Summary
Her præsenterer vi en protokol for at undersøge effekten af annulleringen af gustation-relaterede gener på immunrespons i en dextran sulfat natrium (DSS)-induceret inflammatoriske tarm sygdom (IBD) musemodel.
Abstract
Inflammatorisk tarmsygdom (IBD) er en af de immun-relaterede gastrointestinale lidelser, herunder colitis ulcerosa og Crohns sygdom, der påvirker livskvalitet for millioner af mennesker verden over. IBD symptomer omfatter smerter i underlivet, diarré, og rektal blødning, som kan følge af samspillet mellem gut mikrobiota, LEVNEDSMIDDELBESTANDDELE, intestinal epitelceller og immunceller. Det er særligt vigtigt at vurdere, hvordan hver nøglen gen udtrykt i tarm epitel og immun celler påvirker betændelse i tyktarmen. G protein koblede smag receptorer, herunder G protein-underenheder α-gustducin og andre signaling proteiner, er blevet fundet i tarmene. Her bruger vi α-gustducin som en repræsentant og beskrive en dextran sulfat natrium (DSS)-induceret IBD model til at vurdere effekten af gustatoriske genmutationer på gut mucosal immunitet og betændelse. Denne metode kombinerer genteknologi knockout med de kemisk inducerede IBD model, og dermed kan anvendes til at vurdere resultaterne af gustatoriske gen annulleringen samt andre gener, der kan exuberate eller dæmpe den DSS-induceret immunrespons i tyktarmen. Mutant-mus administreres med DSS i en vis periode, hvor deres kropsvægt, taburet og rektal blødning er overvåget og registreret. Ved forskellige timepoints under administration, nogle mus er euthanized, derefter størrelser og vægte af deres milt og koloner måles og gut væv er indsamlet og behandlet histologiske og gen expression analyser. Dataene viser, at α-gustducin knockout resultater i overdreven vægttab, diarré, intestinal blødning, vævsskader og betændelse vs. wild-type mus. Da sværhedsgraden af induceret inflammation er ramt af musen stammer, boliger miljø og kost, er optimering af DSS koncentration og administration varighed i et pilotprojekt særlig vigtig. Ved at justere disse faktorer, kan denne metode anvendes til at vurdere både anti - og pro-inflammatoriske effekter.
Introduction
De to vigtigste former for inflammatorisk tarmsygdom (IBD), Crohns sygdom (CD) og colitis ulcerosa (UC) er karakteriseret ved kronisk remittent eller progressive betændelsestilstande i tarmen med multifaktoriel ætiologi1,2 . Udviklingen af IBD afhænger af genetiske samt visse miljømæssige faktorer som kost, brug af antibiotika, og vigtigere, patogene infektioner. Ætiologi og regulerende molekylære mekanismer bag IBD er dog stadig uklart. Derfor, mange kemisk inducerede IBD dyremodeller er blevet konstrueret og anvendes for at afgrænse patogenese og reguleringsmekanismer og vurdere effektiviteten af menneskelige therapeutics3.
Smag receptorer er G protein koblede receptorer (GPCRs) og er klassificeret som to hovedtyper: type I (T1Rs), og type II (T2Rs), der registrerer sweet, umami og bitter forbindelser. Smag signaling cascades er initieret af tastant binding til T1Rs eller T2Rs, aktivering af heterotrimeric G proteiner består af α-gustducin og en Gβγ dimer og fører til frigivelse af Gβγ underenheder. Gβγ gruppe stimulerer igen downstream effektor enzym fosfolipase C-β2 (PLC-β2). Aktiveret PLC-β2 derefter hydrolyserer phosphatidylinositol-4,5-bisfosfat i to intracellulære sekundære messengers [inositol-1,4,5-trisphosphate (IP3) og diacylglycerol] og IP3 binder sig til og åbne sin kanal-receptor IP3 R3, frigivelse af calciumioner fra det endoplasmatiske reticulum. Dette fører i sidste ende til åbningen af forbigående receptor potentielle ion-kanal Trpm5 og udgivelse af neurotransmitteren ATP på gustatoriske nerver4,5,6,7. Den signaling veje af salt og Sure smag er dog forskellige og uafhængige fra sweet, umami og bitter smag8. Derudover findes komponenter af smag GPCRs og downstream proteiner i forskellige ekstra mundtlige væv. Nylige undersøgelser vist, at α-gustducin, er den vigtigste komponent i smag signalering, fundet skal udtrykkes i tarmslimhinden. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå funktionerne af disse smag signalerer komponenter i ekstra mundtlige væv9,10.
Metoden beskrevet her bruges til at karakterisere funktioner af gustatoriske signaling proteinerne udtrykt i ekstra mundtlige væv. Vi kombinerer en Transgene mus linje udviklet til skildrer signaling cascades i smagsløg med kemisk inducerede colitis model. I vid udstrækning skyldes dens proceduremæssige enkelhed og patologiske ligheder med menneskelige colitis ulcerosa, dextran sulfat natrium (DSS)-induceret IBD model har været mest udbredt blandt de forskellige kemisk inducerede colitis modeller11. I denne undersøgelse brugte vi α-gustducin-mangelfuld mus som en repræsentativ mus linje til at afsløre nye funktioner af α-gustducin i tarmen mucosal immunitet og betændelse af 1) analyserer morfologiske forandringer i væv og 2) boltpistoler forskelle i udtryk for cytokiner relateret til betændelse i tyktarmen. Denne metode kan bruges til kvantitativt og kvalitativt bestemme gustatoriske signaling proteiner (og andre proteiner, udtrykt i tarmen) bidrag til vævsskader og tarmbetændelse, når genetisk modificerede mus linjer for gener interesse er tilgængelige. Fordelene ved denne metode muliggører brugernes hen til opnå integrerede data som følge af handlinger af både den kemiske DSS og mangel på gen af interesse. Denne metode kan forbedres yderligere for at øge sin følsomhed og afslører subtile intestinal ændringer på cellulære og molekylære niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg med mus blev gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg af Zhejiang University. Det anbefales at bære passende personlige værnemidler før du udfører denne protokol.
1. forberedelse af mus og DSS
- Holde den knockout (α-gustducin- / -) mus og alder-, køn- og vægt-matchede vildtype kropskontrol (α-gustducin+/ +) C57BL/6 mus individuelt i ren bure.
Bemærk: Knockout mus har været backcrossed med C57BL/6 mus til over 20 generationer og har en næsten 100% C57BL/6 genetiske baggrund. - 30 g af dextran sulfat natrium (DSS) pulver i 1 L autoklaveres vand opløses. Bland indtil løsningen bliver klar til at sikre, at den endelige arbejde koncentration er 3% (w/v).
Bemærk: DSS løsning kan opbevares ved stuetemperatur i op til 1 uge eller ved 4 ° C indtil brug.
2. induktion og evaluering af DSS Colitis i mus
- Vejer og optage hver mus oprindelige kropsvægt. Placere mus individuelt i standard plastic bure og etiket bure.
- Erstatte almindelig drikkevand med 3% DSS løsning for en total på 7 dage, begge grupper af mus har adgang ad libitum.
- Måle musens kropsvægt, registrere DSS løsning forbrug, og indsamle og undersøge afføringen i hvert mus dagligt under DSS-administrationen. Observere sværhedsgraden af diarré, og rektal blødning og konvertere det til DSS-induceret sygdom indeks12.
- Under eksperimentet beregnes procentdelen af vægttab i forhold til oprindelige vægt og sygdom indeks til at evaluere symptomer af colitis.
Bemærk: Sygdom indeks er scoret ved at kombinere observationer af diarré, og rektal blødning og er defineret som følger: 0 (normal taburetten, ingen blod), 1 (blød taburet, ingen blod), 2 (blød taburet, lidt blod), 3 (meget blød taburet, beskeden blødning), og 4 (vandig afføring, signifikant blødning)12. Sygdom-indekset er analyseret dagligt for hver mus. - Ved udgangen af 7-dages DSS behandling, ofrer mus af cervikal dislokation og fortsætte med de resterende forsøg.
3. forberedelse af vævsprøver
- Placere musen i den liggende stilling og rense huden på maven med 70% ethanol. Lave en 3 cm lang midterlinjen snit i maven med en lille saks til at afsløre i bughulen.
- Brug et par pincet til at forsigtigt adskille milten fra andre væv, derefter fjerne milten og måle dens størrelse.
- Identificere og ophæve tyktarmen med pincet og adskille det fra de omkringliggende mesenterium. Træk ud i hele tyktarmen, indtil cecum og endetarmen er synlige.
- Isolere tyktarmen ved transecting det på colonocecal margenen og dybt i bækkenet at frigøre den proksimale og distale colon, henholdsvis. Derefter, måle og registrere længden af den isolerede kolon. Pas på ikke at beskadige det Colon væv under proceduren dissekere.
- Skylle tyktarmen med 10 mL iskold fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med en 10 mL sprøjten udstyret med en sonde nål til at fjerne afføring og blod, indtil eluatet er helt klart.
- For histologiske identifikation, opdele vævsprøver ligeligt i tre dele: proksimale, midten, og distal. Derefter lave væv med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) natten over ved 4 ° C.
- For analyse af cytokin udtryk, fryse hele tyktarmen hurtigt med flydende kvælstof og gemme det på-80 ° C indtil brug.
4. histologisk vurdering af sværhedsgraden af DSS-induceret Colitis
- Hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning
- Efter fiksering, nedsænkes væv i en opløsning af 30% saccharose i 1 x PBS natten over i en 15 mL tube til cryoprotect prøver.
- Integrere vævet i optimal opskæring temperatur (OCT) sammensatte og placere den på-20 ° C, indtil OLT hærder.
- Overføre OCT blok indeholdende væv til en kryostaten, indstille tykkelse skiven i kryostaten 12 µm og skive og indsamle 12 µm tykt frosne sektioner.
- Varme afsnittene indsamlet væv fra en kryostaten ved 65 ° C i 20 min. på en varm tallerken.
- Vask sektioner kort i destilleret vand. Pletten dem med hæmatoxylin farvning løsning til 5 min og efterfølgende skylles med rindende vand i 5 min.
- Adskille sektioner med 0,5% saltsyre-ethanol i 30 s og skyl dem i drift tryk vand i 1 min. Derefter udføre vask i 1 x PBS for 1 min og efterfølgende skylles med rindende vand i 5 min.
- Udføre vask af sektionerne væv i 70%, 75%, 80% og 95% alkohol, hver for 10 s. kontrastfarve i eosin pletter løsning for 2 min.
- Udføre dehydrering gennem 95% alkohol og 2 ændringer af absolut alkohol for 5 min hver gang. Klart i 2 ændringer af xylen i 5 min.
- Score vævsskade i den proksimale, midten, og distal kolon af hver musen til både gen knockout og vildtype grupper baseret på resultaterne af den ovennævnte H & E farvning.
Bemærk: Sygdom indeks er en kombineret score på epitelial skader og betændelse i slimhinden, submucosa, muscularis og serosa regioner, som er defineret som følger: 0 (ingen vævsskader og betændelse), 1 (focal vævsskader og betændelse), 2 (spredte vævsskade og betændelse), og 3 (diffuse vævsskader og betændelse)12,13. Tre scores per musen til de proksimale, midterste og distale dele af tyktarmen er derefter lægges sammen for at opnå en samlet score for hvert dyr. Den gennemsnitlige score for hver gruppe beregnes derefter.
- Immunhistokemi14
- Varme afsnittene indsamlet væv fra en kryostaten ved 65 ° C i 20 min. på en varm tallerken. Vask sektionerne i 1 x PBS 3 gange i 10 min. Inkuber afsnittene væv i 3% brintoverilte i 10 min at fjerne endogene peroxidase. Vask i afsnit 3 flere gange. Blokere væv med blokerende buffer (3% BSA, 0,3% nonionisk detergent, 2% ged serum, 0,1% natriumazid i 1 x PBS) ved stuetemperatur i 1 time eller mere.
- Erstatte den blokerende buffer med en oploesning indeholdende følgende immun celle type-specifikke primære antistofferne: CD45 for leukocytter, CD3 for T-celler, B220 for B-celler, CD11b til makrofager og Ly6G til neutrofiler. Der inkuberes ved 4 ° C natten over.
- Fjerne de primære antistoffer fra væv sektioner af aspiration. Vask sektioner med 1 x PBS 3 gange i 10 min. Inkuber i afsnit med biotinylated sekundær antistof efterfulgt af inkubation med streptavidin-HRP kompleks ved stuetemperatur.
- Inkuber i afsnit 3, 3'-diaminobenziding (DAB) løsning til at udvikle en lys eller mørk brun farve og visualisere de immunoreaktive celler.
- Counterstain sektioner med hæmatoxylin og 0,3% (v/v) fortyndet ammoniak. Tage lysfelt billeder i 10 X forstørrelse under et mikroskop.
- Bruge et billede behandlingsprogram til at identificere og kvantificere befolkningen i de markerede immunceller i både epitel og lamina propria (nedenunder epitel) af indstilling 2 masker: Brug den første maske i den farve-cube-baseret funktion til at angive en farve påvisning tærskel og måle de farvede DAB-reaktiv områder; Brug den anden maske til at bestemme samlede områder af epitel og laminar propria i afsnittet undersøgt. Express immunoreaktive celle befolkning som en ratio på området farvning af det samlede areal af de undersøgte væv infiltreret cellerne.
5. gen Expression vurdering af DSS-induceret Colitis
- Hente tyktarmen væv fra DSS-behandlede gen knockout og wild-type mus fra en-80 ° C fryser og tilføje 0,6 mL lysisbuffer 25 mg af væv, så homogeniseres i en homogeniseringsapparat.
- Følg RNA udvinding kit protokol hen til uddrag den samlede RNA, og DNase jeg bruges til at fjerne enhver kontaminerende genomisk DNA.
- Køre en agarosegel for at kontrollere kvaliteten af den udpakkede RNA. Hvis dens 28S RNA band er lysere end 18S band, er det brugbart. Tage 1 µL af eksemplet RNA til RNA-koncentrationen på et microspectrophotometer.
- Mix 1 µg af den samlede RNA med 2,5 µL af 20 mM oligo (dT)12,13,14,15,16,17,18 primere og 1 µL af Moloney murine leukæmi virus (MMLV) reverse transkriptase. Der inkuberes ved 42 ° C i 60 minutter at forberede cDNA.
- Konfigurere real-time PCR reaktioner ved at blande 1µL af cDNA med 0,5 µL af forward og reverse qPCR primere for TNF, IFN-γ, IL-5, IL-13, IL-10, TGF-B1 og β-Actin som kontrol ud over 2 x fluorescerende grøn farve.
- Kør qPCR med følgende parametre: 95 ° C i 10 min, efterfulgt af 45 cyklusser af 95 ° C til 10 s, 50 ° C i 25 s og 72 ° C i 20 s.
- Beregne den relative kvantificering af genekspression ved hjælp af de 2-ΔΔCt metode15. Forholdsvis analysere gen expression niveauer i knockout vs. Wild-type mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En DSS-induceret IBD procedure blev etableret af administration af 3% DSS i drikkevand til α-gustducin-knockout (KO) og wild-type (WT) mus. I forhold til WT mus, udstillet knockout mus mere svær colitis med overdreven vægttab, diarré, og intestinal blødning (figur 1). Efter en 7-dages DSS administration, forskelle i væv integritet blev analyseret ved hjælp af H & E farvning som metoden histologiske og mere grov vævsskader blev fundet i den proksimale, midterste, og distal kolon af knockout mus end i WT mus ( Figur 2). Endvidere, den overdrevne immun aktivering førte til colitis med infiltration af forskellige inflammatoriske celler såsom makrofager og neutrofiler. Immunhistokemiske analyser ved hjælp af en række markører for immunceller blev foretaget til at bestemme, om α-gustducin mangel berørt immun celle infiltration. Sammenlignende analyse viste, at infiltration af leukocytter, neutrofiler og makrofager var steget betydeligt i knockout mus i forhold til WT kontrol mus (figur 3). Endelig blev nogle cytokin udtryk niveauer i kolon af DSS-induceret colitis mus bestemt ved hjælp af qPCR med gen-specifikke primere. Resultaterne viste, at i forhold til WT mus, knockout mus havde højere udtryk niveauer af TNF og IFN-γ men lavere udtryk niveauer af IL-5, IL-13, og IL-10; imidlertid sås ingen forskel i udtryk niveau af TGF-B1 mellem knockout og WT mus (figur 4).
Figur 1 : DSS administration gør mere svær colitis i α-gustducin knockouts (KO). (A) procent af kroppen vægttab: KO mus vises betydeligt mere krop vægttab starter fra dag 3. (B) Colitis sygdom indeks baseret på sværhedsgraden af diarré, og rektal blødning: KO mus viste signifikant større sygdom indeks end WT kontrol. (C) kolon (øverste panel) og milt (lavere paneler) fra repræsentative WT og KO mus 7 dage post-DSS administration: KO mus havde betydeligt kortere koloner og større milt. Fejllinjer udgør SEM (* p < 0,05, ** p < 0,005, *** p < 0.0005; ANAVA med post hoc- t-test). Skalalinjen = 1 cm. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Α-gustducin KO mus viser mere alvorlige vævsskader efter DSS behandling. (A) H & E farvning af tyktarmen væv fra WT og α-gustducin KO mus ikke behandlet med DSS (vand) eller behandlet med DSS i 7 dage (DSS). (B) væv skade score baseret på histologiske farvning af tyktarmen væv fra WT og KO mus 7 dage efter DSS administration. DSS behandling induceret nogle vævsskader i WT koloner, der var meget værre i KO modellen. Fejllinjer udgør SEM (* p < 0,05). Skalalinjen = 50 µm. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Α-gustducin KO mus få vist øget infiltrationen af immunceller i DSS-induceret colitis. (A) Massive immun celle infiltration i kolon af DSS-behandlede KO mus. (B) kvantificering af immun celle numre: procentdelen af immunostained områder divideret med det samlede areal af målte væv baseret på image analyser. Fejllinjer udgør SEM. skala bar = 50 µm. Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Α-gustducin KO mus få vist forskellige udtryk niveauer af immunsystemet cytokiner i DSS-induceret colitis. DSS behandling øget udtryk af TNF og IFN-γ og nedsat udtryk af IL-5, IL-13, og IL-10 i KO mus koloner i forhold til WT mus. Real-time kvantitativ RT-PCR blev udført ved brug af gen-specifikke primere. Β-actin blev brugt som en intern kontrol genet. Fejllinjer udgør SEM (* p < 0,05, ** p < 0.005). Dette tal er blevet ændret fra en tidligere publikation13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Liste over primere anvendes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metode kan anvendes til kvantitativt fastslå effekten af mutationer af specifikke gustatoriske gener på betændelse i en DSS-induceret IBD musemodel. For at drage fuld fordel, er optimal induktion af IBD et vigtigt skridt. Udviklingen af colitis er påvirket af flere faktorer, herunder mus stamme, boliger miljø, intestinal mikroflora, samt gener af interesse. Det anbefales at udføre et pilotprojekt med et lille antal mus til at teste forskellige doser og varigheder af DSS administration. Under pilot eksperiment, brutto symptomer som vægttab, diarré, intestinal blødning og nogle mikroskopiske ændringer såsom vævsskader, inflammation forbundet med immun celle infiltration og udtryk-niveau ændringer af cytokiner bør være analyseret og sammenlignet med kontrolgruppen, der har drikkevand uden DSS16,17,18,19. Sværhedsgrad af inducerede colitis kan overvåges ved at analysere daglige ændringer i mus kropsvægt og snesevis af den opsamlede afføring i DSS-behandlingen perioden. Efter DSS behandling, kan vævsskader vurderes ved H & E farvning på frosne dele af tyktarmen, hvorimod infiltrationen af immunceller og udtryk niveauer af cytokiner kan identificeres og kvantificeres ved hjælp af Immunhistokemi og qPCR. DSS dosering, administration varighed og kost kan justeres for at afsløre subtile effekter af gustatoriske genmutationer på Colon immunrespons. Følsomheden af denne metode kan dog stadig begrænse dens anvendelse til undersøgelser på de minimale virkninger af nogle andre gener. I dette tilfælde, kan der vedtages nogle ændringer; for eksempel, ved at minimere variabler fra enkelte-specifikke intestinal mikroflora ved administration af antibiotika.
DSS-induceret colitis model er blevet brugt mest omfattende blandt kemiske agent-induceret IBD modeller, hovedsagelig på grund af sin enkelhed, hurtighed, reproducerbarhed, kontrollerbarhed og vigtigst dets ligheder med menneskelige colitis ulcerosa, som er nyttig ved vurdering af effektiviteten af menneskelige therapeutics2. En ulempe forskere skal være opmærksom på er at T og B-celler er ikke påkrævet for udviklingen af colitis, som er forskellig fra udviklingen af sygdomme hos mennesker. Det kan imidlertid være nyttigt for at studere rollen af den medfødte immunsystem i udviklingen af akut colitis2.
Denne undersøgelse har etableret en DSS-induceret IBD model ved hjælp af α-gustducin-mangelfuld mus, som kan bruges til at undersøge nye funktioner af G protein α-underenhed i gut mucosal immunitet og betændelse. Resultaterne viser, at mus mangler α-gustducin er mere modtagelige for DSS-induceret colitis og ledsages af mere alvorlige symptomer, herunder vævsskader, overdreven inflammatoriske respons og ændrede udtryk af potente cytokiner13. Efter aftale med de seneste resultater viser inddragelse af smag-lignende chemosensory veje i type II immunrespons til tarm parasitter20, α-gustducin og andre smag signalerer proteiner kan have roman og vigtige funktioner i tarmens immun balance. De præcise molekylære mekanismer bag disse skæv immunrespons er dog stadig for at blive afsløret.
Desuden, denne metode kan anvendes til at undersøge virkningerne af andre gustatoriske gener, der udtrykkes i tyktarmen (f.eks. den forbigående receptor potentielle ion-kanal Trpm5, som er kritiske for sød, bitter og umami smag og udtrykt i menneskelige Colon celler7). Endelig, den samme strategi kan bruges til at opdage nye funktioner af vigtige proteiner og faktorer i tarm immunitet og hjælpe med at vurdere effektiviteten af nye behandlinger af visse sygdomme hos mennesker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af tilskud fra National Natural Sciences Foundation of China (81671016, 31471008 og 31661143030) og National Institutes of Health (DC010012, DC015819) og Siyuan Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), Unit 15 (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), New York, N.Y. 1329-1333 (2016).
