Summary
نقدم هنا بروتوكولا للتحقيق أثر إبطال الجينات المتعلقة جوستيشن على الاستجابات المناعية في ديكستران كبريتات صوديوم (DSS)-التي يسببها التهاب الأمعاء المرض (بنك التنمية بين الأمريكتين) طراز الماوس.
Abstract
مرض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين) هو واحد من الاضطرابات المعوية المتصلة بجهاز المناعة، بما في ذلك التهاب القولون التقرحي وداء كرون، الذي يؤثر على نوعية حياة الملايين من الناس في جميع أنحاء العالم. وتشمل أعراض بنك التنمية بين الأمريكتين الأم في البطن وإسهال ونزيف المستقيم، التي قد تنجم عن التفاعلات بين الحجمية القناة الهضمية والمكونات الغذائية، والخلايا الظهارية المعوية، والخلايا المناعية. أنها ذات أهمية خاصة لتقييم كيفية تأثير كل الجينات الرئيسية المعرب عنها في الخلايا الظهارية والمناعة المعوية التهاب في القولون. ز مستقبلات الذوق إلى جانب البروتين، بما في ذلك ز البروتين الوحيدات α-جوستدوسين وغيرها من البروتينات إرسال الإشارات، وقد تم العثور عليها في الأمعاء. هنا، نحن نستخدم α-جوستدوسين كممثل ووصف ديكستران كبريتات صوديوم (DSS)-التي يسببها نموذج بنك التنمية بين الأمريكتين لتقييم أثر طفرات الجينات تطرب على حصانة المخاطي الأمعاء والتهاب. هذا الأسلوب يجمع بين تكنولوجيا الجينات خروج المغلوب مع نموذج بنك التنمية بين الأمريكتين المستحث كيميائيا، وهكذا يمكن تطبيقها لتقييم نتائج إبطال الجين تطرب، فضلا عن الجينات الأخرى التي قد تكون اكسبيريت أو تثبيط الاستجابة المناعية الناجمة عن مفاجآت في القولون. وتدار الفئران متحولة مع إدارة السلامة والأمن لفترة زمنية معينة ترصد وتسجل خلالها وزن الجسم، والبراز، ونزيف المستقيم. في تيميبوينتس مختلفة أثناء الإدارة، هي euthanized بعض الفئران، ثم يتم قياس الأحجام والأوزان الطحال والفواصل وأنسجة القناة الهضمية وتم جمعها وتجهيزها لغذائها وتحليل التعبير الجيني. تظهر البيانات أن النتائج خروج المغلوب α-جوستدوسين في فقدان الوزن الزائد والإسهال والنزيف المعوي، وتلف الأنسجة والتهاب مقابل الفئران البرية من نوع. نظراً لشدة التهاب المستحث يتأثر بسلالات الماوس والبيئة السكنية، والنظام الغذائي، الاستغلال الأمثل لمفاجآت صيف دبي مدة التركيز والإدارة في تجربة رائدة مهم بشكل خاص. عن طريق ضبط هذه العوامل، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لتقييم الآثار التحريضية المضادة والمحترفين على حد سواء.
Introduction
الأشكال الرئيسية اثنين من مرض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين) وداء كرون (CD)، والتهاب القولون التقرحي (UC) تتميز بالأمراض المزمنة التحريضية تحويلات أو التدريجي من الأمعاء مع المسببات المتعددة العوامل1،2 . يعتمد تطوير بنك التنمية بين الأمريكتين على الوراثية وكذلك بعض العوامل البيئية مثل النظام الغذائي، استخدام المضادات الحيوية، والأهم من ذلك الالتهابات المسببة للمرض. ومع ذلك، لا تزال غير واضحة بالمسببات والآليات الجزيئية التنظيمية الأساسية لبنك التنمية بين الأمريكتين. ومن ثم، تم شيدت المستحث كيميائيا العديد من النماذج الحيوانية بنك التنمية بين الأمريكتين وتطبيقها لتحدد المرضية والآليات التنظيمية، وتقييم مدى فعالية العلاجات البشرية3.
مستقبلات الذوق ز إلى جانب البروتين مستقبلات (جبكرس) وتصنف إلى نوعين رئيسيين: النوع الأول (T1Rs)، والنوع الثاني (T2Rs) الذي كشف الحلو، وقلبي، ومركبات المريرة. طعم إشارات الشلالات تبدأ بربط تاستانت إلى T1Rs أو T2Rs، تفعيل هيتيروتريميريك ز البروتينات تتألف من α-جوستدوسين وديمر Gβγ وتؤدي إلى الإفراج عن مفارز Gβγ. مجموعة Gβγ يحفز بدوره المستجيب المصب إنزيم phospholipase ج-β2 (PLC-β2). تنشيط المجلس التشريعي الفلسطيني-β2 ثم هيدروليزيس فوسفاتيديلينوسيتول-4، 5-بيسفوسفاتي في اثنين من السعاة الثانوي داخل الخلايا [اينوزيتول-1,4,5-تريسفوسفاتي (IP3) و diacylglycerol]، والملكية الفكرية3 يربط إلى وفتح لها IP مستقبلات قناة3 R3، إطلاق أيونات الكالسيوم من هيولى. وهذا يؤدي في النهاية إلى فتح مستقبلات عابر المحتملة أيون قناة Trpm5 وإطلاق سراح ATP العصبي على أعصاب تذوق4،،من56،7. حتى الآن، مسارات إشارات من اﻷذواق المالحة وتعكر مختلفة ومستقلة من الحلو وقلبي والأذواق المريرة8. وبالإضافة إلى ذلك، مكونات طعم جبكرس والبروتينات المتلقين للمعلومات موجودة في الأنسجة خارج الفم المختلفة. أشارت الدراسات التي أجريت مؤخرا إلى أن α-جوستدوسين، يتم العثور على المكون الرئيسي للذوق إشارة، يعبر عنه في مخاطية الأمعاء. إجراء المزيد من الدراسات ضرورية لفهم وظائف طعم هذه الإشارات المكونات في الأنسجة خارج الفم9،10.
يتم استخدام الأسلوب الموصوفة هنا لتوصيف وظائف البروتينات مما يشير إلى تذوق المعرب عنه في الأنسجة خارج الفم. أن نجمع بين خط المعدلة وراثيا ماوس المتقدمة لتحديد الشلالات الإشارات في براعم الذوق مع نموذج القولون المستحث كيميائيا. إلى حد كبير نظراً لبساطته الإجرائية والتشابه المرضية لالتهاب القولون التقرحي البشرية، ديكستران كبريتات الصوديوم (DSS)-المستحث نموذج بنك التنمية بين الأمريكتين قد استخدمت على نطاق واسع بين مختلف نماذج القولون المستحث كيميائيا11. في هذه الدراسة، استخدمنا α-جوستدوسين-ناقص الفئران كخط ماوس ممثل للكشف عن وظائف جديدة من α-جوستدوسين في القناة الهضمية حصانة المخاطي والتهاب 1) تحليل التغييرات الشكلية في الأنسجة و 2) فحص الاختلافات في التعبير عن السيتوكينات المتصلة بالتهاب في القولون. يمكن استخدام هذا الأسلوب كمياً ونوعيا تحديد مساهمات البروتينات مما يشير إلى تذوق (وغيرها من البروتينات التي أعرب عنها في القناة الهضمية) إلى تلف الأنسجة والتهاب الأمعاء، عند خطوط الماوس المعدلة وراثيا على جينات وتتوفر المصلحة. مزايا هذا الأسلوب هي تمكين المستخدمين من الحصول على بيانات متكاملة الناجمة عن تصرفات DSS الكيميائية ونقص الجينات للفائدة. يمكن زيادة تحسين هذا الأسلوب زيادة حساسيتها، وتكشف عن بعض التغييرات الطفيفة المعوية المستويات الخلوية والجزيئية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع التجارب التي أجريت على الفئران تم استعراضها والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجان في جامعة تشجيانغ. ينصح بارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة قبل تنفيذ هذا البروتوكول.
1-إعداد الفئران ومفاجآت صيف دبي
- الاحتفاظ خروج المغلوب الفئران (α-جوستدوسين--/--) والعمر-الجنس-والمراقبة البرية من نوع مطابقة وزن الجسم (α-جوستدوسين+ +) الفئران C57BL/6 على حدة في أقفاص نظيفة.
ملاحظة: قد تم باككروسيد مع الفئران C57BL/6 لما يزيد على 20 الأجيال الفئران خروج المغلوب وقرابة 100% C57BL/6 وراثية خلفية. - حل ز 30 ديكستران كبريتات الصوديوم (DSS) مسحوق في 1 لتر ماء يعقم. المزيج حتى يصبح الحل الواضح للتأكد من أن تركيز العامل النهائي 3% (w/v).
ملاحظة: يمكن تخزين الحل مفاجآت في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد، أو عند 4 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2-التعريف والتقييم من مفاجآت التهاب القولون في الفئران
- زن وسجل الماوس كل من وزن الجسم الأولية. ضع الفئران منفردة في أقفاص البلاستيك القياسية وتسمية الأقفاص.
- يستعاض عن شرب الماء مع الحل DSS 3% لإجمالي 7 أيام التي يكون كلا مجموعات من الفئران العادية الوصول libitum الإعلانية.
- قياس وزن الجسم الماوس، وتسجيل استهلاك حل إدارة السلامة والأمن، وجمع وفحص البراز لكل الماوس يوميا خلال فترة الإدارة إدارة السلامة والأمن. مراقبة من شدة الإسهال ونزيف المستقيم وتحويل هذا إلى فهرس الأمراض التي يسببها DSS12.
- أثناء التجربة، يتم حساب النسبة المئوية لفقدان الوزن مقارنة بالوزن الأولى والرقم القياسي للمرض لتقييم أعراض التهاب القولون.
ملاحظة: مؤشر المرض هو سجل عن طريق الجمع بين الملاحظات من الإسهال ونزيف المستقيم وتم تعريفها على النحو التالي: 0 (البراز العادي، لا للدم)، 2 (البراز لينة، الدم قليلاً) 3، 1 (البراز لينة، لا للدم) (البراز لينة جداً، ونزيف متواضعة)، و 4 (البراز مائي، نزيف كبير)12. ويتم تحليل مؤشر المرض يوميا لكل الماوس. - بنهاية العلاج DSS 7 أيام، التضحية الفئران بسرطان عنق الرحم التفكك والمضي قدما في التجارب المتبقية.
3-إعداد عينات الأنسجة
- ضع الماوس في موقف ضعيف وتنظيف جلد البطن مع الإيثانول 70%. جعل شق خط الوسط طوله سم 3 في البطن مع زوج من مقص صغير لفضح تجويف البطن.
- استخدام زوج من الملقط بعناية فصل الطحال من الأنسجة الأخرى، ثم إزالة الطحال وقياس حجمه.
- تحديد ورفع القولون بالملقط وفصله من مساريق المحيطة بها. سحب القولون كله حتى الأعور والمستقيم مرئية.
- عزل القولون عن طريق ترانسيكتينج أنها عند الهامش كولونوسيكال والعميق في الحوض لتحرير القولون القريبة والبعيدة، على التوالي. ثم قياس وتسجيل طول القولون معزولة. أن الحرص على عدم الأضرار الأنسجة colonic أثناء إجراء تشريح.
- مسح القولون مع 10 مل من المحلول الملحي المثلج مخزنة الفوسفات (PBS) بحقنه 10 مل مزودة بإبرة تزقيمية لإزالة البراز والدم حتى النذرة واضح تماما.
- لتحديد النسيجي، تقسيم عينات الأنسجة على قدم المساواة إلى ثلاثة أجزاء: الدانية، المتوسطة والبعيدة. ثم، إصلاح الأنسجة مع بارافورمالدهيد 4% (PFA) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- لتحليل التعبير سيتوكين، تجميد القولون الكامل سريعاً مع النتروجين السائل وتخزينه في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4-نسيجية تقييم شدة التهاب القولون المستحثة بمفاجآت صيف دبي
- توضع وتلطيخ ويوزين (H & E)
- بعد التثبيت، غمر النسيج في محلول السكروز 30% في برنامج تلفزيوني س 1 بين عشية وضحاها في أنبوب 15 مل إلى كريوبروتيكت العينات.
- تضمين الأنسجة في قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مركب ووضعه في-20 درجة مئوية إلى حين يصلب OCT.
- نقل كتلة أكتوبر التي تحتوي على الأنسجة إلى كريوستات وتعيين الطلب سمك في كريوستات إلى 12 ميكرون، وشريحة وجمع 12 ميكرومتر سميكة الأجزاء المجمدة.
- الحرارة أقسام الأنسجة التي تم جمعها من كريوستات عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على لوحة الساخن.
- أغسل المقاطع بإيجاز في الماء المقطر. وصمة عار لهم مع توضع تلطيخ الحل لمدة 5 دقائق ويشطف بعد ذلك بتشغيل مياه الحنفية لمدة 5 دقائق.
- التفريق بين الأقسام مع الإيثانول حمض الهيدروكلوريك 0.5% 30 ثانية وشطف لهم في تشغيل الاستفادة من المياه لمدة 1 دقيقة. أداء الغسيل في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 1 دقيقة ثم يشطف بعد ذلك بتشغيل مياه الحنفية لمدة 5 دقائق.
- أداء الغسيل المقاطع الأنسجة في الكحول 70%، 75%، 80%، و 95%، وكل من كونتيرستين س. 10 في ويوزين تلطيخ الحل لمدة 2 دقيقة.
- أداء الجفاف عن طريق الكحول 95% والتغييرات 2 من الكحول المطلق لمدة 5 دقائق في كل مرة. واضحة في التغييرات 2 من زيلين نفط لمدة 5 دقائق.
- نقاط تلف أنسجة القولون الدانية، المتوسطة والبعيدة لكل الماوس لكل من الجينات خروج المغلوب والمجموعات البرية من نوع استناداً إلى نتائج أعلاه ح & ه تلطيخ.
ملاحظة: مؤشر المرض هو درجة مجتمعة الضرر الظهارية والتهاب في مناطق الغشاء المخاطي وسوبموكوسا وموسكولاريس وسيروسا، الذي تم تعريفه على النحو التالي: 0 (لا تلف الأنسجة والتهاب)، 1 (تلف الأنسجة المحورية والتهاب)، 2 (غير مكتمل تلف الأنسجة والتهاب)، و 3 (تلف الأنسجة المنتشر والتهاب)12،13. ثم يتم تجميع الدرجات الثلاث الواحدة الماوس للأجزاء الدانية، المتوسطة والبعيدة من القولون للحصول على مجموع نقاط لكل الحيوانات. ثم يتم حساب متوسط النقاط لكل مجموعة.
- إيمونوهيستوتشيميستري14
- الحرارة أقسام الأنسجة التي تم جمعها من كريوستات عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على لوحة الساخن. أغسل المقاطع في 1 x برنامج تلفزيوني 3 مرات، لمدة 10 دقائق. احتضان مقاطع الأنسجة في بيروكسيد الهيدروجين 3% لمدة 10 دقائق للقضاء على البيروكسيديز الذاتية. تغسل الأجزاء 3 مرات أكثر. كتلة الأنسجة مع حجب المخزن المؤقت (BSA 3%، المنظفات غير الأيونية 0.3%، 2% مصل الماعز، أزيد الصوديوم 0.1% في برنامج تلفزيوني 1 x) في درجة حرارة الغرفة ح 1 أو أكثر.
- يستعاض عن المخزن المؤقت حظر بمحلول يحتوي على أجسام الأولية الخاصة بنوع الخلايا المناعية التالية: CD45 للكريات البيضاء، CD3 لخلايا تي، B220 للخلايا ب، CD11b الضامة، و Ly6G العَدلات. احتضان عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- إزالة الأجسام المضادة الأولية من أقسام الأنسجة بالطموح. أغسل المقاطع مع 1 x برنامج تلفزيوني 3 مرات، لمدة 10 دقائق. احتضان الفروع مع جسم بيوتينيلاتيد الثانوي متبوعاً بالحضانة مع مجمع ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان الفروع مع 3، 3 '--ديامينوبينزيدينج (DAB) حل لوضع لون ضوء أو الظلام براون ووضع تصور للخلايا إيمونوريكتيفي.
- كونتيرستين الأقسام مع الهيماتوكسيلين والأمونيا 0.3% (v/v) المخفف. التقاط صور مشرقة ميدان الساعة 10 X التكبير تحت مجهر.
- استخدام برنامج معالجة صور لتحديد وتقدير حجم سكان الخلايا المناعية ملحوظ في ظهارة وبروبريا الصفيحة (تحت الظهارة) بوضع أقنعة 2: استخدام القناع الأول في ميزة المستندة إلى المكعب اللون لضبط الكشف عن لون العتبة وقياس المساحات الملونة الدأب المتفاعلة؛ استخدام القناع الثاني لتحديد مجالات مجموع ظهارة وبروبريا الصفحي في قسم دراسة. أعرب السكان خلية إيمونوريكتيفي كنسبة من منطقة المصبوغة خلايا تسلل إلى المساحة الكلية لفحص الأنسجة.
5-الجينات تقييم التعبير المستحثة بمفاجآت التهاب القولون
- استرداد أنسجة القولون من خروج المغلوب الجين المعالجة بمفاجآت والفئران البرية من نوع من ثلاجة-80 درجة مئوية وإضافة 0.6 مل من المخزن المؤقت لتحلل 25 ملغ من الأنسجة، ثم تجانسه في الخالطون.
- اتبع البروتوكول مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي لاستخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي، والدناز أنا يستخدم للقضاء على أي تلويث الحمض النووي.
- تشغيل [اغروس] هلام التحقق من جودة الجيش الملكي النيبالي المستخرجة. إذا كانت الفرقة الخاصة به الحمض النووي الريبي 28S أكثر إشراقا من الفرقة 18S، أنها صالحة للاستعمال. تأخذ 1 ميكروليتر من عينة الحمض النووي الريبي لتحديد تركيز الجيش النيبالي الملكي في ميكروسبيكتروفوتوميتير.
- ميكس 1 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي إجمالي مع ميليلتر 2.5 ملم 20 اليغو (dT)12،13،14،15،16،،من1718 كبسولة تفجير و 1 ميليلتر من اللوكيميا مورين مولوني المنتسخة العكسية الفيروس (ملف). احتضان في 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة للتحضير كدنا.
- قم بإعداد ردود فعل PCR الوقت الحقيقي بالاختلاط 1µL كدنا مع 0.5 ميليلتر من قبكر إلى الأمام وعكس كبسولة تفجير تنف، IFN-γ، إيل-5، إيل-13، إيل-10 و TGF-β1 β-أكتين كعنصر تحكم بالإضافة إلى 2 × صبغ أخضر نيون.
- تشغيل في قبكر مع المعلمات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها دورات 45 من 95 درجة مئوية لمدة 10 ق، 50 درجة مئوية ل 25 s، و 72 درجة مئوية 20 s.
- حساب التقدير الكمي النسبي للتعبير الجيني باستخدام أسلوبΔΔCt –215. تحليل مستويات التعبير الجيني في الضربة القاضية مقابلنسبيا. البرية من نوع الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أنشئ إجراء بنك التنمية بين الأمريكتين المستحثة بمفاجآت صيف دبي بإدارة 3% مفاجآت في مياه الشرب إلى α-جوستدوسين-خروج المغلوب (كو) والفئران البرية من نوع (وزن). مقارنة بوزن الفئران، أظهرت الفئران خروج المغلوب القولون الحاد أكثر مع فقدان الوزن المفرط، والإسهال والنزيف المعوي (الشكل 1). بعد إنشاء إدارة مفاجآت صيف دبي يوم 7، حللت الفروق في سلامة الأنسجة باستخدام ح & ه تلطيخ كأسلوب النسيجي، وتم العثور على أكثر من تفاقم تلف الأنسجة في نقطتين الدانية، المتوسطة والبعيدة للفئران خروج المغلوب من وزن الفئران ( الشكل 2). وعلاوة على ذلك، أدى التنشيط المناعي المفرط إلى التهاب القولون بتسلل خلايا الالتهابات المختلفة مثل الضامة والعدلات. المناعي باستخدام عدد من علامات للخلايا المناعية أجريت تحليلات لتحديد ما إذا كان نقص α-جوستدوسين أثر تسلل الخلايا المناعية. وأظهر التحليل المقارن أن تسلل الكريات البيضاء، العَدلات، والضامة قد زادت كثيرا في خروج المغلوب الفئران مقارنة بوزن مكافحة الفئران (الشكل 3). وأخيراً، حددت بعض مستويات التعبير سيتوكين في النقطتين الفئران المستحثة بمفاجآت التهاب القولون باستخدام قبكر مع الإشعال الخاصة بالجينات. النتائج أظهرت أن وزن الفئران، بالمقارنة مع الفئران خروج المغلوب قد أعلى مستويات التعبير تنف و IFN-γ ولكن أقل من مستويات التعبير 5 إيل وايل-13، وايل-10؛ ومع ذلك، كان ينظر أي اختلاف في مستوى التعبير TGF-β1 بين خروج المغلوب ووزن الفئران (الشكل 4).
الشكل 1 : الإدارة DSS يجعل القولون الحاد أكثر في الضربة القاضية α-جوستدوسين (كو). (أ) النسبة المئوية للجسم وفقدان الوزن: كو الفئران عرض أكبر بكثير من فقدان الوزن الجسم بدءاً من يوم 3. (ب) مؤشر مرض التهاب القولون استناداً إلى شدة الإسهال ونزيف المستقيم: كو الفئران أظهرت مؤشرات المرض أكبر بكثير من عناصر التحكم بالوزن. (ج) القولون (اللوحة العلوية) والطحال (أفرقة أقل) من الممثل WT كو الفئران 7 أيام DSS وظيفة الإدارة و: كو الفئران كان أقصر بكثير من الفواصل والطحال أكبر. أشرطة الخطأ تمثل وزارة شؤون المرأة (* p < 0.05، * * ف < 0.005، * * * ف < 0.0005؛ ANOVA مع المخصص بعد تي-الاختبارات). مقياس بار = 1 سم. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : إظهار α-جوستدوسين كو الفئران أشد الأضرار الأنسجة بعد العلاج DSS. (أ) ح & ه تلطيخ أنسجة القولون من الفئران كو WT و α-جوستدوسين لا تعامل مع إدارة السلامة والأمن (المياه) أو تعامل مع إدارة السلامة والأمن لمدة 7 أيام (DSS). (ب) الأنسجة إصابة العشرات استناداً إلى تلطيخ نسيجية من أنسجة القولون من الفئران WT وكو 7 أيام بعد الإدارة إدارة السلامة والأمن. العلاج DSS الناجم عن تلف بعض الأنسجة في نقطتين WT, الذي كان أسوأ بكثير في العينة كو. أشرطة الخطأ تمثل وزارة شؤون المرأة (* p < 0.05). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : عرض α-جوستدوسين كو الفئران التسلل المتزايد للخلايا المناعية في القولون المستحثة بمفاجآت صيف دبي- (أ) الخلايا المناعية ضخمة تسلل في نقطتين الفئران المعالجة بمفاجآت كو. (ب) التحديد الكمي لإعداد الخلايا المناعية: النسبة المئوية للمناطق إيمونوستينيد مقسوماً على المساحة الكلية للأنسجة يقاس استناداً إلى تحليلات الصورة. أشرطة الخطأ تمثل مقياس sem. بار = 50 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : عرض α-جوستدوسين كو الفئران التعبير مختلف مستويات السيتوكينات المناعي في التهاب القولون المستحثة بمفاجآت صيف دبي- العلاج DSS زاد التعبير عن تنف و IFN-γ والتعبير إيل-5، إيل-13، وايل-10 في نقطتين الفئران كو مقارنة بوزن الفئران. أجرى RT-PCR الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام أجهزة الإشعال الخاصة بالجينات. Β-أكتين استخدمت كجينات لمراقبة داخلية. أشرطة الخطأ تمثل وزارة شؤون المرأة (* p < 0.05، * * ف < 0.005). وقد تم تعديل هذا الرقم من منشور سابق13. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: قائمة بأجهزة الإشعال المستخدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويمكن استخدام هذا الأسلوب إلى كوانتيتيفيلي تحديد أثر طفرات الجينات تذوق محددة على التهاب في طراز ماوس المستحثة بمفاجآت بنك التنمية بين الأمريكتين. للاستفادة الكاملة، التعريف الأمثل لبنك التنمية بين الأمريكتين خطوة أساسية. تطوير التهاب القولون يتأثر بالعديد من العوامل، بما في ذلك سلالة الماوس، والبيئة السكنية، والنبت المعوية، فضلا عن الجينات للفائدة. من المستحسن القيام بتجربة رائدة مع عدد صغير من الفئران لاختبار جرعات مختلفة والمدد الزمنية للإدارة إدارة السلامة والأمن. أثناء تجربة رائدة، وإجمالي أعراض مثل فقدان الوزن والإسهال والنزيف المعوي وبعض التغيرات المجهرية مثل تلف الأنسجة، التهاب المرتبطة بتسلل الخلايا المناعية، وينبغي أن تكون التغيرات في مستوى التعبير السيتوكينات تحليل ومقارنة لمجموعات التحكم التي تحتوي على مياه الشرب دون مفاجآت صيف دبي16،17،،من1819. يمكن رصد شدة التهاب القولون المستحث بتحليل التغيرات اليومية في وزن الجسم الماوس وعشرات من البراز التي تم جمعها خلال فترة مفاجآت صيف دبي-العلاج. بعد العلاج مفاجآت صيف دبي، يمكن تقييم الأضرار الأنسجة تلطيخ ح & ه على الأجزاء المجمدة من القولون، حين تسلل الخلايا المناعية، ومستويات التعبير من السيتوكينات يمكن تحديدها وقياسها كمياً باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري وقبكر. يمكن ضبط الجرعة DSS ومدة الإدارة، والنظام الغذائي للكشف عن آثار خفية من طفرات الجينات تطرب على الاستجابات المناعية colonic. ومع ذلك، قد لا تزال تحد من حساسية هذا الأسلوب تطبيقه للدراسات المتعلقة الحد الأدنى من الآثار بعض الجينات الأخرى. وفي هذه الحالة، يمكن اعتماد بعض التعديلات؛ على سبيل المثال، عن طريق تصغير المتغيرات من النبت المعوية الخاصة بالفرد بإدارة المضادات الحيوية.
وقد استخدمت نموذج القولون المستحثة بمفاجآت أكثر على نطاق واسع بين المواد الكيميائية الناجمة عن عامل بنك التنمية بين الأمريكتين النماذج، إلى حد كبير نظراً لبساطته، والسرعة، وإمكانية تكرار نتائج، للتحكم، والأهم الشبه به للبشرية من التهاب القولون التقرحي، مفيدة في تقييم فعالية العلاجات البشرية2. عيب واحد الباحثين يجب أن تكون على علم أن تي وخلايا ب ليست مطلوبة من أجل تطوير التهاب القولون، الذي يختلف عن تطور هذا المرض في البشر. ومع ذلك، قد يكون من المفيد لدراسة دور نظام المناعة الفطرية في تطوير التهاب القولون الحاد2.
وقد أنشأت هذه الدراسة نموذج بنك التنمية بين الأمريكتين المستحثة بمفاجآت صيف دبي باستخدام α-جوستدوسين-ناقص الفئران، التي يمكن أن تستخدم للتحقيق في رواية مهام فرعية α البروتين ز في حصانة المخاطي الأمعاء والتهاب. وتظهر النتائج أن الفئران التي تفتقر إلى α-جوستدوسين أكثر عرضه لالتهاب القولون المستحثة بمفاجآت ومصحوبة بأعراض أكثر شدة، بما في ذلك تلف الأنسجة والردود التحريضية المفرط، والتعبير غيرت من السيتوكينات قوية13. باﻻتفاق مع النتائج الأخيرة التي تشير إلى تورط مسارات مثل طعم تشيموسينسوري في النوع الثاني الاستجابات المناعية ل طفيليات الأمعاء20، α-جوستدوسين والذوق الأخرى مما يشير إلى البروتينات قد يكون رواية والوظائف الهامة في الأمعاء التوازن المناعي. ولكن تظل الآليات الجزيئية الدقيقة الكامنة وراء هذه الاستجابات المناعية منحرف أن اكتشفت.
وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب لدراسة آثار جينات أخرى تطرب التي يتم التعبير عنها في القولون (مثلاً، مستقبلات عابر المحتملة أيون قناة Trpm5، هو أمر حيوي للأذواق الحلو والمر وقلبي و colonic المعرب عنها في الإنسان 7من الخلايا). وأخيراً، يمكن استخدام نفس الاستراتيجية لاكتشاف وظائف جديدة من البروتينات الرئيسية والعوامل في حصانة المعوية، والمساعدة في تقييم فعالية علاجات جديدة لبعض الأمراض التي تصيب الإنسان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
يتم دعم هذا العمل من المنح المقدمة من الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين (81671016 و 31471008 و 31661143030)، والمعاهد الوطنية للصحة (DC010012، DC015819) ومؤسسة Siyuan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
References
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A. The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases. Gastroenterology. 140 (6), 1720-1728 (2011).
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Gilbertson, T. A., Khan, N. A. Cell signaling mechanisms of oro-gustatory detection of dietary fat: Advances and challenges. Progress in Lipid Research. 53, 82-92 (2014).
- Huang, L., et al. Gγ13 colocalizes with gustducin in taste receptor cells and mediates IP3 responses to bitter denatonium. Nature Neuroscience. 2 (12), 1055-1062 (1999).
- Perez, C. A., et al. A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells. Nature Neuroscience. 5 (11), 1169-1176 (2002).
- Shigemura, N., Ninomiya, Y. Recent Advances in Molecular Mechanisms of Taste Signaling and Modifying. International Review of Cell and Molecular Biology. 323, 71-106 (2016).
- Bezençon, C., et al. Murine intestinal cells expressing Trpm5 are mostly brush cells and express markers of neuronal and inflammatory cells. Journal of Comparative Neurology. 509 (5), 514-525 (2008).
- Lu, P., Zhang, C. -H., Lifshitz, L. M., ZhuGe, R. Extraoral bitter taste receptors in health and disease. The Journal of General Physiology. 149 (2), 181-197 (2017).
- Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nature Protocols. 2, 541-546 (2007).
- Chassaing, B., Aitken, J. D., Malleshappa, M., Vijay-Kumar, M. Dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in mice. Current Protocols in Immunology. 104 (25), Unit 15 (2014).
- Feng, P., et al. Aggravated gut inflammation in mice lacking the taste signaling protein α-gustducin. Brain, Behavior, and Immunity. 71, 23-27 (2018).
- Feng, P., et al. Immune cells of the human peripheral taste system: Dominant dendritic cells and CD4 T cells. Brain, Behavior, and Immunity. 23 (6), 760-766 (2009).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD. Journal of Visualized Experiments. (60), 3678 (2012).
- Axelsson, L. -G., Landström, E., Goldschmidt, T. J., Grönberg, A., Bylund-Fellenius, A. -C. Dextran sulfate sodium (DSS) induced experimental colitis in immunodeficient mice: Effects in CD4+-cell depleted, athymic and NK-cell depleted SCID mice. Inflammation Research. 45 (4), 181-191 (1996).
- Egger, B., et al. Characterisation of Acute Murine Dextran Sodium Sulphate Colitis: Cytokine Profile and Dose Dependency. Digestion. 62 (4), 240-248 (2000).
- Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. Murine Colitis Modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS). Journal of Visualized Experiments. (35), 1652 (2010).
- Howitt, M. R., et al. Tuft cells, taste-chemosensory cells, orchestrate parasite type 2 immunity in the gut. Science. 351 (6279), New York, N.Y. 1329-1333 (2016).
