Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo para investigar o efeito da anulação dos genes relacionados com gustação sobre respostas imunes em uma de sódio sulfato de dextrano (DSS)-induzidas pelo modelo de mouse (IBD) de doença inflamatória intestinal.
Abstract
Doença inflamatória intestinal (IBD) é um dos distúrbios gastrointestinais imune-relacionados, incluindo a colite ulcerosa e doença de Crohn, que afeta a qualidade de vida de milhões de pessoas em todo o mundo. IBD os sintomas incluem dor abdominal, diarreia e sangramento retal, que pode resultar de interações entre a microbiota do intestino, componentes de alimentos, células epiteliais intestinais e células do sistema imunológico. É de particular importância para avaliar como cada gene chave expressado nas células epiteliais e imunes intestinais afeta inflamação no cólon. Receptores de sabor acoplado à proteína G, incluindo a subunidade α da proteína G-gustducin e outras proteínas de sinalização, foram encontrados nos intestinos. Aqui, usamos a α-gustducin como representante e descrever um de sódio sulfato de dextrano (DSS)-induzido modelo IBD para avaliar o efeito das mutações génicas gustativa na imunidade da mucosa do intestino e inflamação. Este método combina tecnologia de gene nocaute com o modelo IBD quimicamente induzido e, portanto, pode ser aplicado para avaliar o resultado da anulação do gene gustativa, bem como outros genes que podem exuberate ou diminuir a resposta imune induzida por DSS no cólon. Ratos mutantes são administrados com DSS durante um certo período durante o qual seu peso de corpo, fezes e sangramento retal são monitorados e registrados. Em diferentes momentos durante a administração, alguns ratos são sacrificados, em seguida, os tamanhos e pesos de seus baços e dois-pontos são medidos e tecidos do intestino são recolhidos e tratados para histológica e análises de expressão do gene. Os dados mostram que os resultados de nocaute de α-gustducin em perda de peso excessivo, diarreia, sangramento intestinal, dano tecidual e inflamação vs selvagem-tipo ratos. Desde que a gravidade da inflamação induzida é afectada por estirpes de rato, ambiente de moradia e dieta, otimização da duração de concentração e administração de DSS em um experimento piloto é particularmente importante. Ajustando estes fatores, este método pode ser aplicado para avaliar ambos os efeitos antie pro-inflamatórios.
Introduction
As duas principais formas de doença inflamatória intestinal (IBD), (CD) da doença de Crohn e colite ulcerativa (UC) são caracterizadas por condições inflamatórias remitente ou progressivas crônicas do intestino com etiologia multifatorial1,2 . O desenvolvimento do IBD depende de genéticas, bem como certos fatores ambientais como dieta, uso de antibióticos e importante, infecções patogênicas. No entanto, a etiologia e regulamentares mecanismos moleculares subjacentes IBD não são ainda claras. Daí, numerosos modelos animais quimicamente induzidos de IBD foram construídos e aplicados para delinear a patogênese e mecanismos reguladores e avaliar a eficácia da terapêutica humana3.
Receptores de sabor são receptores de acoplado à proteína G (GPCRs) e são classificados em dois tipos principais: tipo I (T1Rs), e tipo II (T2Rs) que detectam o umami, doce e amargos compostos. Cascatas de sinalização gosto são iniciadas por tastant proteínas de ligação a T1Rs ou T2Rs, ativando a Via G consistindo de α-gustducin e um dímero Gβγ e levando a liberação das subunidades Gβγ. A fracção Gβγ por sua vez estimula a jusante effector enzima fosfolipase C-β2 (PLC-β2). PLC-β2 registrados então hidrolisa fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato dois mensageiros secundários intracelulares [inositol-1, 4,5-triphosphate (IP3) e diacilglicerol] e IP3 liga a e abrir seu canal-receptor IP3 R3, liberando íons de cálcio do retículo endoplasmático. Eventualmente, isto leva para a abertura do canal de íon potencial transiente do receptor Trpm5 e liberação do neurotransmissor ATP para os nervos gustativos4,5,6,7. Ainda, as vias de sinalização dos sabores salgados e amargo são diferentes e independentes de doce, umami e gostos amargos8. Além disso, os componentes de sabor GPCRs e proteínas a jusante existem em vários tecidos extra orais. Estudos recentes indicaram que α-gustducin, o principal componente do sabor de sinalização, encontra-se a ser expressa na mucosa intestinal. Mais estudos são necessários para entender as funções destes gosto sinalização componentes em tecidos extra oral9,10.
O método descrito aqui é usado para caracterizar as funções das proteínas de sinalização gustativas, expressadas em tecidos extra orais. Combinamos uma linha de rato transgénico desenvolvida para delinear as cascatas de sinalização no paladar com o modelo de colite induzida quimicamente. Em grande parte devido à sua simplicidade processual e patológicas semelhanças com colite ulcerosa humana, o dextran sulfato de sódio (DSS)-induzido IBD modelo tem sido mais amplamente utilizado entre colite induzida quimicamente vários modelos11. Neste estudo, usamos camundongos deficientes em α-gustducin como uma linha representativa do mouse para revelar novas funções de α-gustducin na imunidade da mucosa do intestino e inflamação 1) analisando as alterações morfológicas no tecido e 2) diferenças na expressão de análise do citocinas relacionadas à inflamação no cólon. Esse método pode ser usado para quantitativamente e qualitativamente determinar as contribuições das proteínas de sinalização gustativas (e outras proteínas expressadas no intestino) dano tecidual e inflamação intestinal, quando o rato geneticamente modificado linhas para os genes da juros estão disponíveis. Vantagens deste método estão permitindo que os usuários obter dados integrados resultantes de ações de ambos os químicos DSS e deficiência do gene de interesse. Esse método pode ser melhorado para aumentar a sua sensibilidade e revelar alterações intestinais sutis a nível celular e molecular.
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Protocol
Todos os experimentos envolvendo ratos foram revistos e aprovados pelo cuidado de Animal institucional e comissões da Universidade de Zhejiang do uso. É aconselhável usar equipamento de protecção adequado antes de executar este protocolo.
1. preparação dos ratos e DSS
- Manter os ratos do KO (α-gustducin- / -) e idade-, sexo- e corpo peso-combinadas selvagem-tipo controle (α-gustducin+ +) camundongos C57BL/6 individualmente em gaiolas limpas.
Nota: Os camundongos nocaute tem sido traçados com camundongos C57BL/6 há mais de 20 gerações e uma quase 100% C57BL/6 genética de fundo. - Dissolva 30 g de dextran sulfato de sódio (DSS) em pó em 1 litro de água esterilizada. Misture até que a solução torna-se claro para garantir que a concentração final do trabalho é de 3% (p/v).
Nota: A solução DSS pode ser armazenada em temperatura ambiente por até 1 semana ou a 4 ° C até o uso.
2. indução e avaliação do DSS colite em ratos
- Pesar e registar inicial de cada rato peso corporal. Coloque os ratos individualmente em gaiolas de plástico padrão e rotular as gaiolas.
- Substitua o regular de água potável com solução DSS 3% para um total de 7 dias para que ambos os grupos de ratos têm acesso ad libitum.
- Medir o peso do corpo do rato, registrar consumo de solução DSS e coletar e examinar as fezes de cada rato diariamente durante a administração de DSS. Observar a gravidade da diarreia e sangramento retal e converter a doença induzida por DSS índice12.
- Durante o experimento, a porcentagem de perda de peso em relação ao peso inicial e o índice de doença são calculados para avaliar os sintomas da colite.
Nota: O índice da doença é marcado pela combinação de observações de diarreia e sangramento retal e são definidos da seguinte maneira: 0 (fezes normais, sem sangue), 1 (fezes moles, sem sangue), 2 (fezes moles, sangue), 3 (fezes muito moles, hemorragia modesto) e 4 (fezes aquosas, sangramento significativo)12. O índice da doença é analisado diariamente para cada rato. - No final do tratamento de 7 dias DSS, sacrificar os ratos por deslocamento cervical e prosseguir com as experiências restantes.
3. preparação de amostras de tecido
- Posicione o mouse na posição supina e limpar a pele do abdômen com etanol a 70%. Fazer uma incisão 3 cm de comprimento no abdômen com um par de tesouras pequenas para expor na cavidade abdominal.
- Use um par de pinças para separar o baço de outros tecidos, em seguida, retire o baço cuidadosamente e medir seu tamanho.
- Identificar e levantar o cólon com fórceps e separá-lo do mesentério envolvente. Puxe para fora do cólon inteiro até o ceco e o reto são visíveis.
- Isole o cólon por cruza-lo à margem colonocecal e profundamente na pelve para libertar o cólon proximal e distal, respectivamente. Em seguida, medir e registrar o comprimento do cólon isolado. Tenha cuidado para não danificar o tecido do cólon durante o processo de dissecação.
- Lave o cólon com 10 mL de gelado fosfato salino (PBS) com uma seringa de 10 mL equipada com uma agulha de gavagem para remover as fezes e sangue até o eluato é completamente claro.
- Para identificação histológica, dividir as amostras em três partes: proximal, média e distal. Em seguida, fixe o tecido com paraformaldeído 4% (PFA) durante a noite a 4 ° C.
- Para a análise da expressão de citocinas, congelar todo o cólon rapidamente com nitrogênio líquido e armazená-lo a-80 ° C até o uso.
4. histológica avaliação da severidade da colite induzida por DSS
- Hematoxilina e eosina (H & E) coloração
- Após a fixação, mergulhe o tecido em uma solução de 30% de sacarose em 1X PBS durante a noite em um tubo de 15 mL para crioproteção das amostras.
- Incorporar o tecido no ideal da temperatura de corte (OCT) composto e colocá-lo a-20 ° C até a OCT endurece.
- Transferir o bloco OCT contendo o tecido para um criostato, coloque o seletor de espessura em criostato a 12 µm e fatia e coletar 12 µm de espessura seções congeladas.
- Aqueça as seções de tecido coletado de um criostato a 65 ° C por 20 min em uma chapa quente.
- Lave as seções brevemente em água destilada. Manchá-las com solução por 5 min de coloração de hematoxilina e posteriormente lavar com água corrente por 5 min.
- Diferencie as seções com 0,5% de ácido clorídrico-etanol durante 30 segundos e enxágue-os na corrida torneira água por 1 min. Em seguida, realizar a lavagem em PBS 1x por 1 min e posteriormente lavar com água corrente por 5 min.
- Realize a lavagem das secções de tecido em álcool 70%, 75%, 80% e 95%, cada um por 10 s. corante de contraste em solução por 2 min de coloração de eosina.
- Realizar a desidratação através de 95% de álcool e 2 trocas de álcool absoluto por 5 min cada vez. Clara em 2 trocas de xilol por 5 min.
- Marcar os danos nos tecidos do cólon proximal, médio e distal de cada rato para o nocaute do gene e o selvagem-tipo grupos com base em resultados do acima H & E mancha.
Nota: O índice de doença é uma pontuação combinada de dano epitelial e inflamação nas regiões de mucosa, submucosa, muscular e serosa, que é definida da seguinte maneira: 0 (nenhum dano tecidual e inflamação), 1 (dano tecidual focal e inflamação), 2 (desigual dano tecidual e inflamação) e 3 (dano tecidual difusa e inflamação)12,13. Três contagens por mouse para as partes proximais, médios e distais do cólon são então somadas para obter uma pontuação total para cada animal. A pontuação média para cada grupo é então calculada.
- Imuno-histoquímica14
- Aqueça as seções de tecido coletado de um criostato a 65 ° C por 20 min em uma chapa quente. Lave as seções em 1X PBS 3 vezes, por 10 min cada. Incube as seções de tecido em peróxido de hidrogênio 3% por 10 min eliminar a peroxidase endógena. Lave as seções 3 vezes mais. Bloquear os tecidos com o bloqueio de buffer (3% BSA, detergente não-iônico 0,3%, 2% de soro de cabra, 0,1% de azida de sódio em 1X PBS) em temperatura ambiente por 1 hora ou mais.
- Substitua o tampão de bloqueio com uma solução contendo os seguinte célula imune tipo específico os anticorpos primários: CD45 para leucócitos, CD3 para células T, B220 para as células B, CD11b para macrófagos e Ly6G para neutrófilos. Incube a 4 ° C durante a noite.
- Remova os anticorpos primários de cortes de tecido por aspiração. Lave as seções com 1X PBS 3 vezes, por 10 min cada. Incube as secções com anticorpo secundário biotinilado, seguido de incubação com o complexo estreptavidina-HRP em temperatura ambiente.
- Incube as seções com 3, 3'-diaminobenziding (DAB) solução para desenvolver uma cor marrom-clara ou escura e visualizar as células imunorreativas.
- Counterstain as seções com hematoxilina e 0,3% (v/v) diluído amônia. Com imagens do brilhante-campo na ampliação de 10x sob um microscópio.
- Use um programa de processamento de imagem para identificar e quantificar a população das células imunes em ambos o epitélio e a lâmina própria (por baixo do epitélio) marcadas por configuração 2 máscaras: use a primeira máscara no recurso baseado em um cubo de cor para definir uma detecção de cor limiar e medir as áreas coloridas de DAB-reativa; Use a segunda máscara para determinar áreas totais do epitélio e laminar propria na seção examinada. Expresse a população de células imunorreativas como uma proporção da área de coloração das células infiltradas a área total do tecido examinado.
5. Gene expressão avaliação da colite induzida por DSS
- Recuperar os tecidos do cólon do nocaute do gene DSS-tratados e selvagem-tipo ratos de um freezer-80 ° C e adicionar 0,6 mL de tampão de lise de 25 mg de tecido e, em seguida, homogeneizar em um homogeneizador.
- Siga o protocolo do kit de extração de RNA para extrair o RNA total e que é usado para eliminar qualquer contaminante DNA genômico de DNase.
- Execute um gel de agarose para verificar a qualidade do RNA extraído. Se sua banda de RNA 28S é mais brilhante do que a banda 18S, é utilizável. Tome 1 µ l da amostra para determinar a concentração de RNA em um microspectrophotometer do RNA.
- Misturar 1 µ g de RNA total com 2,5 µ l de 20mm oligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 primers e 1 µ l de murino leucemia Moloney transcriptase reversa de virus (MMLV). Incube a 42 ° C por 60 min preparar o cDNA.
- Reações de PCR em tempo real criado pela 1µL do cDNA de mistura com 0,5 µ l de qPCR para diante e reverso primers para TNF, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-10, TGF-β1 e β-actina como um controle além de 2 x tintura verde fluorescente.
- Executar o qPCR com os seguintes parâmetros: 95 ° C por 10 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C por 10 s, 50 ° C para 25 s e 72 ° C por 20 s.
- Calcule a quantificação relativa da expressão gênica usando o 2–ΔΔCt método15. Analise comparativamente os níveis de expressão do gene no nocaute vs. ratos do selvagem-tipo.
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Representative Results
Foi estabelecido um procedimento IBD DSS-induzida pela administração de 3% DSS em água potável para α-gustducin-nocaute (KO) e ratos de tipo selvagem (WT). Em comparação com camundongos WT, os ratos nocaute exibiram colite mais grave com perda de peso excessivo, diarreia e sangramento intestinal (Figura 1). Após a administração de DSS um dia 7, as diferenças na integridade do tecido foram analisadas usando H & E mancha como o método histológico, e mais grave dano tecidual foi encontrado nos dois-pontos proximais, médios e distais dos camundongos nocaute do que em camundongos WT ( Figura 2). Além disso, a excessiva ativação imune levou a colite com infiltração de células inflamatórias diversas tais como macrófagos e neutrófilos. Realizaram-se análises imuno-histoquímica, usando um número de marcadores para as células do sistema imunológico para determinar se a deficiência de α-gustducin afetadas infiltração de células imunes. Análise comparativa mostrou que a infiltração de leucócitos, neutrófilos e macrófagos aumentou significativamente nos ratos nocaute em comparação com ratos controle WT (Figura 3). Finalmente, alguns níveis de expressão de citocinas nos dois pontos de ratos induzida por DSS colite foram determinados utilizando qPCR com primeiras demão gene-específico. Os resultados mostraram que em comparação com WT ratos, os ratos nocaute tinham maiores níveis de expressão de TNF e IFN-γ, mas mais baixos níveis de expressão de IL-5, IL-13 e IL-10; no entanto, nenhuma diferença foi vista do nível de expressão de TGF-β1 entre o nocaute e camundongos WT (Figura 4).
Figura 1 : Administração de DSS processa colite mais grave em nocautes de α-gustducin (KO). (A) porcentagem de perda de peso corporal: camundongos KO exibido significativamente mais perda de peso corporal a partir do dia 3. (B) índice de doença colite com base na gravidade da diarreia e sangramento retal: KO ratos mostraram índices de doença significativamente maiores do que controles WT. (C) cólon (painel superior) e baço (painéis inferiores) do representante WT e KO ratos 7 dias post-DSS administração: camundongos KO tinham dois pontos significativamente menores e maiores baços. Barras de erro representam SEM (* p < 0.05, * * p < 0.005, * * * p < 0,0005; ANOVA com post hoc t-testes). Barra de escala = 1 cm. Esta figura foi modificada de uma anterior publicação13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Α-gustducin KO ratos mostram mais grave dano tecidual após o tratamento de DSS. (A) H & E mancha de tecidos do cólon de WT e α-gustducin KO ratos não tratados com DSS (água) ou tratados com DSS para 7 dias (DSS). (B) escores de lesão de tecido com base na coloração histológica dos tecidos do cólon de ratos WT e KO 7 dias após a administração de DSS. Tratamento de DSS induzido alguns danos nos tecidos em dois pontos do WT, que foi muito pior na amostra KO. Barras de erro representam SEM (* p < 0,05). Barra de escala = 50 µm. Esta figura foi modificada de uma anterior publicação13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Α-gustducin KO ratos exibir maior infiltração de células do sistema imunológico em colite induzida por DSS. (A) infiltração de células imunes maciça nos dois pontos de ratos tratados com DSS KO. (B) quantificação do número de células imunes: a percentagem de áreas immunostained dividido pela área total do tecido medido com base nas análises de imagem. Barras de erro representam SEM. escala barra = 50 µm. Esta figura foi modificada de uma anterior publicação13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Α-gustducin KO ratos exibir níveis diferentes de expressão de citocinas imunes na colite induzida por DSS. Tratamento de DSS aumentou a expressão de TNF e IFN-γ e diminuição da expressão de IL-5, IL-13 e IL-10 nos dois-pontos camundongos KO em comparação com camundongos WT. RT-PCR quantitativo em tempo real foi realizado usando as primeiras demão gene-específico. Β-actina foi usado como um gene de controlo interno. Barras de erro representam SEM (* p < 0.05, * * p < 0.005). Esta figura foi modificada de uma anterior publicação13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Lista de primers usados.
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Discussion
Este método pode ser empregado para quantitativamente determinar o efeito das mutações de genes específicos gustativas na inflamação em um modelo do rato do IBD induzida em DSS. Para aproveitar ao máximo, indução ideal do IBD é um passo fundamental. O desenvolvimento da colite é afetado por vários fatores, incluindo a cepa de rato, ambiente de moradia, microflora intestinal, bem como os genes de interesse. Recomenda-se realizar um experimento piloto com um pequeno número de ratos para testar diferentes doses e duração da administração de DSS. Durante o experimento piloto, brutos sintomas tais como perda de peso, diarreia, sangramento intestinal e algumas alterações microscópicas como dano tecidual, inflamação associada com infiltração de células imunes, e as alterações do nível de expressão de citocinas devem ser analisados e comparados com grupos controle que têm água potável sem DSS16,17,18,19. Gravidade da colite induzida pode ser monitorada, analisando alterações diárias no peso de corpo do rato e pontuações das fezes coletadas durante o período de tratamento-DSS. Após o tratamento de DSS, os danos do tecido podem ser avaliado por H & E manchas nas seções congeladas do cólon, Considerando que a infiltração de células do sistema imunológico e os níveis de expressão de citocinas podem ser identificados e quantificados usando imuno-histoquímica e qPCR. Dosagem DSS, administração duração e dieta podem ser ajustados para revelar efeitos sutis de mutações do gene gustativa sobre as respostas imunológicas do cólon. No entanto, a sensibilidade deste método ainda pode limitar sua aplicação aos estudos sobre os efeitos mínimos de alguns outros genes. Neste caso, algumas modificações podem ser adoptadas; por exemplo, minimizando as variáveis da microflora intestinal do indivíduo específico por administrar antibióticos.
O modelo de colite induzida por DSS tem sido utilizado mais extensivamente entre química induzida por agente IBD modelos, em grande parte devido à sua simplicidade, rapidez, reprodutibilidade, controlabilidade e sobretudo suas semelhanças com a colite ulcerosa humana, que é útil na avaliação da eficácia da terapêutica humana2. Uma desvantagem que os investigadores devem estar cientes do é que T e células B não são necessárias para o desenvolvimento de colite, que é diferente de desenvolvimento da doença em seres humanos. No entanto, pode ser útil para estudar o papel do sistema imunológico inato no desenvolvimento de colite aguda2.
Este estudo estabeleceu um modelo IBD induzida por DSS usando ratos α-gustducin-deficiente, que podem ser usados para investigar novas funções de subunidade α da proteína G na imunidade da mucosa do intestino e inflamação. Os resultados mostram que os ratos sem α-gustducin são mais suscetíveis à colite induzida por DSS e são acompanhados por sintomas mais graves, incluindo danos nos tecidos, respostas inflamatórias excessivas e expressão alterada de citocinas potente13. De acordo com descobertas recentes, indicando o envolvimento das vias chemosensory gosto como tipo II imune respostas de parasitas de intestino20, α-gustducin e outro gosto sinalizando proteínas podem ter romance e funções importantes no intestinal equilíbrio imunológico. No entanto, os mecanismos exatos moleculares subjacente a estas respostas imunes enviesadas continuam a ser descobertos.
Além disso, este método pode ser aplicado para estudar os efeitos de outros genes gustativos que são expressas no cólon (por exemplo, transitória do receptor potencial canal iônico Trpm5, que é fundamental para os sabores doce, amargo e umami e expressa em humanos do cólon células.7). Finalmente, a mesma estratégia pode ser usada para descobrir novas funções de proteínas chaves e fatores de imunidade intestinal e ajudar a avaliar a eficácia dos novos tratamentos de certas doenças humanas.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado por concessões do nacional ciências naturais Fundação da China (81671016, 31471008 e 31661143030) e o National Institutes of Health (DC010012, DC015819) e pela Fundação Siyuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
References
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