraformaldeide al 4% (PFA) durante la notte a 4 ° C.
- Per l'analisi dell'espressione di citochine, congelare tutto il colon rapidamente con azoto liquido e conservare a-80 ° C fino all'utilizzo.
4. istologica valutazione della severità di colite indotta da DSS
- Ematossilina ed eosina (H & E)
- Dopo la fissazione, immergere il tessuto in una soluzione di saccarosio al 30% in PBS 1x pernottamento in una provetta da 15 mL per cryoprotect i campioni.
- Incorporare il tessuto in temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e metterlo a-20 ° C fino a quando si indurisce il OCT.
- Trasferire il blocco di OCT contenente il tessuto di un criostato, impostare la manopola di spessore nel criostato a 12 µm e fetta e raccogliere 12 sezioni congelate di µm di spessore.
- Riscaldare le sezioni di tessuto raccolti da un criostato a 65 ° C per 20 minuti su una piastra calda.
- Lavare le sezioni brevemente in acqua distillata. Li macchia con ematossilina macchiatura soluzione per 5 min e successivamente risciacquare con acqua corrente per 5 min.
- Differenziare le sezioni con 0,5% di acido cloridrico-etanolo per 30 s e risciacquare in esecuzione sotto acqua corrente per 1 min. Quindi, eseguire il lavaggio in PBS 1X per 1 min e successivamente risciacquare con acqua corrente per 5 min.
- Eseguire lavaggio delle sezioni del tessuto in alcol 70%, 75%, 80% e 95%, ciascuno per 10 s. controcolorazione in eosina soluzione per 2 min.
- Eseguire disidratazione attraverso alcol al 95% e 2 cambi di alcool assoluto per 5 minuti ogni volta. Chiaro in 2 cambi di xilene per 5 min.
- Il Punteggio dei danni ai tessuti del colon prossimale, medio e distale di ogni topo per il gene knockout e il selvaggio-tipo gruppi sulla base dei risultati della precedente H & E colorazione.
Nota: L'indice di malattia è un punteggio combinato di danno epiteliale ed infiammazione nelle regioni mucosa, sottomucosa, muscolare e sierosa, che è definita come segue: 0 (nessun danno tissutale e l'infiammazione), 1 (infiammazione e danno di tessuto focale), 2 (irregolare danno tissutale e l'infiammazione) e 3 (infiammazione e danno diffuso del tessuto)12,13. Tre punteggi per topo per le parti prossimali, medie e distale del colon vengono poi sommati per ottenere un punteggio totale per ogni animale. Quindi vengono calcolati i punteggi medi per ogni gruppo.
- Immunohistochemistry14
- Riscaldare le sezioni di tessuto raccolti da un criostato a 65 ° C per 20 minuti su una piastra calda. Lavare le sezioni in 1X PBS 3 volte, per 10 minuti ciascuno. Incubare le sezioni di tessuto in perossido di idrogeno 3% per 10 min eliminare perossidasi endogena. Lavare le sezioni 3 volte di più. Bloccare i tessuti con blocco buffer (3% BSA, detergente non ionico 0,3%, 2% di siero di capra, 0,1% di sodio azide in PBS 1X) a temperatura ambiente per 1 h o più.
- Sostituire il tampone bloccante con una soluzione contenente i seguenti anticorpi primari di tipo-specifica delle cellule immuni: CD45 per leucociti, CD3 per le cellule T, B220 per le cellule B, CD11b per i macrofagi e Ly6G per i neutrofili. Incubare per una notte a 4 ° C.
- Rimuovere gli anticorpi primari da sezioni di tessuto dall'aspirazione. Lavare le sezioni con 1x PBS 3 volte, per 10 minuti ciascuno. Incubare le sezioni con anticorpo secondario biotinilato seguita da incubazione con il complesso di streptavidina-HRP a temperatura ambiente.
- Incubare le sezioni con 3, 3'-diaminobenziding (DAB) soluzione per sviluppare un colore marrone chiaro o scuro e visualizzare le cellule immunoreactive.
- Colorante di contrasto le sezioni con ematossilina e 0,3% (v/v) diluito ammoniaca. Prendere immagini campo chiaro a 10 ingrandimenti al microscopio.
- Utilizzare un programma di elaborazione di immagine per identificare e quantificare la popolazione delle cellule immunitarie contrassegnate sia l'epitelio e la lamina propria (sotto l'epitelio) di impostazione 2 maschere: utilizzare la prima maschera nella funzionalità basate su colore-cubo per impostare un rilevamento del colore soglia e misurare le aree colorate DAB-reattiva; utilizzare la seconda maschera per determinare aree totale dell'epitelio e laminare propria nella sezione esaminata. Esprimere la popolazione delle cellule immunoreactive come rapporto della zona di colorazione delle cellule infiltrate all'area totale del tessuto esaminato.
5. Gene Expression valutazione di colite indotta da DSS
- Recuperare i tessuti del colon dal DSS-trattati gene knockout e topi wild-type da un congelatore a-80 ° C e aggiungere 0,6 mL di tampone di Lisi a 25 mg di tessuto, quindi omogeneizzare in un omogeneizzatore.
- Seguire il protocollo del kit di estrazione di RNA per estrarre il RNA totale e dnasi I viene utilizzata per eliminare qualsiasi contaminante DNA genomic.
- Eseguire un gel di agarosio per controllare la qualità del RNA estratto. Se la sua banda di RNA 28S è più luminosa di banda 18S, è utilizzabile. Prendere 1 µ l di campione di RNA per determinare la concentrazione di RNA su un microspectrophotometer.
- Mescolare 1 µ g di RNA totale con 2,5 µ l di primer di18 17,di 20 mM oligo (dT)12,13,14,15,16,e 1 µ l di leucemia murina di Moloney trascrittasi inversa del virus (MMLV). Incubare a 42 ° C per 60 min preparare il cDNA.
- Impostare le reazioni di PCR in tempo reale di miscelazione 1 µ l del cDNA con 0,5 µ l di primer forward e reverse qPCR per TNF, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-10 e TGF-β1 β-actina come controllo oltre a 2 x tintura verde fluorescente.
- Eseguire la qPCR con i seguenti parametri: 95 ° C per 10 minuti, seguiti da 45 cicli di 95 ° C per 10 s, 50 ° C per 25 s e 72 ° C per 20 s.
- Calcolare la relativa quantificazione dell'espressione genica utilizzando i 2–ΔΔCt metodo15. Comparativamente analizzare i livelli di espressione genica nel knockout vs. topi wild-type.
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Representative Results
È stata stabilita una procedura IBD DSS indotta attraverso la somministrazione di 3% DSS in acqua potabile per α-gustducin-knockout (KO) e topi wild-type (WT). Rispetto ai topi WT, i topi knockout ha esibito più grave colite con eccessiva perdita di peso, diarrea e sanguinamento intestinale (Figura 1). Dopo una somministrazione di DSS di 7 giorni, le differenze nell'integrità del tessuto sono state analizzate usando la macchiatura di H & E come il metodo istologico, e danni ai tessuti più aggravata è stato trovato nei due punti prossimali, medio e distali dei topi knockout rispetto a topi WT ( Figura 2). Inoltre, l'attivazione immunitaria eccessiva ha portato alla colite con infiltrazione delle varie cellule infiammatorie quali macrofagi e neutrofili. Analisi di immunohistochemical usando un numero di marcatori per le cellule immuni sono state effettuate per determinare se la carenza di α-gustducin interessati l'infiltrazione delle cellule immuni. Analisi comparativa ha mostrato che l'infiltrazione dei leucociti, neutrofili e macrofagi è stata aumentata significativamente in topi knockout rispetto ai topi di controllo WT (Figura 3). Infine, alcuni livelli di espressione di citochine in due punti dei topi di colite DSS indotta sono stati determinati utilizzando qPCR con gli iniettori di gene-specific. I risultati hanno mostrato che, rispetto ai topi WT, i topi knockout avevano più alti livelli di espressione di TNF e IFN-γ ma più bassi livelli di espressione di IL-5, IL-13 e IL-10; Tuttavia, è stata osservata nessuna differenza del livello di espressione di TGF-β1 tra il knockout e topi WT (Figura 4).
Figura 1 : Amministrazione di DSS rende più grave colite in α-gustducin knockout (KO). (A) percentuale di perdita di peso corporeo: topi KO visualizzato significativamente più perdita di peso del corpo a partire dal giorno 3. (B) indice di colite malattia basato sulla severità di diarrea e sanguinamento rettale: topi KO ha mostrato gli indici di malattia significativamente maggiori rispetto ai controlli WT. (C) Colon (pannello superiore) e della milza (pannelli inferiori) dal rappresentante WT e KO topi 7 giorni post-DSS amministrazione: topi KO erano significativamente più breve dei due punti e milze più grandi. Barre di errore rappresentano SEM (* p < 0,05, * * p < 0,005, * * * p < 0.0005; ANOVA con post-hoc t-test). Barra della scala = 1 cm. Questa figura è stata modificata da una precedente pubblicazione13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Α-gustducin KO topi mostrano più gravi danni ai tessuti dopo il trattamento di DSS. (A) H & E colorazione dei tessuti del colon da WT e α-gustducin KO topi non trattati con DSS (acqua) o trattati con DSS per 7 giorni (DSS). (B) tessuto lesioni punteggi basati sulla macchiatura istologici dei tessuti del colon da topi WT e KO 7 giorni dopo la somministrazione di DSS. Trattamento di DSS ha indotto alcuni danni ai tessuti in punti e WT, che era molto peggio nel campione KO. Barre di errore rappresentano SEM (* p < 0,05). Barra della scala = 50 µm. Questa figura è stata modificata da una precedente pubblicazione13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Α-gustducin topi KO per visualizzare aumentata infiltrazione di cellule immunitarie nella colite indotta da DSS. (A) infiltrazione voluminosa delle cellule immunitarie nei due punti dei topi KO DSS-trattati. (B) quantificazione dei numeri delle cellule immuni: la percentuale delle zone di immunostained diviso per l'area totale del tessuto misurato basato su analisi di immagine. Barre di errore rappresentano SEM. scala bar = 50 µm. Questa figura è stata modificata da una precedente pubblicazione13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Α-gustducin topi KO per visualizzare i livelli di espressione diversa di citochine immuni nella colite indotta da DSS. Trattamento di DSS ha aumentato l'espressione di TNF e IFN-γ e diminuita espressione di IL-5, IL-13 e IL-10 nei due punti topi KO rispetto a topi WT. RT-PCR quantitativa in tempo reale è stato effettuato usando gli iniettori di gene-specific. Β-actina è stato utilizzato come un gene di controllo interno. Barre di errore rappresentano SEM (* p < 0,05, * * p < 0,005). Questa figura è stata modificata da una precedente pubblicazione13. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Elenco dei primer utilizzati.
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Discussion
Questo metodo può essere impiegato per quantità determinare l'effetto delle mutazioni di specifici geni gustativi su infiammazione in un modello murino IBD indotta da DSS. Per sfruttare al meglio, induzione ottimale di IBD è un passo fondamentale. Lo sviluppo di colite è influenzato da diversi fattori, tra cui topo, housing ambiente, microflora intestinale, così come i geni di interesse. Si consiglia di eseguire un esperimento pilota con un piccolo numero di topi per testare diversi dosaggi e durate di amministrazione DSS. Durante l'esperimento pilota, lordi sintomi come perdita di peso, diarrea, sanguinamento intestinale e alcuni cambiamenti microscopici come il danno tissutale, infiammazione associata con infiltrazione delle cellule immuni e modifiche a livello di espressione di citochine dovrebbero essere analizzato e confrontato ai gruppi di controllo che hanno acqua potabile senza DSS16,17,18,19. Gravità della colite indotta può essere monitorato analizzando le variazioni quotidiane in peso corporeo del mouse e i risultati delle feci raccolti durante il periodo di trattamento di DSS. Dopo il trattamento di DSS, il danno tessutale può essere valutato da H & E che macchia sulle sezioni congelate del colon, mentre l'infiltrazione delle cellule immuni e livelli di espressione di citochine possono essere identificati e quantificati tramite immunohistochemistry e qPCR. Dosaggio DSS, durata di somministrazione e la dieta può essere regolate per rivelare gli effetti sottili delle mutazioni nel gene gustativo sulle risposte immunitarie coliche. Tuttavia, la sensibilità di questo metodo ancora può limitarne l'applicazione agli studi sugli effetti minimi di alcuni altri geni. In questo caso, possono essere adottate alcune modifiche; ad esempio, riducendo al minimo le variabili da individuo specifico microflora intestinale attraverso la somministrazione di antibiotici.
Il modello di colite DSS indotta è stato usato il più estesamente fra chimiche modelli di agente-indotta IBD, in gran parte a causa della sua semplicità, rapidità, riproducibilità, controllabilità e soprattutto similitudini con la colite ulcerosa umana, che è utile a valutare l'efficacia terapeutica umana2. I ricercatori devono essere consapevoli di uno degli svantaggi è che T e le cellule B non sono necessari per lo sviluppo di colite, che è diverso dallo sviluppo della malattia in esseri umani. Tuttavia, può essere utile per studiare il ruolo del sistema immunitario innato nello sviluppo di colite acuta2.
Questo studio ha stabilito un modello IBD DSS indotta utilizzando topi α-gustducin-carenti, che possono essere utilizzati per indagare le funzioni romanzo della subunità α della proteina G in immunità mucosa dell'intestino e l'infiammazione. I risultati mostrano che i topi che mancano di α-gustducin sono più suscettibili alla colite DSS indotta e sono accompagnati da sintomi più gravi, tra cui danno tissutale, eccessive risposte infiammatorie e alterata espressione di citochine potenti13. In accordo con i risultati recenti che indica il coinvolgimento delle vie chemosensory gusto-come nelle risposte immunitarie di tipo II per intestino parassiti20, α-gustducin e altri gusto segnalazione proteine possono avere romanzo e importanti funzioni nell'intestinale equilibrio immune. Tuttavia, l'esatti meccanismi molecolari alla base di queste risposte immunitarie distorte rimangono per essere scoperto.
Inoltre, questo metodo può essere applicato per studiare gli effetti di altri geni gustative che si esprimono nel colon (ad es., il recettore transitoria potenziale canale ionico Trpm5, che è fondamentale per i gusti dolce, amaro e umami ed espressa in umani colica celle7). Infine, la stessa strategia può essere utilizzata per scoprire nuove funzioni di proteine chiave e fattori nell'immunità intestinale e aiutare a valutare l'efficacia di nuovi trattamenti di determinate malattie umane.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni da parte del National Natural Sciences Foundation of China (81671016, 31471008 e 31661143030) e il National Institutes of Health (DC010012, DC015819) e dalla Fondazione Siyuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
References
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