Summary
在这里, 我们提出了一个方案, 以调查取消与阵风相关的基因对免疫反应的影响, 糊精硫酸钠 (dss) 诱导的炎症性肠病 (ibd) 小鼠模型。
Abstract
炎症性肠病 (ibd) 是一种与免疫有关的胃肠道疾病, 包括溃疡性结肠炎和克罗恩病, 影响着全世界数百万人的生活质量。ibd 症状包括腹痛、腹泻和直肠出血, 这可能是肠道微生物群、食物成分、肠道上皮细胞和免疫细胞相互作用造成的。评估肠道上皮和免疫细胞中表达的每个关键基因如何影响结肠炎症尤为重要。在肠道中发现了 g 蛋白偶联味觉受体, 包括 g 蛋白亚基α-gustducin 和其他信号蛋白。在这里, 我们以α-gustcducin 为代表, 描述了糊精硫酸钠 (dss) 诱导的 ibd 模型, 以评估味觉基因突变对肠道黏膜免疫和炎症的影响。该方法将基因敲除技术与化学诱导的 ibd 模型相结合, 可用于评估味觉基因失效的结果, 以及可能旺盛或抑制 dss 诱导的结肠免疫反应的其他基因。突变体小鼠在一定时期内使用 dss 进行监测和记录其体重、粪便和直肠出血。在给药过程中的不同时间点, 对一些小鼠进行安乐死, 然后测量其脾脏和结肠的大小和重量, 收集和处理肠道组织, 进行组织学和基因表达分析。数据显示, α-胃动素敲除导致过度减肥, 腹泻,肠道出血, 组织损伤, 和炎症相比, 野生类型的小鼠。由于诱导炎症的严重程度受小鼠菌株、居住环境和饮食的影响, 在试点实验中优化 dss 浓度和给药时间尤为重要。通过调整这些因素, 这种方法可以用来评估抗炎和促炎作用。
Introduction
炎症性肠病 (ibd)、克罗恩病 (cd) 和溃疡性结肠炎 (uc) 的两种主要形式的特点是慢性缓解或肠道进行性炎症的情况, 有多种因素的病因1,2.ibd 的发展取决于遗传以及某些环境因素, 如饮食、抗生素的使用, 以及重要的是致病性感染。然而, ibd 背后的病因和调控分子机制尚不清楚。因此, 许多化学诱导的 ibd 动物模型已经构建并应用, 以界定其发病机制和调节机制,并评估人类疗法的有效性3。
味觉受体是 g 蛋白偶联受体 (gpcr), 分为两种主要类型: i 型 (T1Rs) 和 ii 型 (T2Rs), 检测甜味、乌马米和苦味化合物。味觉信号级联是由味觉与 T1Rs 或 T2Rs 结合而开始的, 激活由α-gustpinin 和 gβγ二聚体组成的异位 g 蛋白, 并导致 gβ-γ亚基的释放。gβγ基团反过来刺激下游效应酶磷脂酶 c-β2 (plc-β2)。激活 plc-β2然后水解磷脂-4, 5-双磷酸酯水解成两个细胞内的次生信使 [肌醇-1, 4, 5-三磷酸 (ip 3) 和二酰基甘油], ip3结合并打开其通道受体 ip 3r3, 从内质网释放钙离子。这最终导致瞬态受体电位离子通道 trpm5 的开放和神经递质 atp 释放到味觉神经 4,5,6, 7.然而, 咸味和酸味的信号通路是不同的, 独立于甜味、乌米和苦味.此外, 味觉 gpcr 和下游蛋白的成分存在于各种口腔外组织中。最近的研究表明, α-gustducin, 味觉信号的主要组成部分, 被发现在肠道黏膜表达。需要进一步的研究来了解这些味觉信号成分在口腔外组织9,10的功能。
这里描述的方法是用来描述在口腔外组织中表达的味觉信号蛋白的功能。我们结合了转基因小鼠线开发的划定信号级联在味蕾与化学诱导的结肠炎模型。主要由于其程序简单和病理相似的人溃疡性结肠炎, 右旋糖酐硫酸钠 (dss) 诱导 ibd 模型已被最广泛地应用于各种化学诱导的结肠炎模型11。在这项研究中, 我们使用α-gustp型缺乏小鼠作为一个典型的小鼠行, 通过 1) 分析组织的形态变化和 2) 分析在表达的差异, 揭示α-gust糊涂 in 在肠道黏膜免疫和炎症中的新功能。与结肠炎症有关的细胞因子。这种方法可以用来定量和定性地确定味觉信号蛋白 (和其他蛋白质在肠道中表达) 对组织损伤和肠道炎症的贡献, 当转基因小鼠线的基因利息是可用的。这种方法的优点是使用户能够获得化学 dss 和感兴趣基因缺乏的作用所产生的综合数据。这种方法可以进一步改进, 以提高其敏感性, 并揭示在细胞和分子水平的微妙肠道变化。
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Protocol
浙江大学动物护理和使用机构委员会对所有涉及小鼠的实验进行了评审和批准。建议在执行本协议之前佩戴适当的个人防护设备。
1. 小鼠和 dss 的制备
- 将敲除小鼠 (α-gustducin-/-) 和年龄、性别和身体体重匹配的野生对照 (α-gustducin+/+) c57bl6 小鼠单独保存在干净的笼子里。
注: 淘汰赛小鼠与 c57bl6 小鼠的反交叉时间超过20代, 具有近 100% c57bl"的遗传背景。 - 将30克糊精硫酸钠 (dss) 粉末溶解在1升的蒸压水中。混合, 直到溶液变得清晰, 以确保最终的工作浓度为 3% (w/v)。
注: dss 解决方案可在室温下储存长达1周或在4°c 下储存, 直至使用。
2. 小鼠 dss 结肠炎的诱导与评价
- 称重并记录每只鼠标的初始体重。将小鼠单独放入标准塑料保持架, 并给保持架贴上标签。
- 用3% 的 dss 溶液代替普通饮用水, 总共 7天, 两组老鼠都能接触到。
- 测量鼠标的体重, 记录 dss 溶液的消耗, 并在 dss 管理期间每天收集和检查每只老鼠的粪便。观察腹泻和直肠出血的严重程度, 并将其转换为 dss 引起的疾病指数12。
- 在实验中, 计算了体重与初始体重的比较百分比和疾病指数, 以评估结肠炎的症状。
注: 疾病指数是通过结合腹泻和直肠出血观察得出的, 定义如下: 0 (正常大便, 无血), 1 (软性大便, 无血), 2 (软性大便, 少血), 3 (非常柔软的大便, 适度出血), 和 4 (水大便,显著出血)12。每天对每只老鼠的疾病指数进行分析。 - 在7天的 dss 治疗结束时, 用颈椎脱位牺牲小鼠, 并进行剩余的实验。
3. 组织样品的制备
- 将小鼠放置在仰角位置, 并用70% 乙醇清洁腹部皮肤。用一把小剪刀在腹部做一个3厘米长的中线切口, 露出腹腔。
- 使用一对钳子仔细地将脾脏从其他组织中分离出来, 然后取出脾脏并测量其大小。
- 用钳子识别和抬起结肠, 并将其与周围的肠系膜分开。拉出整个结肠, 直到胎粪和直肠可见。
- 将结肠在结肠边缘和骨盆深处横切, 分别释放近端和远端结肠, 从而隔离结肠。然后, 测量并记录隔离冒号的长度。在解剖过程中, 请注意不要损坏结肠组织。
- 用10毫升的冰凉磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 冲洗结肠, 用装有灌胃针的10毫升注射器冲洗结肠, 以去除粪便和血液, 直到洗脱完全清晰为止。
- 对于组织学鉴定, 将组织样本平均分为三个部分: 近端、中间和远端。然后, 在4°c 下用4% 的甲醛 (pfa) 在夜间固定组织。
- 为了分析细胞因子的表达, 用液氮快速冷冻整个结肠, 并将其储存在-80°c, 直到使用。
4. dss 诱发结肠炎严重程度的组织学评估
- 血红素和 eosin (h & amp; e) 染色
- 固定后, 将组织浸入 1 x pbs 中的30% 蔗糖溶液中, 在15毫升管中过夜, 以对样品进行冷冻保护。
- 将组织嵌入最佳切割温度 (oct) 化合物中, 并将其放置在-20°c, 直到 oct 变硬。
- 将含有组织的 oct 块转移到低温恒温器中, 将低温恒温器中的厚度刻度盘设置为12微米, 然后切片并收集12μm 厚的冷冻切片。
- 在高温板上, 将收集到的组织部分在65°c 的低温恒温器中加热20分钟。
- 用蒸馏水对切片进行短暂清洗。用血红素染色液染色 5分钟, 然后用自来水冲洗5分钟。
- 用0.5% 的盐酸乙醇对切片进行鉴别, 用30秒的时间, 然后在自来水中冲洗1分钟。然后, 在 1x pbs 中进行1分钟的清洗, 然后用自来水冲洗5分钟。
- 在70%、75%、80% 和95% 的酒精中对组织切片进行洗涤, 每次 10次. 在 eosin 染色溶液中进行2分钟的反染色。
- 每次通过95% 的酒精和2次绝对酒精变化进行脱水, 每次5分钟。在二甲苯的2次变化中清除5分钟。
- 根据上述 h & amp; e 染色结果, 对每只小鼠近端、中、远端结肠的组织损伤进行评分, 包括基因敲除和野生类型组。
注: 疾病指数是黏膜、粘膜下层、肌肉组织和浆膜区上皮损伤和炎症的综合评分, 定义如下: 0 (无组织损伤和炎症), 1 (焦点组织损伤和炎症), 2 (斑块)组织损伤和炎症), 和 3 (弥漫性组织损伤和炎症)12,13。然后对结肠近端、中部和远端每只老鼠的三个分数进行求和, 以获得每只动物的总分。然后计算每个组的平均分数。
- 免疫组织化学 14
- 在高温板上, 将收集到的组织部分在65°c 的低温恒温器中加热20分钟。用 1x pbs 清洗部分 3次, 每次10分钟。将组织切片在3% 的过氧化氢中培养 10分钟, 以消除内源性过氧化物酶。再清洗3下。在室温下, 用阻止缓冲液 (3% bsa、0.3% 非离子洗涤剂、2% 山羊血清、0.1% 的氮化钠) 在室温下固定组织1小时或更长时间。
- 用含有以下免疫细胞类型特异性原代抗体的溶液替换阻断缓冲液: 白细胞 cd45、t 细胞 cd3、b 细胞 b220、巨噬细胞 cd11b 和中性粒细胞 ly6g。在4°c 下隔夜孵化。
- 通过抽吸从组织切片中去除原发抗体。用 1x pbs 清洗3次, 每次10分钟。用生物素化二级抗体孵育切片, 然后在室温下用链霉素-hrp 复合物孵育。
- 用 3, 3 '-二胺化 (dab) 溶液对切片进行培养, 以形成浅棕色或深棕色的颜色, 并使免疫反应细胞可视化。
- 用血红素和 0.3% (v/v) 稀释氨的部分进行反色。在显微镜下以10倍的放大倍率拍摄明亮的场图像。
- 使用图像处理程序, 通过设置2个面罩, 识别和量化上皮和固有层 (上皮下方) 中标记免疫细胞的数量: 使用基于颜色的特征中的第一个掩码来设置颜色检测阈值和测量有色 dob 反应区;使用第二个面膜来确定检查部分中的上皮和固有层的总面积。将免疫反应细胞群表示为浸润细胞染色面积与被检测组织总面积的比率。
5. dss 诱导结肠炎的基因表达评估
- 从 dss 处理的基因敲除和野生类型小鼠的-80°c 冷冻机中提取结肠组织, 在25毫克的组织中加入0.6 毫升的裂解缓冲液, 然后在均质机中进行均质化。
- 按照 rna 提取试剂盒的协议提取总 rna, dnase i 用于消除任何污染基因组 dna。
- 运行琼脂糖凝胶, 以检查提取的 rna 的质量。如果它的 28s rna 带比18s 波段更明亮, 它是可用的。取1μl 的 rna 样品, 在微分光光度计上确定 rna 浓度。
- 将总 rna 的1微克与2.5 微米的 20 mm 寡核苷酸 (dt)12、13、14、15、16、17、18底漆和 1μl moloney 小鼠白血病混合病毒 (mmlv) 逆转录酶。在42°c 下孵化 60分钟, 准备 cdna。
- 除了2x 荧光绿色染料外, 还将 cdna 的1μl 与 tnf、ifn-γ、il-5、il-13、il-10、tgf-β1和β-actin 的正向和反向 qpcr 引物混合, 建立实时 pcr 反应, 作为一种控制。
- 运行 qpcr 的参数如下: 95°c 10分钟, 然后是45°c 的 95°c, 25秒, 72°c, 72°c。
- 用 2-ct方法15计算基因表达的相对定量。与淘汰赛的基因表达水平进行了比较分析。野生类型的老鼠。
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Representative Results
通过在饮用水中对α-瓜司素敲除 (ko) 和野生类型 (wt) 小鼠进行3% 的 dss 处理, 建立了 dss 诱导的 ibd 程序。与 wt 小鼠相比, 淘汰赛小鼠表现出更严重的结肠炎, 体重过多、腹泻和肠道出血 (图 1)。用 h & amp; e 染色作为组织学方法, 在7天的 dss 给药后, 分析了组织完整性的差异, 在敲除小鼠的近端、中、远端结肠中发现的组织损伤比 wt 小鼠严重。图 2)。此外, 过度的免疫激活导致结肠炎与各种炎症细胞, 如巨噬细胞和中性粒细胞的浸润。利用免疫细胞的一些标记进行免疫组织化学分析, 以确定α-瓜斯特霉素缺乏症是否影响免疫细胞浸润。对比分析表明, 与 wt 对照小鼠相比, 敲除小鼠白细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的浸润显著增加 (图 3)。最后, 利用 qpcr 和基因特异性引物测定了 dss 诱导的结肠炎小鼠结肠中的一些细胞因子表达水平。结果表明, 与 wt 小鼠相比, 敲除小鼠的 tnf 和 ifn-γ表达水平较高, 而白细胞介素-5、il-13 和 il-10 的表达水平较低;然而, 在淘汰赛小鼠和 wt 小鼠 tgf-β1的表达水平上没有差异 (图 4)。
图 1: dss 给药使α-瓜司汀敲除 (ko) 中的结肠炎更加严重.(a) 体重减轻的百分比: ko 小鼠从第3天开始身体体重下降明显较多。(b) 基于腹泻和直肠出血严重程度的结肠炎疾病指数: ko 小鼠的疾病指数明显高于 wt 对照组。(c) 结肠 (上板) 和脾脏 (下面板) 从代表性 wt 和 ko 小鼠在 dss 管理7天后: ko 小鼠有明显较短的结肠和更大的脾脏。误差条表示 sem (* p & lt; 0.05, * * p & lt; 0.005, * * p & lt; 0.0005;方差分析与后特殊 t 测试)。刻度条 = 1 厘米。这一数字已从以前的出版物13中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: α-gustpinko 小鼠在 dss 治疗后表现出更严重的组织损伤.(a) wt 和α-gustp早年 ko 小鼠的结肠组织的 h & amp; e 染色未经过 dss (水) 处理或经过 7天 dss 处理 (dss)。(b) dss 给药7天后, 根据 wt 和 ko 小鼠结肠组织的组织学染色, 对组织损伤评分。dss 治疗导致 wt 结肠组织损伤, 这在 ko 标本中的情况要严重得多。误差条表示 sem (* p & lt; 0.05)。刻度杆 = 50μm。这一数字已从以前的出版物13中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: α-gustpinko 小鼠在 dss 诱导的结肠炎中表现出免疫细胞的浸润增加.(a) dss 治疗的 ko 小鼠结肠中的大规模免疫细胞浸润。(b) 免疫细胞数量的量化: 根据图像分析, 免疫染色区域除以测量组织总面积的百分比。误差条表示 sem. 刻度条 = 50μm。这一数字已从以前的出版物13中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: α-胃动素 ko 小鼠在 dss 诱导的结肠炎中表现出不同的免疫细胞因子表达水平.与 wt 小鼠相比, dss 处理增加了 tnf 和 ifn-γ的表达, 减少了 ko 小鼠结肠中白细胞介素-5、il-13 和 il-10 的表达。采用基因特异性引物进行实时定量 rt-pcr。β-肌动蛋白被用作内部控制基因。误差条表示 sem (* p & lt; 0.05, * * p & lt; 0.005)。这一数字已从以前的出版物13中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
表 1: 使用的引物清单。
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Discussion
该方法可用于定量测定特定味觉基因突变对 dss 诱导的 ibd 小鼠模型炎症的影响。要充分利用 ibd, 最佳的 ibd 归纳是关键的一步。结肠炎的发展受多种因素的影响, 包括小鼠菌株、居住环境、肠道菌群以及感兴趣的基因。建议对少数小鼠进行试点实验, 以测试 dss 给药的不同剂量和持续时间。在试点实验中, 体重减轻、腹泻、肠道出血等严重症状, 以及组织损伤、免疫细胞浸润相关炎症、细胞因子表达水平变化等微观症状。分析并比较了没有 dss16、17、18、19的有饮用水的对照组。通过分析 dss 治疗期间小鼠体重的日变化和收集的大便的分数, 可以监测诱发结肠炎的严重程度。dss 治疗后, 可通过 h & amp; e 染色评估结肠冷冻切片的组织损伤, 而免疫细胞浸润和细胞因子表达水平可通过免疫组织化学和 qpcr 进行鉴定和量化。dss 的剂量, 给药时间和饮食可以调整, 以揭示味觉基因突变对结肠免疫反应的微妙影响。然而, 这种方法的敏感性可能仍然会限制其在研究其他一些基因的最小影响方面的应用。在这种情况下, 可以采用一些修改;例如, 通过使用抗生素来最大限度地减少来自个人特有肠道菌群的变量。
dss 诱导的结肠炎模型在化学代理诱导的 ibd 模型中得到了最广泛的应用, 这主要是由于它的简单性、快速性、重现性、可控性, 最重要的是它与人类溃疡性结肠炎的相似性。有用的评估人类疗法2的有效性.研究人员必须意识到的一个缺点是, 结肠炎的发展不需要 t 和 b 细胞, 结肠炎与人类疾病的发展不同。然而, 它可能是有益的研究先天免疫系统在发展急性结肠炎2的作用。
本研究建立了 dss 诱导的 ibd 模型, 该模型采用α-胃素缺乏小鼠, 可用于研究 g 蛋白α亚基在肠道黏膜免疫和炎症中的新功能。结果表明, 缺乏α-gustducin 的小鼠更容易感染 dss 引起的结肠炎, 并伴有更严重的症状, 包括组织损伤、过度炎症反应和强效细胞因子13表达改变。与最近的研究结果一致, 表明味觉样化学感觉通路参与了 ii 型对肠道寄生虫的免疫反应20, α-gustducin 和其他味觉信号蛋白可能在肠道中具有新的和重要的功能免疫平衡。然而, 这些扭曲的免疫反应背后的确切分子机制仍有待揭示。
此外, 这种方法还可用于研究结肠中表达的其他味觉基因 (例如,瞬态受体电位离子通道 trpm5, 它对甜味、苦味和 umami 口味和在人结肠中表达至关重要) 的影响。单元格7)。最后, 同样的策略也可以用来发现关键蛋白质的新功能和肠道免疫中的因素, 并帮助评估某些人类疾病的新治疗方法的有效性。
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Disclosures
提交人声明, 他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了国家自然科学基金会 (81671016、31471008、3161613030) 和国家卫生研究院 (dc010012、dc015819) 和四元基金会的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. |
References
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