Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Fluorescerende sølv farvning af proteinerne i polyacrylamidgeler

Published: April 21, 2019 doi: 10.3791/58669

Summary

Her beskriver vi en detaljeret protokol skitserer en ny fluorescerende farvning teknik til påvisning af total protein i polyacrylamidgeler. Protokollen udnytter en sølv ion-specifikke fluorescens turn-on sonde, som registrerer Ag+-proteinkomplekser, og fjerner visse begrænsninger af traditionelle kromogent sølv pletter.

Abstract

Sølv farvning er en kolorimetrisk teknik udbredt at visualisere protein bands i polyacrylamidgeler efter sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE). De klassiske silver pletter har visse ulemper, såsom høj baggrund farvning, dårlig protein opsving, lave reproducerbarhed, et smalt lineære dynamikområde til kvantificering og begrænset kompatibilitet med massespektrometri (MS). Nu, med brug af en fluorogenic Ag+ sonde, TPE-4TA, vi udviklet en fluorescerende sølvfarvning metode for total protein visualisering i polyacrylamidgeler. Denne nye pletten undgår besværlige sølv reduktion trin i traditionelle sølv pletter. Desuden, den fluorescerende sølv plet viser god reproducerbarhed, følsomhed og lineær kvantificering dobbel­ protein, hvilket gør det en nyttig og praktisk protein gel pletten.

Introduction

Mange farvning metoder har været brugt til at visualisere proteiner efter gelelektroforese, for eksempel ved hjælp af kolorimetriske farvestoffer såsom Coomassie strålende blå, sølv plet, fluorescens, eller radioaktive mærkning1,2, 3 , 4. sølv farvning anses for at være en af de mest følsomme teknikker til protein registrering kræver enkle og billige reagenser. Det kan inddeles i to store familier: den ammoniakalsk sølv plet og sølv nitrat pletten5,6. I basisk ammoniakalsk sølv metode, er sølv-diamin komplekset produceret med ammoniak og natriumhydroxid og reduceret til metallisk sølv under udvikling ved hjælp af en sure formaldehyd løsning. Pletten rummer effektivt for grundlæggende proteiner, men viser en kompromitteret ydeevne for sure og neutral proteiner og er desuden begrænset til klassisk glycin og taurin elektroforese systemer. I sammenligning, sølv nitrat pletter udnytte det høje bio-affinitet af sølv ioner til protein, primært sulfhydryl og carboxyl grupper fra sidekæder, og har tendens til at plette sure proteiner mere effektivt7. Efter sølv ion bindende, en udviklende løsning (typisk lavet af en metal karbonat løsning som indeholder formaldehyd og natrium thiosulfat) er anvendt til at reducere sølv-ioner til metallisk sølv korn, som opbygger en brun til mørk farve til at visualisere den protein bands.

Selvom sølv farvning har været kendt for sin alsidighed og høj følsomhed siden sin udvikling i 1970s8, er metoden ofte betragtes som vanskelig. Sølv-farvning metoder har tid-begrænset trin og vise lav reproducerbarhed. Da farven på sølv plet ikke er normalt ensartede og afhængige af trinnet reduktion, som er svært at styre, den sølv plet er ikke en kvantitativ metode og således anbefales ikke til gel sammenligning undersøgelse og protein kvantificering9. Metoder optimeret i følsomhed kan udnytte aldehyder, som også kan give en mere ensartet farvning10. Dette er dog på bekostning af videre downstream analyse på grund af crosslinking af proteiner af aldehyder. Hurtig protokoller for det meste kombinere eller forkorte trin for at reducere tid, at kompromittere reproducerbarhed og ensartethed af pletten5. Som et resultat, er der talrige sølvfarvning varianter inden for protein gel farvning, hver optimeret passer til visse krav; for eksempel, enkelhed, følsomhed eller peptid genfindingsprocenten for downstream analyse. Disse attributter kan også have en indvirkning på hinanden, og opfylder alle krav i en protokol kan være svært.

I dette arbejde introducerer vi en ny fluorescerende sølvfarvning metode til påvisning af protein i polyacrylamid gel. I denne metode bruger vi en fluorogenic sonde til sølv ioner, TPE-4TA (figur 1), til at visualisere sølv-imprægneret proteiner11. TPE-4TA er designet af sammenlægning-induceret emission (Bjarne) princippet. Det er ikke-emissive når opløst i en vandig opløsning, men er meget emissive i nærværelse af sølv ioner. Ved at erstatte den kromogent udvikling i traditionelle sølv pletter med en fluorogenic udvikle skridt, giver den fluorescerende sølv metode robust farvning af samlede proteiner med en mindre baggrund.

Desuden, den fluorescerende sølv plet viste en god lineær dynamikområde for protein kvantificering, som er sammenlignelige med de udbredte SYPRO Ruby pletten og ikke kan opnås med traditionelle sølv pletter. Gelen kan være afbildet på almindeligt anvendte gel dokumentationssystemer med en ultraviolet lampe (excitation bølgelængde: 302/365 nm kanal; emission: ~ 490-530 nm) på mange biologiske laboratorier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af Gel

Bemærk: Demonstrationen følger en standardprotokol for at forberede gel til farvning kort efter SDS-PAGE12. I korte træk følgende trin beskriver forberedelse af prøver og gel elektroforese.

  1. Udføre SDS-PAGE med 4% - 12% Bis-Tris protein geler (1 mm, 15-godt) ved hjælp af en mini gel tank fyldt med 2-(N -morpholino) ethanesulfonic syre (MES) buffer.
  2. Fortynd prøver med en blanding af destilleret vand, lithium dodecyl sulfat (LDS) buffer og en prøve-reducerende middel.
  3. Indlæse den første lane med dobbelt beløb af materiel (10 µL), efterfulgt af den normale bestandene mængde (5 µL) og en række Tofoldsfortyndinger af bestanden derefter (13 fortyndinger, fra 2 x til 8192 x).
  4. Kør gelen på en konstant spænding 200 V i 30 min.

2. fiksering af Gel

  1. Efter elektroforese, dykke geler i en 100 mL opløsning af 40% ethanol/10% eddikesyre på en orbitalryster på 50 rpm ved stuetemperatur 2 x (hver i 30 min), eller natten over ved 4 ° C.
  2. Vask geler 3 x 10 min. hver i ultrarent vand i en ren beholder. Trinnet vask er kritisk. Hvis syre fra fastsættelse af løsningen ikke er fjernet korrekt i fluorogenic tredje trin, den overdrevne TPE-4TA vil blive aktiveret af syre og føre til stærk baggrund fluorescens i gelen.

3. forberedelse af AgNO3løsning og sølv imprægnering af Gel

  1. At gøre AgNO3 løsning (0,0001%) til imprægnering, først, 0,01 g opløses AgNO3 i 10 mL i ultrarent vand til at forberede en 0,1% AgNO3 stamopløsning. Dernæst tilsættes 100 µL af 0,1% AgNO3 stamopløsningen i 100 mL i ultrarent vand for at gøre brugsopløsning.
    Bemærk: AgNO3 løsning skal opbevares i mørke før brug.
  2. Imprægnere gel med 100 mL af sølv arbejder løsning i 1 time på en orbitalryster på 50 rpm i en forseglet glasbeholder. Det er afgørende at udføre sølv imprægnering under et stinkskab, beskyttet mod lys med aluminiumsfolie.
  3. Vaske gel med ultrarent vand (ca. 100 mL) i en ren beholder til 2 x 60 s.

4. Fluorogenic udvikling af Gel

  1. For at forberede farvestof stamopløsningen (0,1 mM), skal du tilføje 3,0 mg af TPE-4TA farvestof i 50 mL i ultrarent vand. Der sonikeres løsningen i et par minutter og tilføje nogle natriumhydroxidoploesning (for eksempel 1 M) til at hjælpe opløse farvestoffet.
  2. Kontrollere fluorescens af løsning under en 365 nm UV lampe til at sikre, at farvestof molekyle er helt opløst. Kun viser svage eller nonemissive løsninger fuld opløsning.
    Bemærk: Farvestoffet TPE-4TA blev syntetiseret følgende til protokollen for nylig rapporteret af Xie et al. 10 TPE-4TA løsning er meget stabil og kan opbevares i mørke i måneder.
  3. For at forberede 100 mL fluorogenic udvikle opløsning (10 µM), der tilsættes 10 mL af stamopløsningen TPE-4TA til 90 mL i ultrarent vand. Tjek pH af løsningen ved hjælp af et pH-meter og finjustere det til 7-9 ved hjælp af en natriumhydroxidopløsning (1 µM).
  4. Overføre gel til en ren og sealable beholder med 100 mL af fluorogenic udvikling. Kontroller gel er helt nedsænket i løsningen. Forsegle beholderen. Dække det fra lys og ryste det natten over på en orbitalryster på 50 rpm ved stuetemperatur. Alternativt kan inkubation skridt også forkortes til ca ~ 2 h af forvarmning AIE udvikle løsningen til 80 ° C til farvning og derefter overlade det til stuetemperatur.

5. affarvning og billedbehandling

  1. Overføre gel til en ren beholder og destain det i 100 mL 10% ethanol i 30 min.
    Bemærk: Vand alene kan bruges til at vaske gel. Det er imidlertid mere tid-effektive at bruge en 10% ethanol løsning for den affarvning. Dette vil bidrage til at reducere destaining processen fra timer til 30 min.
  2. Skyl gel i ultrarent vand i 5 min.
  3. Billede gel på 302 nm tv en gel dokumentation maskine eller 365 nm kanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protein bands plettet af fluorescerende sølv pletten udviser en intens grøn fluorescens under en 365 nm UV-lampe. Alle 14 protein bands (10-200 kDa), var fra top til bund, klart synlige, korrelerede godt med 14 rød-farvede dem farves af SYPRO Ruby farvestof (figur 2)10.

Med hensyn til kvantitativ protein påvisning, geler blev afbildet af en gel imaging system ved hjælp af automatiserede procedurer, og billederne blev analyseret og sammenlignet med den kommercielle software. Denne fluorescerende sølvfarvning metode synes at have en høj opløsning. For nogle protein bands er følsomheden af de fluorescerende sølv plet også lidt bedre end i fluorescerende SYPRO Ruby pletten. Navnlig blev udførelsen af de fluorescerende sølv plet forbedret for ~ 10 til 40 kDa protein bands, der angiver, at den nye metode er især nyttig til påvisning af proteiner med lav molekyle vægte. Dataene tyder også på at de fluorescerende sølv plet gav en god og ensartet linearitet for alle 14 proteiner over et relativt bredt interval for protein kvantificering (figur 3)11.

I modsætning til sølv nitrat pletten, som gav et højt niveau af baggrunden signal og forvrænget toppe, opdaget den fluorescerende sølv plet bands med en god kontrast og ensartet intensitet distribution SYPRO Ruby pletten kan sammenlignes på tværs af alle 14 proteiner (Figur 3).

Bemærk, at utilstrækkelig vask efter gel fiksering vil resultere i høj baggrund farvning (figur 4). De resterende eddikesyre vil lyse op TPE-4PA og føre til en stærk baggrund.

Figure 1
Figur 1: Kemiske struktur af TPE-4TA og dens sensing mekanisme til Ag+. X = H eller Na+. Tilpasset fra tidligere arbejde, copyright 2018 WILEY-VCH11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: fluorescerende sølv farvning. A) sammendrag af protokollen. B) en sammenligning af geler plettet af fluorescerende sølv plet (venstre) og SYPRO Ruby pletten (højre) afbildet parallelt med en håndholdt UV lampe under 365 nm bestråling. Proteiner (10-200 kDa) blev indlæst ved dobbelt seriel fortynding fra 200-500 ng/band på det mest venstre vognbane. Tilpasset fra tidligere arbejde, copyright 2018 WILEY-VCH11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: fluorescens intensiteten af proteiner mod protein beløb, repræsentative gel billeder og signal profiler (fra den femte lane) af geler med tre forskellige pletter. (A) sølvnitrat pletten,()B) fluorescerende sølv plet (365 nm excitation), og (C) SYPRO Ruby pletten. Den første kolonne af figuren viser intensiteten af pletten for hvert bånd af de 14 proteiner (10-200 kDa) mængden af protein normaliseret til den første lane (startende til venstre). Anden kolonne viser de repræsentative gel billeder af tilsvarende pletten. Mængden af protein indlæses i gelen er beskrevet i figur 2. Tilpasset fra tidligere arbejde, copyright 2018 WILEY-VCH11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: farvet gel fra en suboptimal eksperiment. I dette eksperiment var vask utilstrækkeligt efter fiksering trin. De resterende eddikesyre induceret sammenlægning af TPE-4TA og forårsagede en stærk baggrund. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Præsenteres her er en roman fluorescerende sølv farvning metode til proteiner i polyacrylamidgeler. Denne strategi integreres konventionel sølv pletter og fluorescerende pletter. Farvning udnytter den selektive binding af sølv ion til proteiner som i andre sølv pletter men beskæftiger en yderst følsom fluorogenic sølv sonde TPE-4TA til at lyse op de sølv bundne proteiner. Da fluorogenic sonde TPE-4TA kan fornemme sølv ioner i en forholdsvis lav koncentration i nanomolar vifte11, giver det en meget følsomme registrering uden yderligere efterspørgsel af en reduktionistisk visualization trin efter behov i traditionelle sølv pletter. Dette vil minimere run-hen til-opstille variationer. I mellemtiden, man undgår brug af skrappe kemikalier, herunder formaldehyd og glutaraldehyd, som ofte forstyrrer peptid identifikation i MS analyse. Desuden, som TPE-4TA er AIE-aktive og fri for enhver selvstændig quenching problemer, de tætbefolkede akkumulerede farvestoffer på et protein band kan udsende kollektivt svar på antallet af farvestof molekyler. Dette bidrager til en bred lineære dynamiske område (LDR) til registrering af protein og en meget lysere farvning sammenlignet med SYPRO Ruby pletten.

Sammenlignet med traditionelle sølv farvning, en betydeligt mindre mængde sølvnitrat er påkrævet for denne nye farvning teknik-specifikt, 0,0001% fra 0,1% rapporterede i almindeligt brugt sølv nitrat farvning protokoller4. Det kan være en hypotese, at succesen med nye pletten er rent ned til kombinationen af utrolig lyse og følsomme fluorescerende sonden baggrund en høj kontrast. I sammenligning kræver reduktion i løbet af det tredje trin i traditionelle sølv pletter en højere mængde af silver til producere mørke synlige bands, især når det sker på baggrund en høj. I denne metode er fluorogenic udviklingstid længere end den traditionelle kemiske udvikling; imidlertid kan dette blive drøftet som en begrænsning eller som en fordel. Gelen kan blive siddende i den tredje løsning for lange perioder med ingen konsekvenser, hvilket resulterer i lavere variationer, der kan stamme fra operatøren. Ikke alene er der færre trin påkrævet, men også flere pauser kan tages, hvilket gør denne protokol ganske nem. Der er ingen risiko for overstaining i modsætning til i den traditionelle tredje trin, som kan overdevelop gel, hvilket resulterer i en mørk baggrund. Denne fluorescerende sølv plet er også forventes at have en mindre interprotein variation, omend en yderligere vurdering af ekstra protein prøver er berettiget (figur 3).

Det er afgørende at følge den foreslåede sølvnitrat koncentration fra protokollen; anvende en højere koncentration medfører ikke bedre ydeevne og følsomhed, men i stedet, producerer en stærk baggrund fluorescens, der kan opsluge fluorescens af bandene. Med hensyn til fejlfinding, kan tab i følsomhed og lysstyrke skyldes overdreven vask taktfast vask før fluorogenic udvikling eller fra utilstrækkelig sølv imprægnering. Til denne metode er fluorescens signalet af protein band afhængig af antallet af protein-bundet sølv ioner, der er afgørende for dannelsen af fluorescerende TPE-4TA-Ag+ kompleks. Protein bør være mættet med sølv-ioner til at maksimere potentialet i denne farvning metode.

Endelig, som nævnt tidligere, fluorogenic farvestoffet for sølv ion brugt i denne metode, TPE-4TA, er også pH følsomme. En lav pH kan protonate den gratis TPE-4TA til fluorescerer i gelen, hvilket resulterer i en høj baggrunden pletten. Derfor upassende vask trin, som efterlader resterende eddikesyre fra fiksering løsning, vil i høj grad påvirke pletten kvalitet. Det er vigtigt at holde gelen forholdsvis neutral i pH i trinnet fluorogenic udvikling (figur 4). Det kunne også være nyttigt at justere pH i opløsningen TPE-4TA før farvning. Det forventes, at dette farvestof vil blive kommercialiseret i den nærmeste fremtid.

I sammendrag beskrev vi en praktisk protokol af den roman fluorescerende sølv plet for visualisering af samlede proteiner i SDS-PAGE gel. Farvning er ligetil, let at bruge, omkostningseffektive, og har en god farvning ydeevne. Denne metode kan i høj grad lette identifikation af protein bands i geler og giver et nyttigt redskab for proteinanalyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

En patentansøgning på denne fluorescerende sølv farvning er indgivet.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Patrick Chan på Ming Wai Lau centrum for Reparative medicin, Karolinska Institutet, for hans teknisk support. S. X. er taknemmelig for støtten fra det svenske Forskningsråd (Grant No. 2017-06344).

Materials

Name Company Catalog Number Comments

LDS Sample Buffer (4X)
Thermo Fisher Scientific NP0007 Reagent

4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well
Thermo Fisher Scientific NP0323BOX Precast gel
Sample Reducing Agent (10X) Thermo Fisher Scientific NP0004 Reagent
MES SDS Running Buffer (20X) Thermo Fisher Scientific NP0002 Reagent
Mini Gel Tank Thermo Fisher Scientific A25977 Equipment
300W Power Supply (230 VAC) Thermo Fisher Scientific PS0301 Equipment
Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26614 Sample
Silver nitrate Sigma-Aldrich 31630-25G-R Reagent
Ethanol Bragg and co. 42520J Reagent
Acetic acid J.T. Baker 103201A Reagent
Milli-Q Synthesis A10 Merk - Provides 18.2 MΩ.cm water
gel documentation system (c600 model) Azure biosystems - Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
  2. Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
  3. Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
  4. Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
  5. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
  6. Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
  7. Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
  8. Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
  9. Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
  10. Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
  11. Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
  12. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

Tags

Biokemi spørgsmålet 146 sølv farvning fluorescerende gel farvning sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE) sammenlægning-induceret emission (Bjarne) sølv ion sensor fluorogenic opdagelse proteomics
Fluorescerende sølv farvning af proteinerne i polyacrylamidgeler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, A. Y. H., Xie, S., Tang, B.More

Wong, A. Y. H., Xie, S., Tang, B. Z., Chen, S. Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels. J. Vis. Exp. (146), e58669, doi:10.3791/58669 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter