Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Published: April 21, 2019 doi: 10.3791/58669

Summary

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol waarin een nieuwe TL kleuring techniek voor de detectie van de totale proteïne in polyacrylamide gels. Het protocol maakt gebruik van een zilveren ion-specifieke fluorescentie turn-on sonde, die Ag+detecteert-eiwitcomplexen, en elimineert bepaalde beperkingen van traditionele chromogenic zilveren vlekken.

Abstract

Zilveren kleuring is een colorimetrische techniek op grote schaal gebruikt om te visualiseren van eiwitten bands in polyacrylamide gels na natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina). De klassieke zilveren vlekken hebben bepaalde nadelen, zoals hoge achtergrond kleuring, slechte eiwit recovery, lage reproduceerbaarheid, een smalle lineaire dynamische bereik voor kwantificering en beperkte compatibiliteit met massaspectrometrie (MS). Nu, met het gebruik van een fluorogenic Ag+ sonde, TPE-4TA, ontwikkelde we een fluorescerende silver kleuring van de methode voor de totale eiwit visualisatie in polyacrylamide gels. Deze nieuwe vlek vermijdt de lastige zilveren vermindering stap in traditionele zilveren vlekken. Bovendien toont de fluorescerende zilveren vlek aan lineaire kwantificering detectie van eiwit, waardoor het een nuttige en praktische eiwit gel vlek, goede reproduceerbaarheid en gevoeligheid.

Introduction

Vele kleuring methoden zijn gebruikt om te visualiseren van eiwitten na de Elektroforese van het gel, bijvoorbeeld met behulp van colorimetrische kleurstoffen zoals Coomassie briljant blauw, zilver vlek, fluorescentie, of radioactieve labeling van1,2, 3 , 4. Zilveren kleuring wordt beschouwd als een van de meest gevoelige technieken voor de detectie van de eiwitten die eenvoudige en goedkope reagentia. Het kan worden onderverdeeld in twee grote families: de ammoniumstikstof zilveren vlek en de zilvernitraat vlek5,6. In de alkalische ammoniumstikstof zilveren methode, is de zilver-diamine-complex geproduceerd met ammoniak en natriumhydroxide en gereduceerd tot metallisch zilver tijdens de ontwikkeling met behulp van een zure formaldehyde-oplossing. De vlek herbergt efficiënt voor fundamentele eiwitten maar toont een gecompromitteerde prestaties voor zure en neutrale eiwitten en is bovendien beperkt tot klassieke glycine en taurine elektroforetische systemen. Ter vergelijking: de zilvernitraat vlekken exploiteren de hoge bio-affiniteit van zilver ionen aan proteïne, voornamelijk de sulfaatzuurstof carboxyl groepen van de zijketens en de neiging om vlekken van zure eiwitten efficiënter7. Na zilver ion bindend, een derde oplossing (meestal gemaakt van een oplossing van de metalen carbonaat met formaldehyde en natrium thiosulfaat) wordt toegepast ter vermindering van zilver-ionen tot metallisch zilver korrels, die een kleur bruin-naar-dark opbouwen te visualiseren de eiwit bands.

Hoewel zilver kleuring goed-gekend voor zijn veelzijdigheid en hoge gevoeligheid sinds haar ontwikkeling in de jaren 1970-8 is, wordt de methode vaak beschouwd als lastig. Zilver-kleuring methoden hebben tijd-beperkte stappen en reproduceerbaarheid van de lage tonen. Omdat de kleur van de zilveren vlek meestal niet is uniform en afhankelijk van de vermindering van de stap, die moeilijk te controleren is, de zilveren vlek is niet een kwantitatieve methode en, dus, niet aanbevolen voor gel vergelijking studie en eiwit kwantificering9. Methoden geoptimaliseerd in gevoeligheid kunnen gebruik maken van aldehyden die kunnen ook zorgen voor een meer uniform kleuring10. Dit is echter ten koste van verder stroomafwaarts analyse als gevolg van het crosslinking van eiwitten door aldehyden. Snelle protocollen meestal combineren of verkorten stappen ter vermindering van de tijd, de reproduceerbaarheid en de eenvormigheid van de vlek5in gevaar te brengen. Dientengevolge, zijn er talrijke zilver kleuring varianten binnen eiwit gel kleuring, elk geoptimaliseerd voor bepaalde wensen; bijvoorbeeld, eenvoud, gevoeligheid, of peptide terugvinding voor downstream-analyse. Deze kenmerken kunnen ook een invloed hebben op elkaar kan, en die voldoen aan alle eisen in één protocol moeilijk.

In dit werk introduceren wij een nieuwe TL silver methode voor de detectie van de eiwitten in polyacrylamidegel kleuring. In deze methode gebruiken we een fluorogenic-sonde voor zilver-ionen, TPE-4TA (Figuur 1), te visualiseren de zilver-geïmpregneerd eiwitten11. TPE-4TA is ontworpen door de aggregatie-geïnduceerde emissie (AIE)-principe. Het is niet-emissieve wanneer opgelost in waterige oplossing, maar is zeer emissieve in aanwezigheid van een zilver-ionen. Door vervanging van de chromogenic ontwikkeling in traditionele zilveren vlekken met een fluorogenic ontwikkeling van de stap, kunt de fluorescerende zilveren methode de robuuste kleuring van totale eiwitten met een beperkte achtergrond.

Bovendien bleek de fluorescerende zilveren vlek een goede dynamisch lineaire bereik voor eiwit kwantificering, die vergelijkbaar is met de veel gebruikte SYPRO Ruby vlek niet haalbaar is met traditionele zilveren vlekken en. De gel kan worden beeld op documentatiesystemen gebruikte gel met een UV-lamp (excitatie golflengte: 302/365 nm kanaal; emissie: ~ 490-530 nm) bij vele biologische labs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding van het Gel

Opmerking: De demonstratie volgt een standaardprotocol ter voorbereiding van het gel van kleuring kort na SDS-pagina12. Kortom, de volgende stappen beschrijven de voorbereiding van de monsters en gel elektroforese.

  1. SDS-pagina met 4% - 12% Bis-Tris eiwit gels (1 mm, 15-well) uitvoeren met behulp van een mini gel tank gevuld met 2-(N -morfolino) ethanesulfonic zuur (MES) buffer.
  2. Verdun de monsters met een mengsel van gedestilleerd water, lithium dodecyl sulfaat (LDS) buffer en een monster-reducerende agent.
  3. Laden van de eerste baan met dubbele van het bedrag van aandelen (10 µL), gevolgd door de normale voorraad bedrag (5 µL) en een reeks tweevoudige verdunningen van het materieel daarna (13 verdunningen, van 2 x tot 8192 x).
  4. Stel de gel met een constante spanning van 200 V voor 30 min.

2. de fixatie van het Gel

  1. Na elektroforese, dompelen de gels in een 100 mL oplossing van 40% ethanol/10%-azijnzuur op een roteerschudapparaat 50 rpm bij kamertemperatuur 2 x (elk gedurende 30 minuten), of 's nachts bij 4 ° C.
  2. De gels 3 x 10 minuten, elk in ultrazuiver water in een schone recipiënt te wassen. De wassen stap is essentieel. Als het zuur uit de fixing oplossing is niet correct verwijderd in de derde stap van fluorogenic, de buitensporige TPE-4TA wordt geactiveerd door het zuur en leiden tot sterke achtergrond fluorescentie in de gel.

3. voorbereiding van de AgNO3oplossing en zilveren impregneren van het Gel

  1. Om de oplossing3 AgNO (0,0001%) voor de impregnering, de eerst los 0.01 g van AgNO3 in 10 mL ultrazuiver water voor te bereiden van een stamoplossing van 0,1% AgNO3 . Voeg 100 µL van de stockoplossing van 0,1% AgNO3 vervolgens in 100 mL ultrazuiver water om de werkoplossing.
    Opmerking: De AgNO3 oplossing moet worden opgeslagen in het donker vóór gebruik.
  2. De gel met 100 mL werkoplossing gedurende 1 uur op een roteerschudapparaat 50 rpm in een gesloten glazen container zilver impregneren. Het is van cruciaal belang voor het uitvoeren van de zilveren impregnering onder een zuurkast, beschermd tegen licht met aluminiumfolie.
  3. Wassen van de gel met ultrazuiver water (ongeveer 100 mL) in een schone container voor 2 x 60 s.

4. Fluorogenic ontwikkeling van het Gel

  1. Ter voorbereiding van de stockoplossing kleurstof (0.1 mM), in 50 mL ultrazuiver water met toevoegen van 3,0 mg van de kleurstof TPE-4TA . Bewerk ultrasone trillingen ten de oplossing voor een paar minuten en sommige NaOH-oplossing (bijvoorbeeld 1 M) om te helpen oplossen van de kleurstof toe te voegen.
  2. Controleer de fluorescentie van de oplossing onder een 365 nm UV lamp om ervoor te zorgen dat de kleurstof molecule volledig is opgelost. Zwakke of nonemissive oplossingen geven alleen volledige ontbinding.
    Opmerking: De kleurstof die TPE-4TA werd gesynthetiseerd volgende het protocol onlangs gemeld door Xie et al. 10 de TPE-4TA oplossing is zeer stabiel en kan worden bewaard in het donker voor maanden.
  3. Ter voorbereiding van 100 mL van de fluorogenic ontwikkelen oplossing (10 µM), voeg toe 10 mL van de stockoplossing van TPE-4TA in 90 mL ultrazuiver water. Controleer de pH van de oplossing met behulp van een pH-meter en het af te stemmen op 7-9 met behulp van een natriumhydroxide-oplossing (1 µM).
  4. De gel overbrengen in een schone en afsluitbare container met 100 mL van de fluorogenic ontwikkelen oplossing. Zorg ervoor dat de gel is volledig ondergedompeld in de oplossing. Het verzegelen van de container. Van licht het deksel, en schud het 's nachts op een roteerschudapparaat 50 rpm bij kamertemperatuur. Als alternatief, de incubatie stap kan ook worden verkort tot ongeveer ~ 2 h door de voorverwarming van de oplossing AIE ontwikkelen tot 80 ° C voor vlekken en dan het verlaten bij kamertemperatuur.

5. destaining en beeldvorming

  1. Breng de gel aan een schone container en het destain in 100 mL 10% ethanol voor 30 min.
    Opmerking: Alleen Water kan worden gebruikt om te wassen van de gel. Het is echter tijd efficiënter te gebruiken van een 10% ethanol-oplossing voor de destaining. Dit zal helpen te verminderen van het destaining proces van uur tot 30 min.
  2. Spoel de gel in ultrazuiver water gedurende 5 minuten.
  3. Het imago van de gel op de 365 nm-kanaal of 302 nm kanaal door een gel documentatie machine.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De eiwit bands gekleurd door de fluorescerende zilveren vlek vertonen een intens groene fluorescentie onder een 365 nm UV lamp. Alle 14 eiwit bands (10-200 kDa), waren van boven naar beneden, duidelijk zichtbaar, correleren goed met degene rood-gekleurde 14 gekleurd door de SYPRO Ruby kleurstof (Figuur 2)10.

Met betrekking tot de kwantitatieve eiwit de detectie, de gels zijn beeld door een gel imaging systeem met behulp van geautomatiseerde procedures, en de beelden werden geanalyseerd en vergeleken met behulp van de commerciële software. Deze fluorescerende zilver kleuring methode lijkt te hebben een hoge resolutie. Voor sommige eiwitten bands is de gevoeligheid van de fluorescerende zilveren vlek ook iets beter dan die van de fluorescerende SYPRO Ruby vlek. In het bijzonder is de prestaties van de fluorescerende zilveren vlek verbeterd voor het ~ 10 tot 40 kDa proteïne bands, die aangeeft dat de nieuwe methode met name handig voor het opsporen van eiwitten met lage molecuul gewichten is. Uit de gegevens blijkt ook dat de fluorescerende zilveren vlek gaf een goede en uniforme lineariteit voor alle 14 eiwitten over een relatief breed scala voor eiwit kwantificering (Figuur 3)11.

In tegenstelling tot de vlek van zilvernitraat waardoor een hoog niveau van achtergrond signaal en vervormde pieken, ontdekt de fluorescerende zilveren vlek de bands met een goed contrast en intensiteit van de uniforme verdeling vergelijkbaar met de SYPRO Ruby vlek over alle 14 eiwitten (Figuur 3).

Merk op dat onvoldoende wassen nadat de fixatie gel zal resulteren in hoge achtergrond kleuring (Figuur 4). De residuele azijnzuur zal oplichten van de TPE-4PA en leiden tot een sterke achtergrond.

Figure 1
Figuur 1: Chemische structuur van TPE-4TA en haar sensing mechanisme tot Ag+. X = H of nb+. Aangepast van eerdere werk, copyright 2018 WILEY-VCH11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: TL zilveren kleuring. A) samenvatting van het protocol. B) een vergelijking van gelen gekleurd door de fluorescerende zilveren vlek (links) en SYPRO Ruby vlek (rechts) beeld parallel met een handbediende UV-lamp onder 365 nm bestraling. De eiwitten (10-200 kDa) werden geladen door tweeledig seriële verdunning vanaf 200-500 ng/band op het meest linker rijstrook. Aangepast van eerdere werk, copyright 2018 WILEY-VCH11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: intensiteit van de fluorescentie van eiwitten tegen eiwit bedrag, representatieve gel afbeeldingen en signaal profielen (van de vijfde baan) van gelen met drie verschillende vlekken. (A) zilvernitraat vlek,()B) TL zilveren vlek (365 nm excitatie), en (C) SYPRO Ruby vlek. De eerste kolom van de figuur toont de intensiteit van de vlek voor elke band van de 14 eiwitten (10-200 kDa) tegen de hoeveelheid eiwit genormaliseerd naar de eerste baan (beginnend aan de linkerkant). De tweede kolom toont de representatieve gel-beelden van de overeenkomstige vlek. De hoeveelheid eiwit in de gel geladen is beschreven in Figuur 2. Aangepast van eerdere werk, copyright 2018 WILEY-VCH11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: gekleurd gel uit een suboptimaal experiment. In dit experiment was het wassen onvoldoende na de fixatie stap. De residuele azijnzuur geïnduceerde de aggregatie van TPE-4TA en veroorzaakt een sterke achtergrond. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier is een nieuwe TL silver kleuring methode voor eiwitten in polyacrylamide gels. Deze strategie integreert conventionele zilveren vlekken en fluorescerende vlekken. De kleuring exploot de selectieve binding van zilveren ion aan eiwitten zoals in andere zilver vlekken maar maakt gebruik van een hooggevoelige fluorogenic silver sonde TPE-4TA aan het licht van de zilveren afhankelijke eiwitten. Aangezien de fluorogenic sonde TPE-4TA kan zin zilver-ionen in een vrij lage concentratie in de nanomolar bereik11, hierdoor een zeer gevoelige detectie zonder verdere vraag van een reductieve visualisatie stap desgewenst in traditionele Zilveren vlekken. Dit zal het minimaliseren van run-to-run variaties. Ondertussen, het vermijdt het gebruik van agressieve chemicaliën, met inbegrip van formaldehyde en Glutaaraldehyde, die vaak met peptide identificatie in MS-analyse interfereren. Bovendien, zoals TPE-4TA AIE-actief is en vrij van problemen zelf blussen, de dichtbevolkte geaccumuleerde kleurstoffen op de band van een eiwit collectief in reactie op het aantal kleurstof moleculen uitstoten kunnen. Dit draagt bij tot een brede lineaire dynamisch bereik (LDR) voor eiwit detectie en een veel helderder in vergelijking met de SYPRO Ruby vlek kleuring.

Vergeleken met traditionele zilveren kleuring, een beduidend minder hoeveelheid zilvernitraat is vereist voor deze nieuwe kleuring techniek-specifiek, 0,0001% van 0,1% gemeld algemeen gebruikt zilvernitraat kleuring protocollen4. Het kan worden veronderstelde dat het succes van de nieuwe vlek zuiver naar de combinatie van de ongelooflijk heldere en gevoelige fluorescente sonde tegen de achtergrond van een hoog contrast is. Ter vergelijking: vermindering tijdens de derde stap in traditionele zilveren vlekken vereist een hogere hoeveelheid zilver tot donkere zichtbaar bands, met name wanneer het optreedt tegen een hoge achtergrond. Bij deze methode wordt de fluorogenic ontwikkelingstijd is langer dan de traditionele chemische ontwikkeling; Dit kan echter worden besproken als een beperking of als een voordeel. De gel kan worden overgelaten in de ontwikkelingslanden oplossing voor lange perioden zonder gevolgen, wat resulteert in lagere variaties die uit de exploitant voortvloeien kunnen. Niet alleen zijn er minder stappen vereist, maar ook, meer pauzes kunnen worden genomen, waardoor dit protocol heel handig zijn. Er is geen risico van overstaining in tegenstelling tot in de traditionele ontwikkelingslanden stap die kan overdevelop de gel, resulterend in een donkere achtergrond. Deze fluorescerende zilveren vlek ook naar verwachting hebben een kleinere interprotein variatie, zij het een verdere evaluatie van extra EiwitSteekproeven gerechtvaardigd is (Figuur 3).

Het is van cruciaal belang te volgen van de voorgestelde zilvernitraat concentratie van het protocol; met behulp van een hogere concentratie niet leidt tot betere prestaties en gevoeligheid, maar in plaats daarvan, produceert een sterke achtergrond fluorescentie die de fluorescentie van de bands verzwelgen kan. Op het gebied van het oplossen van problemen, kan verlies van gevoeligheid en helderheid gevolg van overmatig wassen in de wash stap voorafgaand aan fluorogenic ontwikkeling of onvoldoende zilveren impregneren. Voor deze methode is het signaal van de fluorescentie van de eiwit-band afhankelijk van het aantal eiwitten gebonden zilver-ionen, die is van essentieel belang voor de vorming van de fluorescerende TPE-4TA-Ag+ complex. Het eiwit moet worden verzadigd met zilver-ionen aan het maximaliseren van het potentieel van deze kleuringstechniek.

Ten slotte, zoals gezegd, de kleurstof fluorogenic voor Zilveren ion gebruikt bij deze methode, TPE-4TA, is ook pH gevoelig. Een lage pH kan protonate de gratis TPE-4TA aan de lichten in de gel, wat resulteert in een hoge achtergrond vlek. Onjuiste wassen stappen, die residuele azijnzuur uit de fixatie oplossing laat, zal daarom grote invloed hebben op de kwaliteit van de vlek. Het is belangrijk dat de gel relatief neutraal in de pH in de fluorogenic ontwikkeling stap (Figuur 4). Het zou ook nuttig zijn voor het aanpassen van de pH van de oplossing van TPE-4TA voordat de kleuring. Verwacht wordt dat deze kleurstof in de nabije toekomst zal worden gecommercialiseerd.

Kortom beschreven we een praktische protocol van de roman fluorescerende zilveren vlek voor de visualisatie van totale proteïnen in SDS-pagina gel. De kleuring is eenvoudig, easy-to-use, kosten-efficiënte en heeft een goede kleuring prestaties. Deze methode kan aanzienlijk vergemakkelijken de identificatie van de eiwit-bands in gels en biedt een nuttig instrument voor eiwit analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Een octrooiaanvraag op deze TL zilveren kleuring is ingediend.

Acknowledgments

De auteurs bedank Patrick Chan in de Ming Wai Lau centrum voor herstellend geneeskunde, Karolinska Institutet, voor zijn technische ondersteuning. S. X. is dankbaar voor de steun van de Zweedse Onderzoeksraad (Grant No. 2017-06344).

Materials

Name Company Catalog Number Comments

LDS Sample Buffer (4X)
Thermo Fisher Scientific NP0007 Reagent

4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well
Thermo Fisher Scientific NP0323BOX Precast gel
Sample Reducing Agent (10X) Thermo Fisher Scientific NP0004 Reagent
MES SDS Running Buffer (20X) Thermo Fisher Scientific NP0002 Reagent
Mini Gel Tank Thermo Fisher Scientific A25977 Equipment
300W Power Supply (230 VAC) Thermo Fisher Scientific PS0301 Equipment
Unstained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific 26614 Sample
Silver nitrate Sigma-Aldrich 31630-25G-R Reagent
Ethanol Bragg and co. 42520J Reagent
Acetic acid J.T. Baker 103201A Reagent
Milli-Q Synthesis A10 Merk - Provides 18.2 MΩ.cm water
gel documentation system (c600 model) Azure biosystems - Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
  2. Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
  3. Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
  4. Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
  5. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
  6. Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
  7. Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
  8. Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
  9. Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
  10. Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
  11. Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
  12. Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).

Tags

Biochemie kwestie 146 zilveren kleuring fluorescerende gel kleuring natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina) aggregatie-geïnduceerde emissie (AIE) zilveren ion sensor fluorogenic detectie proteomics
Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, A. Y. H., Xie, S., Tang, B.More

Wong, A. Y. H., Xie, S., Tang, B. Z., Chen, S. Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels. J. Vis. Exp. (146), e58669, doi:10.3791/58669 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter