Summary
Her presenterer vi en protokoll for å undersøke effekten av opphør av gustation-relaterte gener på immunreaksjoner i en dekstran sulfate natrium (DSS)-indusert inflammatorisk tarm sykdom (IBD) musemodell.
Abstract
Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er en av de immun-relaterte gastrointestinale lidelser, inkludert ulcerøs kolitt og Crohns sykdom, som påvirker livet kvalitet av millioner av mennesker over hele verden. IBD symptomer inkluderer magesmerter, diaré og endetarms blødning, som kan skyldes samhandlingene tarmen bakterieflora, mat komponenter, intestinal epitelceller og immunceller. Det er spesielt viktig å vurdere hvordan hver nøkkel gen uttrykt i intestinal epitel og immunsystemet cellene påvirker betennelse i tykktarmen. G protein-kombinert smak reseptorer, inkludert G protein delenhet α-gustducin og andre signalnettverk proteiner, har blitt funnet i tarmen. Her bruker vi α-gustducin som en representant og beskriver en dekstran sulfate natrium (DSS)-indusert IBD modell å evaluere effekten av gustatory genet mutasjoner på gut mucosal immunitet og betennelse. Denne metoden kombinerer knockout genteknologi med kjemisk indusert IBD modellen, og dermed kan brukes for å vurdere utfallet av gustatory genet annullering samt andre gener som kan exuberate eller dempe immunrespons DSS-indusert i tykktarmen. Mutant mus administreres med DSS for en bestemt periode der deres kroppsvekt krakk og endetarms blødning overvåkes og registrert. På ulike timepoints under administrasjon, noen mus er euthanized, da størrelser og tykkelser av deres spleens og kolon måles og gut vev er samlet inn og behandlet for histologiske og gene expression analyser. Dataene viser at α-gustducin knockout resultatene i overdreven vekttap, diaré, intestinal blødning, vevsskade og betennelse vs vill-type mus. Siden alvorlighetsgraden av indusert inflammasjon påvirkes av musen stammer, bolig miljø og kosthold, er optimalisering av DSS konsentrasjon og administrasjon varighet i et pilotprosjekt spesielt viktig. Ved å justere disse faktorene, kan denne metoden brukes til å vurdere både anti - og pro-inflammatoriske effekter.
Introduction
De to store formene for inflammatorisk tarmsykdom (IBD), Crohns sykdom (CD) og ulcerøs kolitt (UC) er preget av kronisk remittent eller progressiv inflammatoriske tilstander i tarmen med multifaktoriell etiologi1,2 . Utviklingen av IBD avhenger av genetisk samt visse miljømessige faktorer som kosthold, antibiotikumet use, og viktigst, sykdomsfremkallende infeksjoner. Men er etiologien og regulatoriske molekylære mekanismer underliggende IBD fortsatt uklart. Derfor er mange kjemisk indusert IBD dyremodeller bygget og brukt for å avgrense patogenesen og regulatoriske mekanismer og evaluere effektiviteten av menneskelig therapeutics3.
Smak reseptorer er G protein-kombinert reseptorer (GPCRs) og er klassifisert som to hovedtyper: Skriv inn jeg (T1Rs) og II (T2Rs) oppdage søt umami og bitre stoffene. Smak signalnettverk kaskader er initiert av tastant binding til T1Rs eller T2Rs, aktivere heterotrimeric G proteiner α-gustducin og en Gβγ dimer og fører til utgivelsen av Gβγ underenheter. Gβγ moiety stimulerer igjen nedstrøms effektor enzymet fosfolipase C-β2 (PLC-β2). Aktivert PLC-β2 så hydrolyzes phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate i to intracellulær sekundære budbringere [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacylglycerol] og IP3 binder seg til og åpne kanalen-reseptor IP3 R3, slippe kalsiumioner fra det endoplasmatiske retikulum. Dette fører til slutt til åpningen av forbigående reseptor potensielle ion kanal Trpm5 og utgivelsen av nevrotransmitter ATP til gustatory nerver4,5,6,7. Likevel, signalveier av salte og sure smaker er forskjellige fra og uavhengige fra søt og umami bitter smak8. I tillegg finnes komponentene smak GPCRs og nedstrøms proteiner i ulike ekstra muntlig vev. Studier vist at α-gustducin, er den viktigste komponenten smak signalnettverk, funnet å bli uttrykt i tarmen. Videre studier er nødvendig for å forstå funksjonene til disse smak signalering komponenter i ekstra muntlig vev9,10.
Metoden beskrevet her brukes til å beskrive funksjonene til gustatory signalnettverk proteiner i ekstra muntlig vev. Vi kombinerer en transgene musen linje utviklet for skildre signalnettverk kaskader i smaksløkene med kjemisk indusert kolitt modellen. Hovedsakelig på grunn av sin fremgangsmåter for enkelhet og patologisk likheter med menneskelige ulcerøs kolitt, dekstran sulfate natrium (DSS)-indusert IBD modellen har vært mest brukt blant de ulike kjemisk indusert kolitt modeller11. I denne studien brukte vi α-gustducin-mangelfull mus som en representant musen linje for å avsløre romanen funksjoner α-gustducin i tarmen mucosal immunitet og betennelse av 1) analyserer morfologiske endringer i vevet og 2) assaying forskjeller i uttrykk for cytokiner relatert til betennelse i tykktarmen. Denne metoden kan brukes til kvalitativt og kvantitativt bidrag av gustatory signalnettverk proteiner (og andre proteiner i tarmen) skade på vev og tarm betennelse, når genmodifiserte musen linjer for genene for interesse er tilgjengelig. Fordelene ved denne metoden gjør det mulig for brukere å få integrerte data som følge av både den kjemiske DSS og mangel på genet av interesse. Denne metoden kan forbedres ytterligere å øke sin sensitivitet og avsløre subtile intestinal endringer på mobilnettet og molekylære.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter som involverer mus ble gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer av Zhejiang University. Det anbefales å bruke riktig personlig verneutstyr før du utfører denne protokollen.
1. forberedelse av mus og DSS
- Holde den knockout (α-gustducin- / -) mus og alder, kjønn og kroppen vekt-matchet vill-type kontroll (α-gustducin/ +) C57BL/6 mus individuelt i ren bur.
Merk: Knockout mus har vært backcrossed med C57BL/6 mus for over 20 generasjoner og har en nesten 100% C57BL/6 genetisk bakgrunn. - Oppløse 30 g dekstran sulfate natrium (DSS) pulver i 1 L autoklaveres vann. Bland til løsningen blir klart å sikre at den siste arbeider konsentrasjonen er 3% (w/v).
Merk: DSS løsningen kan lagres ved romtemperatur for opptil 1 uke eller 4 ° C før bruk.
2. induksjon og evaluering av DSS kolitt i mus
- Veier og registrere hver mus er første kroppsvekt. Plasser musene individuelt i standard plastmerder og etiketten merdene.
- Erstatt vanlige drikke vann med 3% DSS løsning for totalt 7 dager som begge grupper av mus har tilgang til ad libitum.
- Måle musen er kroppsvekt, registrere DSS løsning forbruk, og samle og undersøke krakk av hver musen daglig under DSS-administrasjonen. Observere alvorlighetsgraden av diaré og endetarms blødning og konvertere dette til DSS-indusert sykdom indeks12.
- Under eksperimentet beregnes prosentandelen av vekttap sammenlignet med opprinnelig vekt og sykdom indeksen evaluere symptomene på kolitt.
Merk: Sykdom indeksen er scoret ved å kombinere observasjoner av diaré og endetarms blødning og er som følger: 0 (normal avføring, ingen blod), 1 (bløt avføring, ingen blod), 2 (bløt avføring, litt blod), 3 (meget bløt avføring, beskjedne blødning), og 4 (vannaktig avføring, signifikant blødning)12. Sykdom indeksen er analysert daglig for hver musen. - Ved slutten av 7-dagers DSS behandling, ofre musene av cervical forvridning og fortsett med de resterende eksperimentene.
3. forberedelse av vevsprøver
- Plasser musen i supine posisjon og rengjøre huden av abdomen med 70% etanol. Gjør en 3 cm lang midtlinjen snitt i buken med en liten saks å avsløre bukhulen.
- Bruk et par pinsett til å nøye skille milten fra andre vev, deretter fjerne milten og måle størrelsen.
- Identifisere og løft kolon med tang og skiller den fra de omliggende mesentery. Trekk ut hele kolon til cecum og endetarm blir synlig.
- Isolere tykktarmen ved transecting den colonocecal margen og dypt i bekkenet til gratis proksimale og distale kolon, henholdsvis. Deretter måle og registrere lengden på isolerte kolon. Pass på at du ikke skade colonic vevet under dissecting prosedyren.
- Skyll kolon med 10 mL iskald fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) med en 10 mL sprøyte utstyrt med en gavage nål fjerne avføring og blod til eluate er helt klart.
- For histologiske identifisering, dele vevsprøver like i tre deler: proksimale, midtre og distale. Deretter reparere vevet med 4% paraformaldehyde (PFA) natten på 4 ° C.
- For analyse av cytokin uttrykk, fryse hele kolon raskt med flytende nitrogen og lagre den på-80 ° C før bruk.
4. histologiske vurdering av alvorlighetsgraden av DSS-indusert kolitt
- Hematoxylin og eosin (H & E) flekker
- Etter fiksering, dykke vevet i en løsning av 30% sukrose i 1 x PBS overnatter i en 15 mL tube til cryoprotect prøvene.
- Embed vevet i optimal kutte temperatur (OCT) sammensatte og plasserer det på 20 ° C til Tilpasningsverktøy stivner.
- Overføre OCT blokken som inneholder vev til en kryostaten, satt skiven tykkelse i kryostaten 12 µm og skive og samle 12 µm tykke frosne snitt.
- Varme delene samlet vev fra en kryostaten på 65 ° C for 20 min på en kokeplate.
- Vask delene kort i destillert vann. Stain dem med hematoxylin flekk løsning for 5 min og senere skyll med rennende vann fra springen i 5 min.
- Skille delene med 0,5% saltsyre-etanol i 30 s og skyll dem i løpende trykk vann for 1 min. Deretter utfører vask i 1 x PBS for 1 min, og deretter skyll med rennende vann fra springen i 5 min.
- Utføre vask av vev 70%, 75%, 80% og 95% alkohol, hver for 10 s. Counterstain i eosin flekk løsning for 2 min.
- Utføre dehydrering gjennom 95% alkohol og 2 endringer av absolutt alkohol for 5 min hver gang. Klart i 2 endringer av xylen for 5 min.
- Score vevsskade av proksimale, midtre og distale kolonet hvert mus for både genet knockout og vill-type grupper basert på resultatene av den ovenfor H & E flekker.
Merk: Sykdom indeksen er kombinerte poengsummen epithelial skade og betennelser i regionene mucosa, submucosa, muscularis og serosa som er definert som følger: 0 (ingen skade på vev og betennelse), 1 (fokal vevsskade og betennelse), 2 (usammenhengende skade på vev og betennelse), og 3 (diffus vevsskade og betennelse)12,13. Tre scorer pr musen for proksimale, midtre og distale deler av kolon summeres deretter for å få en total poengsum for hvert dyr. Gjennomsnittskarakterer for hver gruppe beregnes deretter.
- Immunohistochemistry14
- Varme delene samlet vev fra en kryostaten på 65 ° C for 20 min på en kokeplate. Legg delene i 1 x PBS 3 ganger, for 10 min. Inkuber avsnittene vev i 3% Hydrogenperoksid i 10 min å eliminere endogene peroxidase. Vask delene 3 ganger. Blokkere vev med blokkerer buffer (3% BSA, 0,3% ikke-ioniske vaskemiddel, 2% geit serum, 0,1% Natriumazid i 1 x PBS) ved romtemperatur 1t eller mer.
- Erstatte blokkerer bufferen med en løsning som inneholder følgende immun celle type-spesifikk primære antistoffer: CD45 for leukocytter, CD3 for T-celler, B220 for B celler, CD11b for makrofager og Ly6G for nøytrofile. Ruge på 4 ° C over natten.
- Fjern primær antistoffer fra vev deler av aspirasjon. Vask avsnittene med 1 x PBS 3 ganger, for 10 min. Inkuber delene med biotinylated sekundære antistoff etterfulgt av inkubasjon med streptavidin-HRP komplekset ved romtemperatur.
- Inkuber delene med 3, 3-diaminobenziding (DAB) løsning å utvikle en lys eller mørk brun farge og visualisere immunoreactive cellene.
- Counterstain delene med hematoxylin og 0,3% (v/v) utvannet ammoniakk. Ta lyse-feltet bilder på 10 X forstørrelse under et mikroskop.
- Bruk et behandlingsprogram for image til å identifisere og telle befolkningen av merket immunceller både epitel og lamina propria (under epitel) av sette 2 masker: Bruk den første masken i funksjonen farge-kube-baserte for å angi en farge oppdagelsen terskelen og måle de fargede DAB-reaktive områdene; bruke andre masken for å bestemme total områder av epitel og laminær propria i delen undersøkt. Ekspress immunoreactive celle befolkningen som en av flekker infiltrere cellene til det totale området av undersøkt vev.
5. Gene Expression vurdering av DSS-indusert kolitt
- Hente kolon vev fra DSS-behandlet genet knockout og vill-type mus fra-80 ° C fryser legge 0,6 mL lyseringsbuffer til 25 mg av vev, og homogenize i en homogenizer.
- Følg den RNA utvinning kit-protokollen for å pakke ut den totale RNA og DNase jeg brukes til å eliminere noen forurensende genomisk DNA.
- Kjøre en agarose gel for å sjekke kvaliteten på den utpakkede RNA. Hvis dens 28S RNA bandet er lysere enn 18S bandet, er det brukbart. Ta 1 µL av RNA prøve å bestemme RNA konsentrasjonen på et microspectrophotometer.
- Mix 1 µg av den totale med 2,5 µL av 20 mM oligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 primere og 1 µL av Moloney murine leukemi virus (MMLV) revers transkriptase. Ruge på 42 ° C for 60 min å forberede til cDNA.
- Definere sanntid PCR reaksjoner ved å blande 1µL av cDNA med 0,5 µL i revers qPCR primere for TNF, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-10, TGF-β1 og β-utgangen som en kontroll i tillegg til 2 x fluorescerende grønt fargebad.
- Løpe qPCR med følgende parametere: 95 ° C i 10 min, etterfulgt av 45 sykluser av 95 ° C for 10 s, 50 ° C for 25 s og 72 ° C for 20 s.
- Beregne den relative kvantifiseringen av genuttrykk ved hjelp av de 2-ΔΔCt metoden15. Forholdsvis analysere gene expression nivåene i knockout vs. vill-type mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En DSS-indusert IBD prosedyre ble etablert av administrere 3% DSS i drikkevann α-gustducin-knockout (KO) og vill-type (WT) mus. Sammenlignet med WT mus, utstilt knockout musene mer alvorlig kolitt med overdreven vekttap, diaré og intestinal blødning (figur 1). Etter en 7 dagers DSS administrasjon, forskjellene i vev integritet ble analysert med H & E flekker som histologiske metode og mer forverret vevsskade ble funnet i det proksimale, midtre og distale kolon av knockout mus enn i WT mus ( Figur 2). Videre overdreven immun aktiveringen førte til kolitt med infiltrasjon av ulike inflammatoriske celler som makrofager og nøytrofile. Immunohistochemical analyser ved hjelp av en rekke indikatorer for immunceller ble utført for å avgjøre om den α-gustducin mangelen påvirket immun celle infiltrasjon. Komparativ analyse viste at infiltrasjon av leukocytter, nøytrofile og makrofager var betydelig økt i knockout mus sammenlignet WT kontroll mus (Figur 3). Endelig var noen cytokin uttrykk nivåer i kolon DSS-indusert kolitt mus bestemmes ved hjelp av qPCR med Gen-spesifikke primere. Resultatene viste at i forhold til WT mus, knockout musene hadde høyere uttrykk nivåer av TNF og IFN-γ men lavere uttrykk nivåer av IL-5, IL-13 og IL-10; men ble ingen forskjell sett i uttrykket nivået av TGF-β1 mellom knockout og WT mus (Figur 4).
Figur 1 : DSS administrasjon gjengir mer alvorlig kolitt i α-gustducin knockout (KO). (A) prosenten av kropp vekttap: KO mus vises betydelig mer kropp vekttap fra dag 3. (B) kolitt sykdom indeksen basert på alvorlighetsgraden av diaré og endetarms blødning: KO mus viste signifikant større sykdom indekser enn WT kontroller. (C) kolon (øvre panel) og milt (nedre paneler) fra representant WT og KO mus 7 dager innlegg-DSS administrasjon: KO musene hadde betydelig kortere kolon og større spleens. Feilfelt representerer SEM (* p < 0,05, ** p < 0.005, *** p < 0,0005; VARIANSANALYSE med post hoc t-tester). Skala bar = 1 cm. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Α-gustducin KO mus Vis mer alvorlig skade på vev etter DSS behandling. (A) H & E farging av kolon vev fra WT og α-gustducin KO mus ikke behandles med DSS (vann) eller behandlet med DSS i 7 dager (DSS). (B) vev skade resultater basert på histologiske farging av kolon vev fra WT og KO mus 7 dager etter DSS administrasjon. DSS behandling indusert noe vevsskade i WT kolon, som var mye verre i KO prøven. Feilfelt representerer SEM (* p < 0,05). Skala bar = 50 µm. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Α-gustducin KO mus vise økt infiltrasjon av immunceller i DSS-indusert kolitt. (A) Massive immun celle infiltrasjon i kolon DSS-behandlet KO mus. (B) kvantifisering av immun cellen tallene: andelen immunostained områder delt på det totale området av målt vev basert på bildet analyser. Feilfelt representerer SEM. skala bar = 50 µm. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Α-gustducin KO mus vise ulike uttrykk nivåene av immun cytokiner i DSS-indusert kolitt. DSS behandling økt uttrykk for TNF og IFN-γ og redusert uttrykk for IL-5, IL-13 og IL-10 i KO mus kolon forhold til WT mus. Sanntid kvantitative RT PCR ble utført ved hjelp av gen-spesifikke primere. Β-utgangen ble brukt som en intern kontroll genet. Feilfelt representerer SEM (* p < 0,05, ** p < 0.005). Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon13. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Liste over primere brukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden kan brukes til å quantitively fastslå effekten av mutasjoner av bestemte gustatory gener på betennelse i en DSS-indusert IBD musemodell. For å utnytte, er optimal induksjon av IBD avgjørende. Utviklingen av kolitt påvirkes av flere faktorer, inkludert mus belastning, bolig miljø, tarm mikroflora, samt gener av interesse. Det anbefales å utføre et pilotprosjekt med et lite antall mus å teste ulike doser og varighet for DSS administrasjon. Under pilotprosjekt, brutto symptomer som vekttap, diaré, intestinal blødning og mikroskopiske endringer som vevsskade, betennelse forbundet med immun celle infiltrasjon, og uttrykket nivå endringer av cytokiner bør være analysert og sammenlignet som har drikkevann uten DSS16,17,18,19. Alvorlighetsgraden av indusert kolitt kan overvåkes ved å analysere daglige endringer i musen kroppsvekt og score av samlet avføring under DSS-behandlingen perioden. Etter DSS behandling, kan vevet skaden vurderes av H & E flekker på frosne deler av kolon, mens infiltrasjon av immunceller og uttrykk nivåer av cytokiner kan identifiseres og kvantifisert ved hjelp av immunohistochemistry og qPCR. DSS dosering og administrasjon varighet kosthold kan justeres for å avdekke subtile effekter av gustatory genet mutasjoner på colonic immunreaksjoner. Følsomhetsnivået til denne metoden kan imidlertid fortsatt begrense sin søknad til studier på minimal effekter av noen andre gener. I dette tilfellet kan noen endringer adoptert; for eksempel ved å minimere variablene fra enkelte-spesifikke intestinal mikroflora av administrere antibiotika.
DSS-indusert kolitt modellen er brukt mest omfattende blant kjemiske agent-indusert IBD modeller, hovedsakelig på grunn av sin enkelhet, hurtighet, reproduserbarhet, kontrollerbarhet og viktigst sin likheter menneskelige ulcerøs kolitt, som er nyttig til å evaluere effektiviteten av menneskelig therapeutics2. En ulempe forskere må være klar over er at T og B-cellene er ikke nødvendig for utvikling av kolitt, som er forskjellig fra utvikling av sykdom hos mennesker. Imidlertid kan det være nyttig for å studere rollen til det medfødte immunsystemet i utviklingen av akutt kolitt2.
Denne studien har etablert en DSS-indusert IBD modell med α-gustducin-mangelfull mus, som kan brukes til å undersøke romanen funksjoner av G protein α delenhet i gut mucosal immunitet og betennelse. Resultatene viser at mus mangler α-gustducin er mer utsatt for DSS-indusert kolitt og ledsages av mer alvorlige symptomer, inkludert vevsskade, overdreven inflammatorisk svar og endret uttrykk potente cytokiner13. Med nyere funn som indikerer involvering av smak-lignende chemosensory stier i type II immunreaksjoner gut parasitter20, α-gustducin og andre smak signalering proteiner kan ha romanen og viktige funksjoner i den intestinal immun balanse. Men gjenstår nøyaktig molekylære mekanismer underliggende disse skjev immunreaksjoner for å bli avdekket.
Videre er denne metoden kan brukes for å studere virkningene av andre gustatory gener som uttrykkes i tykktarmen (f.eks forbigående reseptor potensielle ion kanalen Trpm5, som er søt og bitter umami smak og uttrykt i menneskelig colonic cellene7). Til slutt, samme strategi kan brukes til å oppdage nye funksjoner viktige proteiner og faktorer i intestinal immunitet og å vurdere effektiviteten av romanen behandlinger av visse menneskelige sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet av tilskudd fra nasjonale naturvitenskap Foundation of China (81671016, 31471008 og 31661143030) og National Institutes of Health (DC010012, DC015819) og av Siyuan Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), Unit 15 (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), New York, N.Y. 1329-1333 (2016).
