Summary
Здесь мы представляем протокол к исследовать эффект аннулирование дегустация связанных генов на иммунные реакции в декстран сульфата натрия (DSS)-индуцированной модель мыши воспалительных кишечника болезнь (IBD).
Abstract
Воспалительные заболевания кишечника (IBD) является одним из связанных с иммунной желудочно-кишечные расстройства, включая язвенного колита и болезни Крона, которая влияет на качество жизни миллионов людей во всем мире. IBD симптомы включают боль в животе, понос и ректальное кровотечение, которые могут возникнуть в результате взаимодействия между кишка микробиоты, компонентов пищи, кишечные эпителиальных клеток и иммунных клеток. Это имеет особое значение для оценки влияние каждый ключевой ген, выраженная в кишечного эпителия и иммунных клеток воспаления в толстой кишке. G белка в сочетании вкус рецепторов, включая G белка Субблок α-gustducin и других сигнальных белков, были найдены в кишечнике. Здесь, мы используем α-gustducin в качестве представителя и описать декстран сульфата натрия (DSS)-индуцированной IBD модель для оценки влияние мутаций гена вкусовые на иммунитет слизистой кишечника и воспаления. Этот метод сочетает в себе технологии Нокаут гена с моделью химически индуцированных IBD и таким образом могут применяться для оценки результатов вкусовые гена аннулирование, а также других генов, которые могут exuberate или ослабить DSS-индуцированной иммунный ответ в толстой кишке. Мутантных мышей управляются с DSS за определенный период, в течение которого контролируется и Записанная их веса тела, стул и ректальное кровотечение. На разных timepoints во время администрации, умерщвлены некоторые мышей, затем измеряются размеры и вес их селезенки и двоеточия и кишечника ткани собираются и обрабатываются для гистологического и анализа выражения гена. Данные показывают, что результаты нокаут α-gustducin в чрезмерная потеря веса, понос, кишечное кровотечение, повреждение тканей и воспаления против мышей дикого типа. Так как выраженность воспалительных процессов индуцированных зависит от мыши штаммов, жилищных условий и диеты, оптимизация DSS концентрации и администрации продолжительность эксперимента является особенно важным. Настроив эти факторы, этот метод может применяться для оценки как анти - и про воспалительных последствия.
Introduction
Два основных форм воспалительных заболеваний кишечника (IBD), болезнь Крона (CD) и язвенного колита (UC) характеризуются хроническим проверят или прогрессивный воспалительных кишечника с многофакторной этиологии1,2 . Развитие IBD зависит от генетических, а также некоторых экологических факторов, таких как диетические, использование антибиотиков и главное, патогенных инфекций. Однако этиологии и молекулярные механизмы регулирования лежащих в основе IBD до сих пор неясны. Таким образом многочисленные химически индуцированных IBD Животные модели построены и применяется к разграничить патогенеза и механизмов регулирования и оценки эффективности человека терапии3.
Вкус рецепторы являются G белок рецепторы (GPCR) и классифицируются как два основных типа: тип I (T1Rs), и тип II (T2Rs), что обнаружить сладкий, умами и горькая соединений. Вкус сигнальные каскады инициируются tastant привязки к T1Rs или T2Rs, активация гетеротримерные Г белков, состоящий из α-gustducin и Gβγ димер и ведущих к выпуску Gβγ подразделения. Общие Gβγ в свою очередь стимулирует течению эффекторных фермента фосфолипаза C-β2 (PLC-β2). Активированные PLC-β2 затем гидролизует фосфатидилинозитол-4,5-Бисфосфат в два посыльных внутриклеточных вторичных [инозит-1,4,5-trisphosphate (IP-3) и диацилглицерол] и3 IP связывается и открыть его источник рецептор IP3 R3, выпуская ионов кальция из эндоплазматического ретикулума. Это в конечном итоге приводит к открытию Переходный рецепторный потенциал ионного канала Trpm5 и освобождение нейромедиатора СПС на вкусовые нервы4,5,6,7. Тем не менее сигнальные пути соленым и кислым вкусы разные и независимого от сладкого, умами и горький вкус8. Кроме того компоненты вкуса GPCR и ниже по течению белки существуют в различных тканях экстра полости рта. Недавние исследования показали, что α-gustducin, главный компонент вкус сигнализации, найден выражаться в слизистой оболочке кишечника. Дальнейшие исследования необходимы для понимания функций этих вкус сигнализации компонентов в тканях экстра полости рта9,10.
Метод, описанный здесь используется для характеристики функции вкусовых сигнальных белков, выраженные в тканях экстра полости рта. Мы объединяем трансгенные мыши линии, разработанных для разграничения сигнальных каскадов в вкус почки с моделью химически индуцированных колит. Во многом благодаря его процедурных простоту и патологических сходство человека язвенный колит, декстран сульфата натрия (DSS)-индуцированного IBD модель наиболее широко используется среди различных моделей химически индуцированных колит11. В этом исследовании мы использовали мышей α-gustducin недостаточным как представитель мыши линия выявить новые функции α-gustducin иммунитет слизистой кишечника и воспаления 1) анализа морфологических изменений в тканях и 2) опробование различия в выражении Цитокины, относящиеся к воспаления в толстой кишке. Этот метод может использоваться для количественно и качественно определить вклад вкусовые сигнальных белков (и другие белки, выраженные в кишечнике) повреждения тканей и кишечные воспаления, когда генетически модифицированные мыши линии для гены имеется интерес. Преимущества данного метода позволяя пользователям для получения комплексных данных в результате действия химических DSS и дефицит гена интереса. Этот метод можно усовершенствовать увеличить свою чувствительность и выявить тонкие кишечных изменения на клеточном и молекулярном уровнях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты с мышей были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использование комитетов Чжэцзянский университет. Рекомендуется носить надлежащие средства личной защиты перед выполнением настоящего Протокола.
1. Подготовка мышей и DSS
- Держать нокаут (α-gustducin- / -) мышах и возраст-, пол-и тела вес соответствует одичал тип управления (α-gustducin+/ +) мышей C57BL/6 индивидуально в чистой клетках.
Примечание: Нокаут мышей были backcrossed с мышей C57BL/6 для более чем 20 поколений и имеют почти 100% C57BL/6 генетический фон. - Растворяют 30 g декстран сульфата натрия (DSS) порошка в 1 Л воды газобетона. Перемешайте до тех пор, пока решение становится ясно, для обеспечения того, чтобы окончательные рабочие концентрации 3% (w/v).
Примечание: DSS раствор может храниться при комнатной температуре до 1 недели или на 4 ° C до использования.
2. индукция и оценки DSS колит в мышей
- Весят и записывать каждый мыши первоначального веса. Место мыши индивидуально в стандартные пластиковые клетки и ярлык клетки.
- Замените регулярные питьевой воды с 3% раствором DSS для в общей сложности 7 дней, обе группы мышей, к которым имеют доступ ad libitum.
- Мера веса тела мыши, записывать DSS расход раствора и собирать и изучать табурет каждой мыши ежедневно во время администрации DSS. Наблюдать за тяжести понос и ректальное кровотечение и преобразовать это в индекс DSS-индуцированной болезни12.
- В ходе эксперимента процент потери веса, по сравнению с первоначальной массы и заболевания индекс рассчитываются для оценки симптомы колита.
Примечание: Индекс заболевания оценивается путем объединения наблюдений понос и ректальное кровотечение и определяются следующим: 0 (нормальный стул, не кровь), 1 (мягкий стул, не кровь), 2 (мягкий стул, мало крови), 3 (очень мягкий табурет, скромный кровотечение) и 4 (водянистый стул, значительное кровотечение)12. Индекс болезни анализируется ежедневно для каждой мыши. - К концу лечения 7-дневный DSS пожертвовать мышей, вывих шейного и продолжите остальные эксперименты.
3. Подготовка образцов тканей
- Поместите указатель мыши в лежачем положении и протереть кожу живота с 70% этиловом спирте. Сделать 3 см длиной срединной линии разреза в брюшной полости с парой небольших ножниц выставить брюшной полости.
- Использование пара щипцы тщательно отделить хандры от других тканей, а затем удалить селезенку и измерить его размер.
- Выявлять и поднимите толстой кишки с щипцами и отделить его от окружающих брыжейка. Вытащите весь толстой кишки, до тех пор, пока видны слепой кишки и прямой кишки.
- Изолируйте толстой кишки, transecting, на colonocecal поле и в глубине таза освободить проксимальном и дистальном Колон, соответственно. Затем измерить и записать длину изолированной толстой кишки. Будьте осторожны, чтобы не повредить толстой ткани в процедуре рассечения.
- Очистка толстой кишки с 10 мл ледяной фосфат амортизированное saline (PBS) с 10 мл шприц, оснащены иголка калийную для удаления фекалий и крови до тех пор, пока элюата совершенно ясно.
- Для гистологической идентификации, делят образцы тканей одинаково на три части: проксимальных, средние и дистальные. Затем исправьте ткани с параформальдегида 4% (PFA) на ночь при 4 ° C.
- Для анализа выражение cytokine замораживание всей толстой кишки быстро с жидким азотом и храните его при температуре-80 ° C до использования.
4. гистологические оценки тяжести DSS-индуцированной колит
- Гематоксилином и эозином (H & E)
- После фиксации погрузиться ткань в растворе 30% сахарозы в ФБР 1 x ночь в 15 мл трубку к cryoprotect образцы.
- Внедрить ткани оптимального раскроя температуры (OCT) соединения и поместите его в-20 ° C до тех пор, пока Окт твердеет.
- Передача OCT блок, содержащий ткань для криостата, установите толщина в криостата 12 мкм, и срез и собирать 12 мкм толщиной Замороженные разделы.
- Тепло в разделах собраны ткани из криостата при 65 ° C для 20 мин на горячей плите.
- Мыть в разделах кратко в дистиллированной воде. Линяют с гематоксилином окрашивание раствора на 5 мин и затем промыть проточной водой в течение 5 мин.
- Дифференцировать секции с 0,5% соляной кислоты этанол 30 s и промыть их в управлении водопроводную воду за 1 мин. Затем выполнить промывку в однократном ПБС за 1 мин и затем промыть проточной водой в течение 5 мин.
- Выполните мытье разделов ткани в 70%, 75%, 80% и 95% спирте, каждый для 10 s. изображение в эозина окрашивание раствора на 2 мин.
- Выполняют обезвоживания через 95% спирта и 2 изменения абсолютного алкоголя 5 минут каждый раз. В 2 изменения в ксилоле на 5 мин.
- Оценка повреждения тканей толстой кишки проксимальных, средние и дистальные каждой мыши Нокаут гена и одичал тип групп на основе результатов выше H & E окрашивания.
Примечание: Индекс болезнь это комбинированная оценка эпителиальных повреждение и воспаление слизистой оболочки, подслизистой, мышечной и serosa регионах, который определяется следующим: 0 (без повреждения тканей и воспаление), 1 (фокуса ткани повреждение и воспаление), 2 (пятнистый повреждение тканей и воспаление) и 3 (повреждения диффузных тканей и воспаления)12,13. Затем три ноты на мышь для проксимальных, средние и дистальные части толстой кишки суммируются получить общий балл для каждого животного. Затем рассчитываются средние показатели для каждой группы.
- Иммуногистохимия14
- Тепло в разделах собраны ткани из криостата при 65 ° C для 20 мин на горячей плите. Вымойте разделы в 1 x PBS 3 раза по 10 мин. Инкубируйте разделов ткани в перекись водорода 3% за 10 мин до ликвидации эндогенной пероксидазы. Вымойте разделы 3 раза. Блокировать тканей с блокировкой буфера (BSA 3%, 0,3% неионные стирального порошка, 2% козьего сыворотки, азид натрия 0,1% в однократном ПБС) при комнатной температуре в течение 1 ч или больше.
- Замените блокирующий буфер раствор, содержащий следующие конкретного типа иммунных клеток первичного антитела: CD45 для лейкоцитов, CD3 для Т-клеток, B220 для клетки B, CD11b для макрофагов и Ly6G для нейтрофилов. Инкубируйте на 4 ° C на ночь.
- Удаление первичных антител из разделов ткани путем аспирации. Вымойте секции с 1 x PBS 3 раза по 10 мин. Проинкубируйте разделы с биотинилированным вторичное антитело следуют инкубации с комплексом стрептавидина ПХ при комнатной температуре.
- Инкубируйте секции 3, 3'-diaminobenziding (DAB) решение для разработки светло - или темно коричневого цвета и визуализировать иммунореактивных клетки.
- Counterstain разделы с гематоксилином и 0,3% (v/v) разбавленный аммиак. Возьмите светлые области изображения при 10-кратном под микроскопом.
- Использовать программу обработки изображений для выявления и количественной оценки населения заметно иммунных клеток эпителия и lamina propria (под эпителием) установив 2 маски: используйте первый маску в функцию на основе цвета куб для задания определения цвета порог и измерить цветные DAB-реактивный области; Используйте вторую маску для определения общей площади эпителия и ламинарные propria в разделе рассмотрены. Экспресс иммунореактивных клеток населения как отношение области окрашивания клеток проникли к общей площади исследуемого ткани.
5. ген выражение оценки DSS-индуцированной колит
- Извлечение тканей толстой кишки из Нокаут гена DSS-лечение и мышах одичал тип от-80 ° C морозильник и добавить 0,6 мл буфера lysis 25 мг ткани, а затем гомогенизации в гомогенизатор.
- Следуйте РНК добыча комплект протокола для извлечения всего РНК и DNase I используется для устранения каких-либо загрязняющих геномной ДНК.
- Запуск геля агарозы для проверки качества извлеченные РНК. Если его группа РНК 28S ярче, чем группа 18S, он годн к употреблению. Возьмите 1 мкл РНК образца для определения концентрации РНК на microspectrophotometer.
- Смешайте 1 мкг всего РНК с 2,5 мкл праймеров 20 мм oligo (dT)12,13,14,,1516,17,18 и 1 мкл Молони мышиных лейкемии вирус (MMLV) обратной транскриптазы. Инкубируйте на 42 ° C 60 мин подготовить cDNA.
- Настройка реального времени реакции PCR, смешивая 1µL cDNA с 0.5 мкл прямого и обратного ПЦР Праймеры для ФНО, ИФН γ, Ил-5, IL-13, Ил-10, TGF-β1 и β-актина как элемент управления в дополнение к 2 x флуоресцентный зеленый краситель.
- Запустите ПЦР со следующими параметрами: 95 ° C в течение 10 мин, затем 45 циклов 95 ° c 10 s, 50 ° C для 25 s и 72 ° C для 20 s.
- Рассчитайте относительную количественной оценки экспрессии генов, используя 2–ΔΔCt метод15. Сравнительно анализировать уровни выражения гена в плей-офф против. мышах одичал типа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DSS-индуцированной IBD процедура была учреждена администрирование 3% DSS в питьевой воде α-gustducin нокаут (KO) и (WT) мышах одичал тип. По сравнению с WT мышей, мышей нокаут выставлены более острый колит, чрезмерная потеря веса, диареи и кишечных кровотечений (рис. 1). После 7 дней DSS администрации различия в целостности тканей были проанализированы с помощью H & E пятнать гистологический метод, и более усугубляется повреждения тканей была найдена в проксимальных, средние и дистальные двоеточия нокаут мышей чем WT мышей ( Рисунок 2). Кроме того чрезмерное иммунной активации привели к колиты с проникновения различных воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы. Чтобы определить, влияет ли α-gustducin дефицит иммунных клеток инфильтрата были проведены Иммуногистохимический анализ с использованием ряда маркеров для иммунных клеток. Сравнительный анализ показал, что проникновение лейкоцитов, нейтрофилов и макрофагов значительно увеличилась в нокаут мышей, по сравнению с WT управления мышей (рис. 3). Наконец некоторые уровни цитокина выражение в двоеточия DSS-индуцированной колит мышей были определены с помощью ПЦР с праймерами ген специфического. Результаты показали, что по сравнению с WT мышей, мышей нокаут был выше выражение уровни TNF и ИФН γ, но ниже выражение уровни IL-5, IL-13 и Ил-10; Однако никакой разницы был замечен в уровень экспрессии TGF-β1 между Выбивное и WT мышей (рис. 4).
Рисунок 1 : Администрация DSS оказывает более острый колит в нокауты α-gustducin (KO). (A) процент потери веса тела: KO мыши отображаются значительно больше веса тела, начиная с дня 3. (B) колит заболевания индекс, основанный на тяжести понос и ректальное кровотечение: KO мышей показало значительно больше болезней индексы чем WT контроля. (C) Колон (Верхняя панель) и селезенки (нижняя панели) от представителя WT и KO мышей пост DSS 7 дней администрации: KO мышей были значительно короче двоеточия и больших селезенки. Планки погрешностей представляют SEM (* p < 0,05, ** p < 0,005, *** p < 0.0005; Дисперсионный анализ с post hoc t-тесты). Шкалы бар = 1 см. Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Α-gustducin KO мышей Показать более серьезные повреждения тканей, после лечения DSS. (A) H & E окрашивания тканей толстой кишки от WT и α-gustducin KO мышей, не получавших DSS (вода) или лечение с DSS 7 дней (DSS). (B) тканей травм оценки на основе гистологические окрашивания тканей толстой кишки от мышей WT и KO 7 дней после приема DSS. DSS лечения индуцированных некоторые повреждения тканей в WT двоеточия, который был намного хуже в KO образца. Планки погрешностей представляют SEM (* p < 0,05). Шкалы бар = 50 мкм. Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Α-gustducin KO мышей отображения увеличение проникновения иммунных клеток в DSS-индуцированной колит. (A) массивные иммунных клеток проникновение в двоеточия DSS-лечение KO мышей. (B) количественная оценка числа иммунных клеток: процент immunostained областей, разделенных Общая площадь измеренной ткани на основе анализа изображения. Планки погрешностей представляют шкалу SEM. бар = 50 мкм. Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Α-gustducin KO мышей отображать различные выражения уровни иммунных цитокинов в DSS-индуцированной колит. DSS лечение увеличение экспрессии ФНО и ИФН γ и уменьшилось проявление Ил-5, IL-13 и Ил-10 в KO мышей двоеточия по сравнению с WT мышей. Реального времени количественного RT-PCR была выполнена с использованием гена специфические праймеры. Β-актина был использован как ген внутреннего контроля. Планки погрешностей представляют SEM (* p < 0,05, ** p < 0,005). Этот рисунок был изменен с предыдущей публикации13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: Список грунтовки используется.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод может использоваться для quantitively определить влияние мутаций специфических генов вкусовые на воспаление в модели мыши DSS-индуцированной IBD. В полной мере воспользоваться, оптимальная индукция IBD является ключевым шагом. Разработка, колитов зависит от нескольких факторов, включая мыши штамм, жилищных условий, кишечной микрофлоры, а также гены интереса. Рекомендуется выполнять эксперимент с небольшое количество мышей, чтобы протестировать различные дозировки и длительности DSS администрации. В ходе эксперимента, брутто такие симптомы, как потеря веса, понос, кишечные кровотечения и некоторые микроскопические изменения, такие как повреждения тканей воспаления, связанные с проникновением иммунных клеток, и должны быть изменения выражения уровня цитокинов проанализированы и по сравнению с контрольными группами, которые имеют питьевой воды без DSS16,,1718,19. Тяжести индуцированных колита могут контролироваться путем анализа ежедневные изменения веса тела мыши и десятки собранных стула в течение периода DSS-лечения. После лечения DSS повреждение тканей может оцениваться H & E окрашивания на замороженные разделы толстой кишки, тогда как проникновение иммунных клеток и выражение уровня цитокинов можно определить и количественно с помощью иммуногистохимии и ПЦР. DSS дозировке, администрация продолжительность и диета может регулироваться выявить тонкие эффекты вкусовые генных мутаций на толстой иммунных реакций. Однако чувствительность этого метода все еще может ограничить его применение для исследования минимального воздействия на некоторых других генов. В этом случае могут быть приняты некоторые изменения; например путем сведения к минимуму переменные из отдельных конкретных кишечной микрофлоры, администрирование антибиотиков.
DSS-индуцированной колит модель использовалась наиболее широко среди химического агента индуцированной IBD моделей, во многом благодаря своей простоте, быстрота, воспроизводимость, управляемости и самое главное его сходство человека язвенный колит, который является полезен при оценке эффективности человека терапии2. Один недостаток, что исследователи должны быть осведомлены о что T и B клетки не требуется для развития колита, которая отличается от развития болезни в организме человека. Однако это может быть полезно для изучения роль иммунной системы в развитии острого колита2.
Это исследование создала модель DSS-индуцированной IBD, с помощью α-gustducin недостаточным мышей, которые могут быть использованы для изучения Роман функции G протеина α субъединицы иммунитет слизистой кишечника и воспаления. Результаты показывают, что мышей не хватает α-gustducin более восприимчивы к DSS-индуцированной колит и сопровождаются более серьезные симптомы, включая повреждение тканей, чрезмерное воспалительных реакций и измененное выражение мощным цитокинов13. По согласованию с недавних выводов об участии вкус как влагалище путей в тип II иммунных реакций кишечника паразитов20, α-gustducin и другие вкус сигнализации белков может иметь роман и важные функции в кишечную иммунной баланс. Однако точные молекулярные механизмы, лежащие в основе этих перекос иммунной реакции по-прежнему быть обнаружены.
Кроме того, этот метод может применяться для изучения воздействия других вкусовых генов, которые выражаются в толстой кишке (например, Переходный рецепторный потенциал ионного канала Trpm5, который имеет решающее значение для сладкое, горькое и умами вкус и выражается в человека толстой 7клеток). Наконец та же стратегия может использоваться открывать новые функции основных белков и факторов кишечного иммунитета и помочь оценить эффективность новых методов лечения некоторых заболеваний человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается за счет субсидий из национального естественных наук фонд Китая (81671016, 31471008 и 31661143030) и национальных институтов здравоохранения (DC010012, DC015819) и Фондом Siyuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), Unit 15 (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), New York, N.Y. 1329-1333 (2016).
