Summary
Burada dextran sülfat sodyum (DSS) bağışıklık yanıtı düşmesi tadına bakma ilgili genlerin etkisini araştırmak için bir protokol mevcut-inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) fare modeli indüklenen.
Abstract
İltihabi bağırsak hastalığı (IBD) ülseratif kolit ve Crohn hastalığı, dünyanın her yerinden insanlar milyonlarca yaşam kalitesini etkileyen dahil bağışıklık ile ilgili gastrointestinal bozukluklar biridir. IBD belirtileri karın ağrısı, ishal ve rektal kanama, hangi gut microbiota, gıda bileşenleri, Bağırsak epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimler neden olabilir içerir. Bağırsak epitel ve bağışıklık hücreleri ifade her anahtar gen kolon iltihabı nasıl etkileyeceğini değerlendirmek için önem taşımaktadır. G protein birleştiğinde tat reseptörleri G protein alt birimi α-gustducin ve sinyal diğer proteinler de dahil olmak üzere, bağırsaklarında bulduk. Burada, bir temsilcisi olarak α-gustducin kullanırız ve dextran sülfat sodyum (DSS) tarif-tat gen mutasyonlarının gut mukozal bağışıklık ve iltihap üzerindeki etkisini değerlendirmek için IBD modeli indüklenen. Bu yöntem gen nakavt teknoloji kimyasal olarak indüklenen IBD modeli ile birleştirir ve böylece yanı sıra exuberate ya da kolon DSS kaynaklı bağışıklık yanıtı nemlendirin diğer genler tat gen düşmesi sonucu değerlendirmek için uygulanabilir. Mutasyona uğramış fareler DSS ile hangi sırasında kendi vücut ağırlığı, dışkı ve rektal kanama izlenen kaydedildi ve belirli bir süre için uygulanmaktadır. Yönetimi sırasında farklı timepoints are euthanized bazı fareler, daha sonra boyutları ve ağırlıkları dalağı ve iki nokta üst üste ölçülür ve gut doku toplanan ve için işlenen histolojik ve gen ifade analizleri. Verileri bu aşırı kilo kaybı, ishal, bağırsak kanaması, doku hasarı ve iltihap vs. wild-tipi fareler α-gustducin nakavt sonuçları göster. İndüklenen enflamasyonu şiddeti fare suşları, konut çevre ve diyet tarafından etkilenir, DSS konsantrasyon ve yönetim süresi bir pilot deneyinde duruma getirilmesi özellikle önemlidir. Bu faktörler ayarlayarak, bu yöntem her iki anti - ve pro-inflamatuar etkileri değerlendirmek için uygulanabilir.
Introduction
İltihabi bağırsak hastalığı (IBD), Crohn hastalığı (CD) ve ülseratif kolit (UC) iki ana türde koşullarından kronik remittent ya da ilerici inflamatuar bağırsak multifaktöriyel etyoloji1,2 ile karakterizedir . IBD gelişimi diyet, antibiyotik kullanımı, genetik gibi belirli çevresel faktörlere bağlıdır ve önemlisi, patojenik enfeksiyonlar. Ancak, etyoloji ve IBD temel yasal moleküler mekanizmaları hala pek açık değildir. Bu nedenle, çok sayıda kimyasal olarak indüklenen IBD hayvan modelleri inşa edilmiş ve patogenez ve düzenleyici mekanizmaları betimlemek ve insan tedavi3etkinliğini değerlendirmek için uygulanan.
Tat reseptörleri G protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) vardır ve iki önemli türü sınıflandırılır: tip ı (T1Rs) ve tatlı, umami ve acı bileşikleri algılayan II (T2Rs) yazın. Tat sinyal cascades tastant T1Rs veya T2Rs, heterotrimeric aktive α-gustducin ve Gβγ dimer oluşan ve Gβγ alt birimleri serbest bırakmak için önde gelen G protein bağlama tarafından başlatılır. Gβγ yan sırayla aşağı akım efektör enzim Fosfolifaz C-B2 (PLC-B2) uyarır. Aktif PLC-B2 sonra iki hücre içi ikincil haberci [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) ve diacylglycerol] ve IP3 bağlanır içine phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate dag ve kanal-reseptör IP3 açmak R3, endoplazmik retikulum gelen kalsiyum iyonları serbest. Bu sonunda geçici reseptör potansiyel iyon kanal Trpm5 açılması ve serbest bırakmak-in nörotransmitter ATP tat sinirler4,5,6,7üzerine yol açar. Ancak, farklı ve bağımsız sinyal yollar tuzlu ve ekşi tadı tatlı, umami ve acı tadı8vardır. Buna ek olarak, tat GPCRs bileşenleri ve aşağı akım proteinler çeşitli ekstra oral dokularda mevcut. Son yıllarda yapılan çalışmalarda bu α-gustducin belirtilen, tat sinyal, asıl bileşen bulunan bağırsak mukoza ifade edilecek. Daha fazla çalışmaları ekstra oral doku9,10bileşenlerinde sinyal bu tadı işlevlerini anlamak için ihtiyaç vardır.
Burada açıklanan yöntemi tat sinyal proteinlerin ekstra oral dokularda işlevleri tanımlamak için kullanılır. Biz kimyasal olarak bağlı kolit modeli ile damak tadınızı sinyal Cascade'lerde operasyona için geliştirilen bir transgenik fare çizgi birleştirmek. Yordam sadeliği ve insan ülseratif kolit patolojik benzerlikler nedeniyle büyük ölçüde, dextran (DSS) sodyum sülfat-indüklenen IBD modeli en yaygın olarak kullanılan çeşitli kimyasal olarak bağlı kolit modelleri11arasında. Bu çalışmada, α-gustducin-eksik fareler bir temsilcisi fare çizgi olarak α-gustducin roman fonksiyonları gut mukozal bağışıklık ve iltihap 1) morfolojik değişiklikler doku analiz ve 2) raporlaması ifade farklılıkları ortaya çıkarmak için kullandığımız sitokinler kolon iltihabı ile ilgili. Bu yöntem genler için genetik olarak değiştirilmiş fare hatları ne zaman nicelik ve nitelik tat sinyal proteinleri (ve diğer proteinlerin gut) doku hasarı ve bağırsak iltihabı, belirlemek için kullanılabilir faiz mevcuttur. Bu yöntemin avantajları, olanaklı kılmak kullanıcı-eylemleri hem kimyasal DSS ve gen ilgi eksikliği kaynaklanan entegre verileri elde etmek. Bu yöntem, hassasiyeti artırmak ve ince bağırsak değişiklikler, hücresel ve moleküler düzeyde ortaya çıkarmak için daha fazla geliştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareler içeren tüm deneylerin incelenmeli ve kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteler Zhejiang Üniversitesi tarafından onaylanmalıdır. Bu iletişim kuralı kullanmadan önce uygun kişisel koruyucu ekipman giymek için tavsiye edilir.
1. fareler ve DSS hazırlık
- Nakavt (α-gustducin- / -) fareler ve yaş-, cinsiyet ve vücut ağırlığı eşlemeli vahşi tipi kontrol tutmak (α-gustducin+ / +) C57BL/6 fareler temiz kafeslerde tek tek.
Not: Nakavt fareler ile C57BL/6 fareler üzerinde 20 nesiller için backcrossed ve neredeyse % 100 C57BL/6 genetik deneyimliyim. - 30 g dextran sülfat sodyum (DSS) tozu 1 L autoclaved su içinde çözülür. Çözüm son çalışma konsantrasyonu % 3 (w/v) olduğundan emin olmak için açık hale gelinceye kadar karıştırın.
Not: DSS çözüm için 1 hafta kadar oda sıcaklığında veya 4 ° c kadar kullanmak depolanabilir.
2. indüksiyon ve DSS kolit farelerde değerlendirilmesi
- Tartmak ve her fare ilk vücut ağırlığı kaydetmek. Fareyi tek tek standart plastik kafes yerleştirin ve kafesleri etiket.
- Normal içme suyu için 7 gün için her iki grupta fareler var toplamda % 3 DSS çözüm ile Değiştir ad libitumerişin.
- Fare vücut ağırlığı ölçmek, DSS çözüm tüketimi, kayıt ve toplamak ve günlük DSS yönetimi sırasında her fare dışkı inceleyin. Önem düzeyi ishal ve rektal kanama gözlemlemek ve bu DSS kaynaklı hastalık Dizin12' ye dönüştürmek.
- Deneme sırasında ilk ağırlık ve hastalık dizin göre kilo kaybı yüzdesi kolit belirtileri değerlendirmek için hesaplanır.
Not: Hastalık Dizin ishal ve rektal kanama gözlemleri birleştirerek attı ve aşağıdaki gibi tanımlanır: 0 (normal dışkı, kan yok), 1 (yumuşak dışkı, kan yok), 2 (yumuşak dışkı, kan), 3 (çok yumuşak dışkı, mütevazı kanama) ve 4 (sulu dışkı, önemli kanama)12. Hastalık Dizin her gün her fare için analiz edilir. - 7 günlük DSS tedavi sonunda, fareler tarafından servikal çıkığı kurban ve kalan deneyler ile devam edin.
3. doku örneği hazırlanması
- Sırtüstü pozisyonda fareyi getirin ve karın % 70 etanol ile cilt temiz. 3 cm uzunluğundaki ensizyon karın karın boşluğu ortaya çıkarmak için küçük makas ile dikmek.
- Forseps çifti dikkatle dalak diğer dokulardan ayırın sonra dalak kaldırmak ve boyutunu ölçmek için kullanın.
- Tanımlamak ve iki nokta üst üste forseps ile Asansör ve çevresindeki bıçaklanmasından ayırmak. Çekum ve rektum görünür hale gelene kadar tüm kolon çekin.
- İki nokta üst üste colonocecal kenar boşluğuna ve derin proksimal ve distal kolon, sırasıyla boşaltmak için leğen kemiği transecting izole et. O zaman, ölçmek ve izole kolon uzunluğu kaydedin. Kolon doku parçalanmış işlem sırasında zarar vermemeye dikkat et.
- İki nokta üst üste ile buz gibi fosfat tamponlu tuz (PBS) 10 mL kan ve dışkı eluate tamamen temizlenene kadar kaldırmak için bir sonda ile besleme iğne ile donatılmış bir 10 mL şırınga ile yıkayın.
- Histolojik kimlik için doku örnekleri eşit üç parçaya bölün:, orta, proksimal ve distal. Sonra dokuya %4 paraformaldehyde (PFA) ile gecede 4 ° C'de düzeltmek
- Sitokin ifade analizi için sıvı azot ile hızla tüm kolon dondurma ve-80 ° C'de kadar kullanmak saklayın.
4. histolojik DSS kaynaklı kolit şiddeti değerlendirilmesi
- Hematoksilen ve eozin (H & E) boyama
- Fiksasyon sonra % 30 sükroz 1 x PBS geceleme 15 mL tüp içinde bir çözümde doku örnekleri için cryoprotect daldırın.
- Doku en uygun kesme sıcaklığında (OCT) bileşik katıştırmak ve OKT sertleşir kadar-20 ° C'de yerleştirin.
- Bir cryostat için doku içeren OCT blok transfer, cryostat 12 µm ve dilim kalınlığı arama ayarlayın ve 12 µm kalınlığında donmuş bölümlerde toplamak.
- 65 ° c cryostat 20 dk sıcak tabakta için toplanan doku bölümlerden ısı.
- Distile su kısaca bölümlerde yıkayın. Onlara çözüm 5 min için boyama hematoksilen ile leke ve daha sonra 5 min için dokunun su ile durulama.
- % 0.5 hidroklorik asit-etanol 30 s ve onları kaçmanın musluk suyu 1 dk. için durulama için bölümlerle ayırt etmek. Daha sonra 1 x PBS 1 dk. için yıkama gerçekleştirmek ve daha sonra 5 min için dokunun su ile durulama.
- Çamaşır doku bölümlerin % 70, % 75, % 80 ve % 95 alkol, her 2 min için çözüm boyama eozin 10 s. Counterstain için gerçekleştirin.
- Dehidratasyon % 95 alkol ve mutlak alkol 2 değişiklik her zaman 5 min için gerçekleştirin. Ksilen 5 min için 2 değişiklik içinde açık.
- Doku hasarı her fare, orta, proksimal ve distal kolonun gen nakavt ve H & E yukarıdaki boyama sonuçlarına göre yaban-tipi grupları için puan.
Not: Hastalık dizinidir epitel hasar ve aşağıdaki gibi tanımlanır inflamasyon mukoza, submukoza, muscularis ve serosa bölgelerde kombine bir puan: 0 (doku hasarı ve iltihabı), 1 (odak doku hasarı ve iltihabı), 2 (düzensiz doku hasarı ve iltihabı) ve 3 (diffüz doku hasarı ve iltihabı)12,13. İki nokta üst üste, orta, proksimal ve distal bölümleri için fare başına üç puanları sonra her hayvan için bir toplam puan elde etmek için toplanır. Her grup için ortalama puanları sonra hesaplanır.
- İmmünhistokimya14
- 65 ° c cryostat 20 dk sıcak tabakta için toplanan doku bölümlerden ısı. Bölümleri 1 x PBS 3 kez, 10 dakika yıkayın. %3 hidrojen peroksit endojen peroksidaz ortadan kaldırmak 10 min için doku bölümlerde kuluçkaya. Bölüm 3 kez daha yıkayın. Dokular, oda sıcaklığında 1 h için arabellek (% 3 BSA, %0,3 non-iyonik deterjan, % 2 keçi serum, % 0,1 Sodyum azid 1 x PBS) veya daha fazla engelleme ile engelleyin.
- Engelleme arabellek aşağıdaki bağışıklık hücre türüne özgü birincil antikorlar içeren bir çözüm ile değiştirmek: CD45 lökosit için CD3 T hücreler için B hücreleri için B220, CD11b için makrofajlar ve nötrofiller için Ly6G. 4 ° C'de gecede kuluçkaya.
- Birincil antikorlar tarafından aspirasyon doku bölümleri kaldırın. 1 x PBS 3 kez, 10 min için bölümlerle yıkayın. Kuluçka streptavidin-HRP kompleksi, oda sıcaklığında ve ardından biotinylated ikincil antikor ile bölümleri kuluçkaya.
- Bir açık ya da koyu kahverengi renk geliştirmek ve immunoreactive hücreleri görselleştirmek için 3, 3'-diaminobenziding (DAB) çözüm bölümlerle kuluçkaya.
- Bölümleri Hematoksilen ve % 0,3 (v/v) sulandırılmış amonyak counterstain. Alan parlak görüntüleri 10 X büyütme mikroskop altında atın.
- Tarafından tanımlamak ve işaretli bağışıklık hücreleri epitel ve lamina propria (epitel altında) nüfusu ölçmek için bir görüntü işleme programı kullanın 2 maskeleri ayarlama: ilk maske renk algılama ayarlamak için renk-küp temel alan özellik kullanın eşik ve renkli DAB-reaktif alanları; kırılan ikinci maske epitel ve laminer propria muayene bölümünde toplam alanları belirlemek için kullanın. Muayene doku Ümumi sahəsi infiltre hücrelere boyama alanında bir oranı olarak immunoreactive hücre nüfusu hızlı.
5. gen ifade değerlendirme DSS kaynaklı kolit
- DSS-tedavi gen nakavt ve-80 ° C dondurucu dan farelerde vahşi-tip kolon doku almak ve doku için 25 mg lizis arabelleği 0.6 mL ekleyin, sonra bir homogenizer homojenize.
- Toplam RNA ve herhangi bir bulaşıcı genomik DNA ortadan kaldırmak için kullanılır DNaz ayıklamak için RNA ayıklama Kit'in Protokolü izleyin.
- Ayıklanan RNA kalitesini kontrol etmek için bir özel jel çalıştırın. Kendi 28S RNA bandı 18S grup parlak ise, kullanışlı olur. Bir microspectrophotometer üzerinde RNA konsantrasyonu belirlemek için RNA örnek 1 µL al.
- 20 mM oligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 astar 2.5 µL ve 1 µL Moloney fare lösemi ile toplam RNA'ın Mix 1 µg virüs (MMLV) transkriptaz. CDNA hazırlamak 60 dk 42 ° C'de kuluçkaya.
- CDNA 1µL ileriye ve geriye doğru qPCR astar 0.5 µL ile IFN γ, Il TNF için karıştırma tarafından gerçek zamanlı PCR reaksiyonları ayarla-5, IL-13, IL-10, TGF-β1 ve β-aktin ek olarak 2 x floresan yeşil boya kontrol olarak.
- QPCR aşağıdaki parametrelerle çalıştırın: 45 95 ° C devredir 10 95 ° C 10 dk, ardından s, 50 ° C 25 s ve 72 ° C 20 s.
- Gen ifadesinin göreli miktar 2-ΔΔCt yöntemi15kullanarak hesaplar. Nispeten nakavt vsgen ifade seviyelerinde analiz. o farelerde tip vahşi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DSS kaynaklı IBD yordamı % 3 yöneten tarafından kurulmuştur DSS α-gustducin-nakavt (KO) ve vahşi-tipi (WT) fareler için içme suyu. WT fareler için karşılaştırıldığında, nakavt fareler daha şiddetli kolit aşırı kilo kaybı, ishal ve bağırsak (Şekil 1) kanama ile sergiledi. 7 gün DSS yönetim sonra doku bütünlüğü farklılıkları H & E histolojik yöntemi olarak boyama kullanarak analiz edildi ve daha ağırlaştırılmış doku hasarı nakavt fareler WT farelerde ( , orta, proksimal ve distal virgülle bulundu Şekil 2). Ayrıca, aşırı bağışıklık harekete geçirmek kolit makrofajlar ve nötrofiller gibi çeşitli inflamatuar hücre infiltrasyonu ile yol açtı. İmmunohistokimyasal analizleri için bağışıklık hücreleri işaretçileri kullanarak α-gustducin eksikliği bağışıklık hücre infiltrasyonu etkilenen olup olmadığını belirlemek için yapılmıştır. Karşılaştırmalı analizi lökosit, nötrofiller ve makrofajlar infiltrasyonu önemli ölçüde WT kontrol fareler (Şekil 3) karşılaştırıldığında nakavt farelerde artış gösterdi. Son olarak, iki nokta üst üste DSS kaynaklı kolit farelerin bazı sitokin ifade seviyelerinde qPCR ile gene özgü primerler kullanılarak belirlenmiştir. Sonuçları gösterdi ki WT fareler için karşılaştırıldığında daha yüksek ifade düzey TNF ve IFN γ ama IL-5, IL-13 ve IL-10; ifade düzeyi düşük nakavt fareler vardı Ancak, TGF-β1 ifade düzeyinde nakavt ve WT fareler (Şekil 4) arasında hiçbir fark görülmüş.
Resim 1 : DSS yönetim işler daha şiddetli kolit α-gustducin altını gizleme (KO). Vücut kilo kaybı yüzdesi(a): KO fareler görüntülenen 3 gün'den başlayan önemli ölçüde daha fazla vücut kilo kaybı. (B) kolit hastalığı Dizin ishal ve rektal kanama şiddetine bağlı: KO fareler WT denetimlerden daha önemli ölçüde daha fazla hastalık endeksleri gösterdi. (C) iki nokta üstüste (üst paneli) ve dalak (alt panelleri) temsilcisi WT ve KO fareler 7 gün sonrası-DSS Yönetimi'nden: KO fareler vardı önemli ölçüde daha kısa iki nokta üst üste ve daha büyük dalaklar. Hata çubukları temsil SEM (* p < 0,05, ** p < 0.005, *** p < 0.0005; ANOVA ile öğleden hoc t-testleri). Ölçek çubuğu 1 cm =. Bu rakam bir önceki yayın13değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : α-gustducin KO fareler daha şiddetli doku hasarı DSS tedavi aşağıdaki göster. (A) H & DSS (su) ile tedavi değil WT ve α-gustducin KO fareler gelen iki nokta üst üste dokuların boyama veya DSS ile 7 gün (DSS) kabul E. (B) doku yaralanması puanları dayalı histolojik WT ve KO fareler gelen iki nokta üst üste dokuların 7 gün sonra DSS yönetim boyama üzerinde. DSS tedavi hangi KO numune çok daha kötü WT iki nokta üst üste, bazı doku zarar indüklenen. Hata çubukları temsil SEM (* p < 0,05). Ölçek çubuğu 50 µm =. Bu rakam bir önceki yayın13değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : α-gustducin KO fareler görüntülemek artmış bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu DSS kaynaklı kolit. (A)büyük bağışıklık hücre infiltrasyonu içinde iki nokta üst üste DSS tedavi KO fareler. (B) miktar bağışıklık hücre sayı: ölçülen doku Toplam alan tarafından bölünmüş immunostained alanlarda yüzdesine dayanarak görüntü analizleri üzerinde. Hata çubukları temsil SEM ölçek çubuk = 50 µm. Bu rakam bir önceki yayın13değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : α-gustducin KO fareler görüntülemek bağışıklık sitokinler düzeyde farklı ifade DSS kaynaklı kolit. DSS tedavi TNF ve IFN γ ifadesi arttı ve ifade IL-5 azalmıştır, IL-13 ve IL-10 KO fareler iki nokta üst üste'WT fareler için karşılaştırıldığında. Gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR gene özgü primerler kullanılarak gerçekleştirildi. Β-aktin bir iç kontrol gen kullanıldı. Hata çubukları temsil SEM (* p < 0,05, ** p < 0.005). Bu rakam bir önceki yayın13değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: Kullanılan astar listesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem quantitively için istihdam edilecek özel tat gen mutasyonlar etkisi iltihap DSS kaynaklı IBD fare modeli belirlemek. Tam olarak yararlanmak için en iyi indüksiyon IBD önemli bir adımdır. Kolit gelişimi fare zorlanma, konut çevre, barsak mikroflorası yanı sıra ilgi genler de dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından etkilenir. Bu fareler farklı dozlarda test etmek için az sayıda ve süreleri DSS yönetim ile bir pilot deneme gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Sırasında pilot deney, kilo kaybı, ishal, bağırsak kanaması ve doku hasarı gibi mikroskobik bazı değişiklikler gibi brüt belirtiler, iltihap bağışıklık hücre infiltrasyonu ile ilişkili ve sitokinler, ifade düzeyinde yapılan değişiklikler olmalıdır analiz ve içme suyu DSS16,17,18,19olmadan var kontrol grubu ile karşılaştırıldığında. Şiddeti indüklenen kolit DSS-tedavi süresi boyunca fare vücut ağırlığı ve toplanan dışkı puanları günlük değişiklikleri analiz ederek izlenebilir. DSS tedaviden sonra doku hasarı Oysa bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu ve sitokinler düzeyde ifade belirlenebilir ve immünhistokimya ve qPCR kullanarak sayısal H & E iki nokta üst üste, donmuş bölümlerinde boyama tarafından tespit edilebilir. DSS dozaj, yönetim süresi ve diyet ince tat gen mutasyonlarının kolon bağışıklık yanıtı üzerine etkilerini ortaya çıkarmak için ayarlanabilir. Ancak, bu yöntem duyarlılığını hala en az etkileri konusunda çalışmalar onun uygulamaya diğer bazı genlerin sınırlayabilir. Bu durumda, bazı değişiklikler kabul edilebilir; Örneğin, birey özgü barsak mikroflorası değişkenlerin antibiyotik yöneten en aza indirerek.
DSS kaynaklı kolit modeli en yoğun kimyasal ajan kaynaklı IBD modeller arasında büyük ölçüde nedeniyle sadeliği, hız, tekrarlanabilirlik, kontrol edilebilirlik ve en önemlisi onun benzerlikler olduğunu insan ülseratif kolit için kullanılan insan tedavi2etkinliğinin değerlendirilmesinde yararlı. Bir dezavantaj araştırmacılar farkında olmalıdır bu T ve B hücreleri insanlarda hastalık gelişimi farklıdır kolit gelişimi için gerekli değildir. Ancak, doğuştan gelen bağışıklık sisteminin akut kolit2gelişiminde rolü eğitim için yararlı olabilir.
Bu çalışmada gut mukozal bağışıklık ve inflamasyon G protein α alt birimi roman fonksiyonlarını araştırmak için kullanılan α-gustducin-eksik fare kullanarak DSS kaynaklı IBD modeli kurmuştur. Sonuçlar α-gustducin eksik fare DSS kaynaklı kolit için daha duyarlı ve doku hasarı, aşırı inflamatuar yanıt ve güçlü sitokinler13değişmiş ifade gibi daha ciddi belirtiler tarafından yayımlanır gösterir. Son bulgular ile anlaşma türü II bağışıklık yanıtı bağırsak parazitleri20, α-gustducin ve roman ve önemli fonksiyonları proteinler bağırsak içinde olabilir sinyal diğer tat tat gibi chemosensory Yollar tutulumu gösteren bağışıklık denge. Ancak, bu çarpık bağışıklık yanıtı yatan tam moleküler mekanizmaları ortaya olmak kalır.
Ayrıca, bu yöntem üst üste ifade edilir diğer tat genler etkilerini incelemek için uygulanan (örneğin, tatlı, acı ve umami beğeni ve olarak gösterilen insan kolon için kritik olan geçici reseptör potansiyel iyon kanalı Trpm5, hücreleri7). Son olarak, aynı stratejiyi anahtar protein ve faktörler yeni fonksiyonlar bağırsak bağışıklık keşfetmek ve insan bazı hastalıkların yeni tedavilerin etkinliğini değerlendirmenize yardımcı olmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser hibe Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (81671016, 31471008 ve 31661143030) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (DC010012, DC015819) ve Siyuan Vakfı tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), Unit 15 (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), New York, N.Y. 1329-1333 (2016).
