Summary
כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט חלוקה לרמות של פלורסנט חדש מכתים טכניקה לגילוי חלבון סה בג'לים לזיהוי. הפרוטוקול מנצל בדיקה קרינה פלואורסצנטית ספציפיים יון כסף מדליק, אשר מגלה Ag+-חלבון מכלולי ומונע הגבלות מסוימות של כתמי כסף הדפסות כסף מסורתי.
Abstract
צביעת כסף היא טכניקה ערכי צבע מוחלטים בשימוש נרחב כדי להמחיש להקות חלבון בג'לים לזיהוי בעקבות נתרן dodecyl סולפט-לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד). כתמי כסף קלאסי יש חסרונות מסוימים, כגון רקע מכתים, חלבון המסכן התאוששות, הפארמצבטית נמוך, טווח דינמי צר ליניארי עבור כימות ותאימות מוגבלת עם ספקטרומטר מסה (MS). עכשיו, עם השימוש של בדיקה Ag+ fluorogenic, TPE-4TA, פיתחנו כסף פלורסנט מכתים שיטת עבור הפריט החזותי הכולל חלבון ב לזיהוי ג'לים. הכתם החדש הזה מונע הצעד הפחתת כסף בעייתי כתמי כסף מסורתי. יתר על כן, הכתם כסף פלורסנט מדגים הפארמצבטית טוב, רגישות, כימות ליניארי בזיהוי חלבון, שהופך אותו כתם ג'ל חלבון שימושי ומעשי.
Introduction
שיטות מכתימים רבות היו בשימוש להמחיש חלבונים בעקבות בג'ל, לדוגמה באמצעות ערכי צבע מוחלטים צבעי כחול מבריק Coomassie, הכתם כסף, זריחה, או רדיואקטיבי תיוג1,2, 3 , 4. צביעת כסף נחשב לאחד הטכניקות הרגישים ביותר לגילוי חלבון הדורשים ריאגנטים פשוט וזול. יכולים להיות מסווגים לתוך שתי המשפחות הגדולות: הכתם כסף אמוני, של כסף חנקתי כתם5,6. השיטה כסף אמוני אלקליין, המתחם diamine בכסף הוא הפיק עם אמוניה, סודיום הידרוקסיד והוריד את כסף מטאלי במהלך הפיתוח באמצעות פתרון פורמלדהיד חומצי. הכתם להכיל ביעילות חלבונים בסיסי אבל מציגה הופעה פרוץ חלבונים חומצי ונייטרלי, הוא, יתר על כן, הוגבלו גליצין קלאסית ומערכות electrophoretic טאורין. לשם השוואה, לנצל הכתמים כסף חנקתי הביו-בזיקה גבוהה של יוני כסף לחלבון, בעיקר את sulfhydryl ואת carboxyl קבוצות מכל הכבלים צד ועל נוטים כתם חומצי חלבונים ביעילות רבה יותר7. לאחר יון כסף מחייב, פתרון המתפתח (בדרך כלל ממתכות פתרון קרבונט מתכת המכילים פורמלדהיד, נתרן thiosulphate) מוחל כדי לצמצם את יוני כסף מטאלי גרגירי כסף, אשר לבנות בצבע חום-כדי-כהה כדי להמחיש להקות חלבון.
למרות צביעת כסף היה ידוע שלו רב-תכליתיות, רגישות גבוהה מאז פיתוחה ב שנות השבעים8, השיטה לעתים קרובות נחשב מסובך. שיטות מכתים כסף יש זמן מוגבלת צעדים ולהראות הפארמצבטית נמוכה. מאז צבע הכתם כסף. בדרך כלל לא אחיד ובלתי תלויה השלב צמצום, אשר קשה לשלוט, הכתם כסף היא לא שיטה כמותית, לפיכך, אינה מומלצת ג'ל השוואה המחקר וחלבון כימות9. שיטות אופטימיזציה של רגישות עלולה לנצל את aldehydes אשר יכול גם לספק מדים יותר להכתים10. עם זאת, זה על חשבון הזרם ניתוח נוסף בשל crosslinking של חלבונים על-ידי aldehydes. פרוטוקולים מהיר בעיקר לשלב או לקצר שלבים כדי לצמצם את זמן, להתפשר על הפארמצבטית ואחידות של הכתם5. כתוצאה מכך, ישנם רבים כסף מכתים משתנים בתוך ג'ל חלבון מכתים, כל אחד בצורה מיטבית כדי שיתאימו בדרישות מסוימות; לדוגמה, פשטות, רגישות או פפטיד שחזור קצב לניתוח במורד הזרם. תכונות אלה עשויים גם להשפיע אחד על השני, והוא מספק את כל הדרישות באחד הפרוטוקולים יכול להיות קשה.
בעבודה זו, אנו מציגים כסף פלורסנט חדש מכתים שיטה לגילוי חלבון בג'ל לזיהוי. בשיטה זו, אנו משתמשים בדיקה fluorogenic על יוני כסף, TPE-4TA (איור 1), כדי להמחיש את החלבונים ספוג כסף11. TPE-4TA מיועד על פי. העיקרון הנוצרות על-ידי צבירת פליטה (קובי אשכנזי). זה בלתי-emissive נמס בתמיסה המימית, אבל הוא מאוד emissive בנוכחות יוני כסף. על-ידי החלפת הפיתוח הדפסות כסף בכתמי כסף המסורתי fluorogenic פיתוח שלב, מאפשרת השיטה כסף פלורסנט ההכתמה חזקים של חלבונים הכולל עם רקע מופחת.
יתר על כן, הכתם כסף פלורסנט הראה טווח דינמי טוב ליניארי על כימות חלבון, שהוא דומה עם הכתם עברית בשימוש נרחב וגם לא בר השגה עם כתמי כסף מסורתי. הג'ל יכול לדימות במערכות תיעוד ג'ל נפוץ עם מנורת אולטרה סגול (אורך גל עירור: ערוץ nm 302/365; פליטה: ~ 490-530 ננומטר) במעבדות ביולוגיות רבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת הג'ל
הערה: ההפגנה כדלקמן פרוטוקול רגיל להכין הג'ל מכתים זמן קצר לאחר מרחביות-דף12. בקצרה, השלבים הבאים מתארים את הכנת הדגימות, ג'ל אלקטרופורזה.
- לבצע מרחביות-דף עם 4% - 12% Bis-טריס חלבון ג'ל (1 מ"מ, ובכן 15) באמצעות ג'ל מיני טנק מלא 2-(N -מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) מאגר.
- לדלל את הדגימות עם תערובת של מים מזוקקים, ליתיום dodecyl סולפט (LDS) מאגר סוכן בהפחתת דגימה.
- לטעון את הנתיב הראשון עם כמות כפולה של המניות (10 µL), ואחריו את כמות מניות רגילה (5 µL) ואת סדרת דילולים כפולה של המניה לאחר מכן (13 דילולים, מ- 2 x ל 8192 x).
- הפעל את הג'ל על מתח קבוע של 200 וולט למשך 30 דקות.
2. קיבוע של הג'ל
- לאחר אלקטרופורזה, להטביע את ג'ל בריכוז 100 מ של 40% חומצה אצטית ethanol/10% על תפקודי לב / נשימה ב-50 סל ד בטמפרטורת החדר 2 x (כל אחד למשך 30 דקות), או ללון ב 4 º C.
- לשטוף את ג'ל 3 x 10 דקות כל הנדסה גנטית מים במיכל נקי. השלב כביסה הוא קריטי. אם החומצה מהפתרון תיקון לא יוסר כראוי בשלב פיתוח fluorogenic, יתר TPE-4TA יופעלו על ידי החומצה ולהוביל רקע חזק פלורסצנטיות הג'ל.
3. הכנת AgNO3פתרון והספגה כסף של הג'ל
- כדי להפוך את הפתרון3 AgNO (0.0001%) על ההפריה, ראשית, להמיס 0.01 גר' AgNO3 מ"ל של מים הנדסה גנטית כדי להכין AgNO 0.1%3 מניות פתרון. לאחר מכן, להוסיף 100 µL של 0.1% AgNO3 מניות הפתרון לתוך 100 מ של מים הנדסה גנטית כדי להפוך את הפתרון עובד.
הערה: יש לאחסן את הפתרון3 AgNO בחושך לפני השימוש. - להפרות את הג'ל עם 100 מ של כסף עובד פתרון עבור 1 h על תפקודי לב / נשימה ב-50 סל ד במיכל זכוכית אטום. זה חיוני כדי לבצע את ההפריה כסף ברדס fume, מוגן מפני אור ברדיד אלומיניום.
- לשטוף את הג'ל עם הנדסה גנטית מים (בערך 100 מ ל) במיכל נקי עבור 2 x 60 s.
4. Fluorogenic הפיתוח של הג'ל
- כדי להכין הפתרון מלאי צבע (0.1 מ מ), להוסיף 3.0 מ"ג לצבוע TPE-4TA 50 מ של מים הנדסה גנטית. Sonicate הפתרון לכמה דקות ולהוסיף קצת פתרון NaOH (לדוגמה 1 מ') כדי לעזור לפזר את הצבע.
- בדוק את זריחה של הפתרון תחת מנורה nm UV 365 כדי להבטיח כי מולקולת צבע מלא התפרקה. רק פתרונות חלש או nonemissive מצביעים על פירוק מלא.
הערה: לצבוע ש-TPE-4TA היה מסונתז להלן הפרוטוקול דיווח לאחרונה על-ידי שיה. et al. 10 הפתרון TPE-4TA יציב מאוד, יכול להישמר בחושך במשך חודשים. - כדי להכין 100 מ של הפתרון פיתוח fluorogenic (10 מיקרומטר), להוסיף 10 מ של הפתרון מניות TPE-4TA לתוך 90 מיליליטר מים הנדסה גנטית. בדוק את ה-pH של התמיסה באמצעות מד pH, לכוונן אותו כדי 7-9 באמצעות פתרון נתרן הידרוקסידי (1 מיקרומטר).
- להעביר את הג'ל מיכל sealable ונקי עם 100 מ של פתרון fluorogenic מתפתחות. ודא שהג'ל הוא שקוע לגמרי בפתרון. חותם את המכולה. לכסות את זה האור ולנער אותו בן לילה על תפקודי לב / נשימה ב-50 סל ד בטמפרטורת החדר. לחלופין, שלב הדגירה יכולה גם יתקצר בערך ~ 2 ש על ידי חימום הפתרון המתפתח קובי אשכנזי עד 80 ° C עבור צביעת ולהשאיר אותו ואז בטמפרטורת החדר.
5. destaining והדמיה
- להעביר את הג'ל במיכל נקי, destain אותו ב- 100 מ של 10% אתנול למשך 30 דקות.
הערה: מים לבד יכול לשמש כדי לשטוף את הג'ל. עם זאת, יותר זמן יעיל לשימוש 10% אתנול הפתרון destaining. פעולה זו תסייע להפחית את תהליך destaining שעות עד 30 דקות. - יש לשטוף את ג'ל אלקטרופורזה מים במשך 5 דקות.
- תמונה הג'ל בערוץ nm 365 או ערוץ nm 302 ע י מכונה תיעוד ג'ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הלהקות חלבון מוכתמת הכתם כסף פלורסנט התערוכה של קרינה פלואורסצנטית ירוק עז תחת מנורת UV nm 365. חלבון 14 כל להקות (10-200 kDa), מלמעלה למטה, נראו בבירור, מתאם טוב עם אלה שצבעו אדום 14 מוכתמת צבען (איור 2)10עברית.
לגבי זיהוי חלבונים כמותית, ג'לים היו עם תמונה על ידי ג'ל מערכת באמצעות הליכים אוטומטיים הדמיה, ואת התמונות נותחו לעומת שימוש בתוכנה מסחרית. זה כסף פלורסנט מכתים שיטת נראה רזולוציה גבוהה. עבור כמה להקות חלבון, הרגישות של הכתם כסף פלורסנט הוא גם מעט יותר טוב מזה של הכתם עברית פלורסנט. בפרט, הביצועים של הכתם כסף פלורסנט היה משופר עבור להקות חלבון kDa ~ 10-40, המציינת כי השיטה החדשה יעילה במיוחד עבור זיהוי חלבונים עם משקולות מולקולה נמוכה. הנתונים מראים גם כי הכתם כסף פלורסנט נתן על ליניאריות טובה ואחידה עבור כל החלבונים 14 במגוון רחב יחסית חלבון כמת (איור 3)11.
בניגוד הכתם חנקת הכסף אשר נתן רמה גבוהה של האות רקע ושל פסגות מעוותת, הכתם כסף פלורסנט זוהה הלהקות עם קונטרסט טוב, התפלגות אחידה בעוצמה להשוות הכתם עברית על פני כל החלבונים 14 (איור 3).
שים את הכביסה לא מספיק לאחר הקיבעון ג'ל יגרום ברקע גבוהה מכתים (איור 4). חומצה אצטית שיורית להאיר את TPE-4PA ולהוביל רקע חזק.
איור 1: מבנה כימי של TPE-4TA, שלה מנגנון חישה Ag+. X = H או נה+. הותאם מהעבודה הקודמת, זכויות יוצרים 2018 ווילי-VCH11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: צביעת כסף פלורסנט. A) סיכום של הפרוטוקול. B) השוואה של ג'לים מוכתם על ידי הכתם כסף פלורסנט (משמאל) ועל הכתם עברית (מימין) עם תמונה במקביל עם מנורת UV כף יד תחת 365 הקרנה ננומטר. החלבונים (10-200 kDa) היו שנטענו על ידי דילול טורי כפולה, החל מ- 200-500 ng/להקה השמאלי ביותר. הותאם מהעבודה הקודמת, זכויות יוצרים 2018 ווילי-VCH11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: זריחה בעוצמה של חלבונים נגד כמות חלבון, ג'ל נציג תמונות ופרופילים אות (מהסמטה החמישי) של ג'ל עם כתמים שונים שלוש. כתם כסף חנקתי (A),(B) כתם כסף פלורסנט (365 עירור ננומטר), (ג) עברית הכתם. העמודה הראשונה של הדמות מציג את העוצמה של הכתם עבור כל הלהקה של החלבונים 14 (10-200 kDa) נגד כמות החלבונים מנורמל את ליין הראשון (החל בצד השמאל). העמודה השנייה מציגה את התמונות ג'ל נציג של הכתם המתאימים. כמות החלבונים נטען לתוך הג'ל מתוארת באיור2. הותאם מהעבודה הקודמת, זכויות יוצרים 2018 ווילי-VCH11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: צבעונית ג'ל של ניסוי שיוצרת. בניסוי זה, השטיפה היה מספיק לאחר שלב קיבוע. חומצה אצטית שיורית המושרה הצבירה של TPE-4TA וגרם רקע חזק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המוצג כאן כסף פלורסנט הרומן מכתימה שיטת חלבונים בג'לים לזיהוי. אסטרטגיה זו משלבת כתמי כסף קונבנציונאלי כתמי פלורסנט. מעלליו מכתימים הכריכה סלקטיבי של יון כסף חלבונים כמו כסף אחרים כתמים אך מעסיקה כסף fluorogenic רגישה מאוד בדיקה TPE-4TA כדי להאיר את החלבונים מאוגד כסף. מאז המכשיר fluorogenic TPE-4TA יכול לחוש יוני כסף-ריכוז נמוך יחסית טווח nanomolar11, היא מאפשרת של זיהוי רגישה מאוד ללא יותר דרישה צעד מוטעה ויזואליזציה כנדרש לפי מסורתי כתמי כסף. הדבר יצמצם את וריאציות לרוץ--לרוץ... בינתיים, זה מונע את השימוש בכימיקלים, כולל פורמלדהיד, גלוטראלדהיד, המפריעים לעתים קרובות פפטיד זיהוי בניתוח MS. יתר על כן, כפי TPE-4TA קובי אשכנזי-פעיל, ללא בעיות quenching עצמית, צבעים בצפיפות שהצטברו אצל להקה חלבון יכול פולטים קולקטיבי בתגובה מספר מולקולות צבען. זה תורם טווח דינמי רחב ליניארי (LDR) זיהוי חלבונים, צביעת עליז יותר בהשוואה עם הכתם עברית.
בהשוואה צביעת כסף מסורתי, סכום כסף חנקתי באופן משמעותי פחות נדרש עבור טכניקה-במיוחד זה מכתים חדש, 0.0001% מ- 0.1% דיווחו נפוץ בשימוש כסף חנקתי מכתים פרוטוקולים4. זה יכול להיות שיערו כי ההצלחה של הכתם החדש הוא אך ורק אל השילוב של המכשיר ניאון בהיר ורגיש מאוד על רקע חדות גבוהה. לשם השוואה, הפחתת במהלך השלב המתפתח בכתמי כסף המסורתית דורשת כמות גבוהה יותר של כסף כדי לייצר להקות גלוי כהה, במיוחד כאשר היא מתרחשת על רקע גבוה. בשיטה זו, הזמן פיתוח fluorogenic הוא יותר מאשר פיתוח כימי מסורתי; עם זאת, זה יכול להיות ויכוח מגבלה או יתרון. הג'ל יכול להשאיר בפתרון המתפתח במשך פרקי זמן ארוכים ללא השלכות, וכתוצאה מכך וריאציות התחתון זה עשוי לנבוע מתוך המפעיל. לא רק יש לבצע פעולות פחות, אבל גם, ההפסקות יותר יכול לקחת, מה שהופך את פרוטוקול זה נוח למדי. אין שום סיכון של overstaining בניגוד בשלב פיתוח מסורתי אשר ניתן overdevelop את הג'ל, וכתוצאה מכך רקע כהה. הכתם הזה כסף פלורסנט גם צפוי שיש להם וריאציה interprotein קטן יותר, גם אם הערכה נוספת של דגימות חלבון נוספת היא מוצדקת (איור 3).
זה קריטי כדי לעקוב אחר ריכוז הציע כסף חנקתי הפרוטוקול; באמצעות ריכוז גבוה יותר לא תגרום יותר ביצועים ורגישות אבל, במקום זאת, מייצרת פלורסצנטיות רקע חזק אשר יכול לבלוע את זריחה של הלהקות. במונחים של פתרון בעיות, אובדן רגישות ובהירות עלולה לגרום הכביסה יתר בשלב השטיפה שקדמה לפיתוח fluorogenic או הספגה אין די כסף. עבור שיטה זו, האות זריחה של הלהקה חלבון תלויה המספר של יוני כסף מאוגד-חלבון, שהוא חיוני להיווצרות פלורסנט TPE-4TA-Ag+ מורכבים. החלבון צריך להיות רווי יוני כסף כדי למקסם את הפוטנציאל של שיטת ההגדלה.
לבסוף, כפי שהוזכר קודם לכן, לצבוע fluorogenic עבור יון כסף בשימוש בשיטה זו, TPE-4TA, היא גם pH רגיש. PH נמוך יכול protonate חינם TPE-4TA כדי לזרוח הג'ל, וכתוצאה מכך כתם רקע. לכן, שטיפת פסולים צעדים, אשר להשאיר שאריות חומצה אצטית מהפתרון קיבעון, במידה רבה ישפיעו על איכות הכתם. חשוב לשמור את הג'ל נייטרלי יחסית ב- pH בשלב פיתוח fluorogenic (איור 4). זה גם יכול להיות מועיל להתאים את ה-pH של התמיסה TPE-4TA לפני צביעת. הוא צפוי כי צבע זה להיות ממוסחר בעתיד הקרוב.
לסיכום, אנו המתואר פרוטוקול מעשית של הרומן פלורסנט הכתם כסף עבור הפריט החזותי של חלבונים סה במרחביות-דף ג'ל. ההכתמה היא פשוטה, קלה לשימוש, חסכוניים, בעל ביצועים טובים מוכתמים. בשיטה זו יכול מאוד להקל על הזיהוי של הלהקות חלבון בג'לים ומספק כלי שימושי עבור חלבונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כבר הגיש בקשה לרישום פטנט על זה צביעת כסף פלורסנט.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות פטריק צ'אן במרכז לאו וואי מינג תיקוני לרפואה, Institutet קרולינסקה, לתמיכה טכנית שלו. ס י הוא אסיר תודה על התמיכה של מועצת המחקר השבדי (מענק מס 2017-06344).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
