Summary
यहां, हम polyacrylamide जैल में कुल प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक नया फ्लोरोसेंट धुंधला तकनीक रूपरेखा एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन । प्रोटोकॉल एक चांदी आयन विशिष्ट प्रतिदीप्ति बारी पर जांच, जो एजी का पता लगाता है का उपयोग करता है+-प्रोटीन परिसरों, और पारंपरिक chromogenic चांदी के दाग की कुछ सीमाएं समाप्त ।
Abstract
सिल्वर धुंधला एक वर्णमितीय तकनीक व्यापक रूप से polyacrylamide जैल में प्रोटीन बैंड कल्पना के बाद सोडियम डोडेसिल सल्फेट-polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पृष्ठ) का उपयोग किया जाता है । क्लासिक चांदी दाग ऐसी उच्च पृष्ठभूमि धुंधला के रूप में कुछ कमियां हैं, गरीब प्रोटीन वसूली, कम reproducibility, परिमाण के लिए एक संकीर्ण रैखिक गतिशील रेंज, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ सीमित संगतता. अब, एक फ्लोरोजेनिक एजी+ जांच, tpe-4taके उपयोग के साथ, हम polyacrylamide जैल में कुल प्रोटीन दृश्य के लिए एक फ्लोरोसेंट चांदी धुंधला विधि विकसित की है । इस नए दाग पारंपरिक चांदी के दाग में परेशानी चांदी में कमी कदम से बचा जाता है । इसके अलावा, फ्लोरोसेंट चांदी दाग अच्छा reproducibility, संवेदनशीलता को दर्शाता है, और प्रोटीन का पता लगाने में रैखिक प्रमात्रीकरण, यह एक उपयोगी और व्यावहारिक प्रोटीन जेल दाग बना ।
Introduction
जेल electrophoresis के बाद प्रोटीन कल्पना करने के लिए कई धुंधला तरीकों का इस्तेमाल किया गया है, उदाहरण के लिए coomassie शानदार नीले, चांदी दाग, प्रतिदीप्ति, या रेडियोधर्मी लेबलिंग1,2, जैसे वर्णमितीय रंजक का उपयोग 3 । , 4. चांदी धुंधला प्रोटीन का पता लगाने के लिए सबसे संवेदनशील तकनीकों में से एक माना जाता है सरल और सस्ते अभिकर्मकों की आवश्यकता है । यह दो प्रमुख परिवारों में वर्गीकृत किया जा सकता है: अमोनियाकल चांदी के दाग और चांदी नाइट्रेट दाग5,6। क्षारीय अमोनियाकी सिल्वर विधि में सिल्वर डाइऐमीन परिसर अमोनिया तथा सोडियम हाइड्रॉक्साइड से निर्मित होता है तथा अम्लीय फार्मलेडिहाइड विलयन के प्रयोग से विकास के दौरान धात्विक चांदी में कमी आती है । दाग बुनियादी प्रोटीन के लिए कुशलता से accommodates लेकिन अम्लीय और तटस्थ प्रोटीन के लिए एक समझौता प्रदर्शन से पता चलता है और है, इसके अलावा, शास्त्रीय glycine और taurine इलेक्ट्रोफोरेटिक सिस्टम तक ही सीमित है । इसकी तुलना में, सिल्वर नाइट्रेट के धब्बे सिल्वर आयनों की उच्च जैव-आत्मीयता का प्रोटीन से दोहन करते हैं, मुख्य रूप से साइड चेन से सल्फहाइडिल और कार्बोक्सिल समूह, और अम्लीय प्रोटीन को अधिक कुशलता से दाग देते हैं7. चांदी आयन बाइंडिंग के बाद, एक विकासशील समाधान (आम तौर पर एक धातु कार्बोनेट समाधान के निर्मित formaldehyde और सोडियम thiosulphate) चांदी आयनों धातु चांदी के दाने को कम करने के लिए लागू किया जाता है प्रोटीन बैंड ।
हालांकि चांदी धुंधला गया है अच्छी तरह से अपनी बहुमुखी प्रतिभा और उच्च संवेदनशीलता के लिए 1970 के दशकमें अपने विकास के बाद से जाना जाता है, विधि अक्सर मुश्किल के रूप में माना जाता है । सिल्वर-धुंधला विधियों में समय-प्रतिबंधित चरण होते हैं और निम्न पुनरुद्घनीयता दर्शाते हैं । चांदी के दाग के रंग के बाद से आम तौर पर एक समान नहीं है और कटौती कदम है, जो नियंत्रण मुश्किल है पर निर्भर है, चांदी के दाग एक मात्रात्मक विधि नहीं है और, इस प्रकार, जेल तुलना अध्ययन और प्रोटीन मात्रा9के लिए अनुशंसित नहीं है । संवेदनशीलता में अनुकूलित तरीकों aldehydes जो भी एक अधिक समान धुंधला10प्रदान कर सकते है का उपयोग कर सकते हैं । हालांकि, यह आगे डाउनस्ट्रीम aldehydes द्वारा प्रोटीन के crosslinking के कारण विश्लेषण की कीमत पर है । फास्ट प्रोटोकॉल ज्यादातर गठबंधन या समय को कम करने के लिए कदम छोटा, reproducibility और दाग5की एकरूपता समझौता । नतीजतन, प्रोटीन जेल धुंधला के भीतर कई चांदी धुंधला वेरिएंट हैं, प्रत्येक कुछ आवश्यकताओं के अनुरूप करने के लिए अनुकूलित; उदाहरण के लिए, सादगी, संवेदनशीलता, या डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए पेप्टाइड वसूली दर । इन विशेषताओं को भी एक दूसरे पर प्रभाव पड़ सकता है, और एक प्रोटोकॉल में सभी आवश्यकताओं को संतोषजनक मुश्किल हो सकता है ।
इस काम में, हम polyacrylamide जेल में प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक नया फ्लोरोसेंट सिल्वर धुंधला विधि परिचय । इस विधि में, हम चांदी आयनों, Tpe-4TA (चित्रा 1), के लिए एक फ्लोरोजेनिक जांच का उपयोग करने के लिए चांदी-गर्भवती प्रोटीन11कल्पना । Tpe-4TA एकीकरण-प्रेरित उत्सर्जन (aie) सिद्धांत द्वारा बनाया गया है । यह जलीय विलयन में विलीन होने पर अउत्सर्जक होता है, परंतु चांदी आयनों की उपस्थिति में अत्यधिक उत्सर्जक होता है । एक फ्लोरोजेनिक विकासशील कदम के साथ पारंपरिक चांदी के दाग में chromogenic विकास की जगह से, फ्लोरोसेंट चांदी विधि एक कम पृष्ठभूमि के साथ कुल प्रोटीन की मजबूत धुंधला हो जाता है ।
इसके अलावा, फ्लोरोसेंट चांदी दाग प्रोटीन परिमाणन, जो व्यापक रूप से इस्तेमाल किया SYPRO रूबी दाग और पारंपरिक चांदी के दाग के साथ प्राप्त नहीं के साथ तुलनीय है के लिए एक अच्छा गतिशील रैखिक रेंज दिखाया । जेल कई जैविक प्रयोगशालाओं में आमतौर पर इस्तेमाल किया जेल प्रलेखन सिस्टम पर एक पराबैंगनी लैंप (excitation तरंगदैर्ध्य: 302/365 एनएम चैनल; उत्सर्जन: ~ ४९०-५३० एनएम) के साथ imaged किया जा सकता है ।
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Protocol
1. जेल की तैयारी
नोट: प्रदर्शन एक मानक प्रोटोकॉल इस प्रकार के लिए शीघ्र ही SDS के बाद धुंधला के लिए जेल तैयार-पृष्ठ12। संक्षेप में, निंनलिखित चरणों का वर्णन नमूनों की तैयारी और जेल electrophoresis ।
- 4% के साथ एसडीएस-पृष्ठ प्रदर्शन-12% बीआईएस-Tris प्रोटीन जैल (1 मिमी, 15-खैर) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) बफर के साथ भरा एक मिनी जेल टैंक का उपयोग कर ।
- आसुत जल, लिथियम डोडेसिल सल्फेट (LDS) बफर, और एक नमूना को कम करने के एजेंट के मिश्रण के साथ नमूनों पतला ।
- शेयर की राशि डबल के साथ पहली लेन लोड (10 μl), सामांय स्टॉक राशि (5 μl) और उसके बाद शेयर के दोहरा dilutions की एक श्रृंखला के बाद (13 dilutions, 2x से 8192x के लिए) ।
- 30 मिनट के लिए २०० V के एक निरंतर वोल्टेज पर जेल भागो ।
2. जेल का निर्धारण
- Electrophoresis के बाद, ४०% इथेनॉल के एक १०० मिलीलीटर समाधान में जैल डूब/10% एसिटिक एसिड पर एक ऑर्बिटल शेखर पर ५० rpm पर कमरे के तापमान 2x (प्रत्येक 30 मिनट के लिए), या रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
- जैल 3 x 10 मिनट एक साफ कंटेनर में ultrapure पानी में धो लें । धुलाई का कदम महत्वपूर्ण है । यदि फिक्सिंग समाधान से एसिड ठीक से नहीं हटा दिया है ख विकासशील कदम में, अत्यधिक tpe-4ta एसिड द्वारा सक्रिय हो जाएगा और जेल में मजबूत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए सीसा ।
3. AgNO3समाधान और जेल की चांदी गर्भाधान की तैयारी
- AgNO3 समाधान बनाने के लिए (०.०००१%) गर्भाधान के लिए, पहले, AgNO3 के ०.०१ ग्राम ultrapure पानी की 10 मिलीलीटर में भंग करने के लिए एक ०.१% agno3 स्टॉक समाधान तैयार करते हैं । इसके बाद, १०० मिलीलीटर में ०.१% AgNO3 स्टॉक समाधान के १०० μl जोड़ने ultrapure पानी के लिए काम कर रहे समाधान करने के लिए ।
नोट: AgNO3 समाधान का उपयोग करने से पहले अंधेरे में संग्रहित किया जाना चाहिए । - एक कक्षीय शेखर पर एक सील गिलास कंटेनर में ५० rpm पर 1 ज के लिए चांदी काम कर समाधान के १०० एमएल के साथ जेल व्याप्त करना । यह एक धूआं हुड के तहत चांदी संसेचन प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है, एल्यूमीनियम पंनी के साथ प्रकाश से संरक्षित ।
- 2 x ६० s के लिए एक साफ कंटेनर में ultrapure पानी (के बारे में १०० मिलीलीटर) के साथ जेल धो लें ।
4. जेल के फ्लोरोजेनिक विकास
- डाई स्टॉक समाधान (०.१ mM) तैयार करने के लिए, ३.० मिलीग्राम Tpe-4TA डाई के ५० मिलीलीटर में ultrapure पानी जोड़ें । कुछ मिनट के लिए समाधान sonicate और (उदाहरण के लिए 1 एम) कुछ NaOH समाधान जोड़ने में मदद डाई भंग ।
- एक ३६५ एनएम यूवी लैंप के तहत समाधान के प्रतिदीप्ति की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि डाई अणु पूरी तरह से भंग है । केवल कमज़ोर या nonemissive समाधान पूर्ण विघटन का संकेत देते हैं ।
नोट: डाई Tpe-4TA हाल ही में xie एट अल द्वारा रिपोर्ट प्रोटोकॉल के बाद संश्लेषित किया गया था । 10 TPE-4ta घोल बहुत ही स्थिर होता है और इसे महीनों तक अंधेरे में रखा जा सकता है । - फ्लोजेनिक विकासशील समाधान (10 μM) के १०० मिलीलीटर तैयार करने के लिए, Tpe-4TA स्टॉक समाधान की 10 मिलीलीटर ultrapure पानी की ९० मिलीलीटर में जोड़ें । एक पीएच मीटर का उपयोग कर समाधान के पीएच की जांच करें और एक सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान (1 μM) का उपयोग कर 7-9 के लिए यह धुन ।
- फ्लोजेनिक विकासशील समाधान के १०० मिलीलीटर के साथ एक स्वच्छ और sealable कंटेनर के लिए जेल स्थानांतरण । सुनिश्चित करें कि जेल पूरी तरह से समाधान में डूबा है । कंटेनर को सील कर दीजिये । यह प्रकाश से कवर और यह एक कक्षीय शेखर पर रात भर हिला ५० rpm पर कमरे के तापमान पर । वैकल्पिक रूप से, ऊष्मायन कदम भी संक्षिप्त किया जा सकता है के बारे में ~ 2 एच aie के लिए ८० ° c के लिए समाधान का विकास पूर्वतापन द्वारा धुंधला और फिर यह कमरे के तापमान पर छोड़ने ।
5. destaining और इमेजिंग
- एक साफ कंटेनर के लिए जेल हस्तांतरण और 30 मिनट के लिए 10% इथेनॉल के १०० मिलीलीटर में यह destain ।
नोट: पानी अकेले जेल धोने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह अधिक समय के लिए destaining के लिए एक 10% इथेनॉल समाधान का उपयोग करने के लिए कुशल है । इससे डेस्टिनी प्रोसेस को घंटों से घटाकर 30 मिनट तक करने में मदद मिलेगी । - 5 मिनट के लिए ultrapure पानी में जेल कुल्ला ।
- छवि एक जेल प्रलेखन मशीन द्वारा ३६५ एनएम चैनल या ३०२ एनएम चैनल पर जेल ।
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Representative Results
फ्लोरोसेंट सिल्वर दाग़ के द्वारा दाग प्रोटीन बैंड एक ३६५ एनएम यूवी लैंप के तहत एक तीव्र हरी प्रतिदीप्ति प्रदर्शन । सभी 14 प्रोटीन बैंड (10-200 केडीए), ऊपर से नीचे तक, स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे, 14 लाल रंग का SYPRO रूबी डाई द्वारा दाग वालों के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध (चित्रा 2)10.
मात्रात्मक प्रोटीन का पता लगाने के बारे में, जैल एक जेल इमेजिंग स्वचालित प्रक्रियाओं का उपयोग प्रणाली द्वारा imaged थे, और छवियों और विश्लेषण किया गया वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की तुलना में । इस फ्लोरोसेंट चांदी धुंधला विधि के लिए एक उच्च संकल्प है प्रकट होता है । कुछ प्रोटीन बैंड के लिए, फ्लोरोसेंट चांदी के दाग की संवेदनशीलता भी फ्लोरोसेंट SYPRO रूबी दाग की तुलना में थोड़ा बेहतर है । खासतौर पर फ्लोरोसेंट सिल्वर दाग के प्रदर्शन में ~ 10 से ४० केडीए प्रोटीन बैंड के लिए सुधार किया गया, जिससे यह संकेत मिलता है कि नई विधि कम अणु भार वाले प्रोटीन का पता लगाने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है । डेटा भी सुझाव है कि फ्लोरोसेंट चांदी दाग प्रोटीन मात्रा के लिए एक अपेक्षाकृत व्यापक रेंज पर सभी 14 प्रोटीन के लिए एक अच्छा और समान रैखिकता दिया (चित्रा 3)11।
चांदी नाइट्रेट दाग जो पृष्ठभूमि संकेत और विकृत चोटियों के एक उच्च स्तर दिया के विपरीत, फ्लोरोसेंट चांदी दाग एक अच्छा इसके विपरीत और समान तीव्रता वितरण सभी 14 प्रोटीन भर में SYPRO रूबी दाग के तुलनीय के साथ बैंड का पता लगाया (चित्र 3) ।
ध्यान दें कि अपर्याप्त धोने के बाद जेल निर्धारण उच्च पृष्ठभूमि धुंधला में परिणाम होगा (चित्रा 4) । अवशिष्ट एसिटिक एसिड Tpe-4PA प्रकाश और एक मजबूत पृष्ठभूमि के लिए नेतृत्व करेंगे ।
चित्रा 1: TPE-4TA की रासायनिक संरचना और उसके संवेदन तंत्र को एजी+। X = H या Na+। पिछले काम से अनुकूलित, कॉपीराइट २०१८ WILEY-VCH11। इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: फ्लोरोसेंट चांदी धुंधला । A) प्रोटोकॉल का सारांश । ख) फ्लोरोसेंट चांदी दाग (बाएं) और Sypro रूबी दाग (दाएं) द्वारा दाग की तुलना एक ३६५ के तहत एक हाथ में यूवी दीपक के साथ समानांतर imaged । प्रोटीनों (10-200 केडीए) को सबसे बाईं लेन में 200-500 एनजी/बैंड से शुरू होने वाले दो सीरियल तनुकरण द्वारा लोड किया गया था । पिछले काम से अनुकूलित, कॉपीराइट २०१८ WILEY-VCH11। इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3 प्रोटीन राशि, प्रतिनिधि जेल छवियों के खिलाफ प्रोटीन की प्रतिदीप्ति तीव्रता, और संकेत प्रोफाइल (पांचवीं लेन से) तीन अलग दाग के साथ जैल की. (क) सिल्वर नाइट्रेट दाग,(ख) फ्लोरोसेंट सिल्वर दाग (३६५ एनएम उत्तेजन), और (ग) स्प्रो रूबी दाग । चित्र के पहले कॉलम में 14 प्रोटीनों (10-200 केडीए) के प्रत्येक बैंड के लिए दाग की तीव्रता को पहले लेन में सामान्यीकृत प्रोटीन की मात्रा (बाईं तरफ से शुरू) के मुकाबले दर्शाया गया है । दूसरे स्तंभ से संबंधित दाग के प्रतिनिधि जेल छवियों को दर्शाता है । जेल में लोड प्रोटीन की मात्रा चित्रा 2में वर्णित है । पिछले काम से अनुकूलित, कॉपीराइट २०१८ WILEY-VCH11। इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: एक सबऑप्टिमल प्रयोग से दाग जेल । इस प्रयोग में निर्धारण चरण के बाद धुलाई अपर्याप्त थी । अवशिष्ट एसिटिक एसिड Tpe-4TA के एकत्रीकरण प्रेरित और एक मजबूत पृष्ठभूमि का कारण बना । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
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Discussion
यहां प्रस्तुत polyacrylamide जैल में प्रोटीन के लिए एक उपंयास फ्लोरोसेंट चांदी धुंधला विधि है । इस रणनीति पारंपरिक चांदी के दाग और फ्लोरोसेंट दाग को एकीकृत करता है । धुंधला चांदी के रूप में अंय चांदी के दाग के रूप में प्रोटीन के लिए आयन के चयनात्मक बंधन का शोषण करता है, लेकिन एक बहुत ही संवेदनशील ख चांदी जांच tpe-4ta करने के लिए रजत बाध्य प्रोटीन प्रकाश को रोजगार । के बाद से फ्लोरोजेनिक जांच tpe-4ta नैनोमोलर रेंज11में एक काफी कम एकाग्रता पर चांदी आयनों भावना कर सकते हैं, यह पारंपरिक में जरूरत के रूप में एक अपचयी दृश्य कदम की किसी भी आगे की मांग के बिना एक अति संवेदनशील पता लगाने में सक्षम बनाता है चांदी के दाग । यह रन-टू-रन विविधताओं को कम करेगा । इस बीच, यह formaldehyde और glutaraldehyde, जो अक्सर एमएस विश्लेषण में पेप्टाइड पहचान के साथ हस्तक्षेप सहित कठोर रसायनों के उपयोग से बचा जाता है । इसके अलावा, के रूप में Tpe-4TA है aie-सक्रिय और किसी भी स्वयं शमन समस्याओं से मुक्त, एक प्रोटीन बैंड पर घनी संचित रंजक सामूहिक डाई अणुओं की संख्या के जवाब में उत्सर्जन कर सकते हैं । यह प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक व्यापक रैखिक गतिशील रेंज (LDR) और एक बहुत उज्जवल धुंधला जब SYPRO रूबी दाग के साथ तुलना करने के लिए योगदान देता है ।
पारंपरिक चांदी धुंधला के साथ तुलना में, चांदी नाइट्रेट की एक काफी कम राशि इस नए धुंधला तकनीक के लिए आवश्यक है-विशेष रूप से, ०.१% से ०.०००१% आमतौर पर इस्तेमाल चांदी नाइट्रेट धुंधला प्रोटोकॉल में रिपोर्ट4। यह hypothesized जा सकता है कि नए दाग की सफलता विशुद्ध रूप से एक उच्च विपरीत पृष्ठभूमि के खिलाफ अविश्वसनीय रूप से उज्ज्वल और संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच के संयोजन के लिए नीचे है । इसकी तुलना में, पारंपरिक चांदी के दाग में विकासशील कदम के दौरान कमी चांदी की एक उच्च मात्रा के लिए अंधेरे दिखाई बैंड का उत्पादन, विशेष रूप से जब यह एक उच्च पृष्ठभूमि के खिलाफ होता है की आवश्यकता है । इस पद्धति में, फ्लोजेनिक विकास समय पारंपरिक रासायनिक विकास से अधिक है; हालांकि, यह एक सीमा के रूप में या एक लाभ के रूप में बहस हो सकती है । जेल कोई परिणाम के साथ समय की लंबी अवधि के लिए विकासशील समाधान में छोड़ दिया जा सकता है, कम रूपांतरों कि ऑपरेटर से प्राप्त कर सकते है जिसके परिणामस्वरूप । न केवल कम आवश्यक कदम हैं, लेकिन यह भी, और अधिक pauses लिया जा सकता है, जो इस प्रोटोकॉल काफी सुविधाजनक बनाता है । वहां पारंपरिक विकासशील कदम है जो जेल overdevelop कर सकते है के विपरीत overstaining का कोई खतरा नहीं है, एक अंधेरे पृष्ठभूमि में जिसके परिणामस्वरूप । इस फ्लोरोसेंट चांदी दाग भी एक छोटे interprotein भिंनता है उंमीद है, अतिरिक्त प्रोटीन नमूनों की एक और मूल्यांकन हालांकि warranted है (चित्रा 3) ।
यह प्रोटोकॉल से सुझाव दिया चांदी नाइट्रेट एकाग्रता का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है; एक उच्च एकाग्रता का उपयोग बेहतर प्रदर्शन और संवेदनशीलता में परिणाम नहीं है, लेकिन, बजाय, एक मजबूत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति जो बैंड के प्रतिदीप्ति निगल सकता है पैदा करता है । समस्या निवारण के संदर्भ में, संवेदनशीलता और चमक में कमी फ्लोजेनिक विकास से पहले धोने कदम में अधिक धुलाई से या अपर्याप्त चांदी संसेचन से परिणाम हो सकता है. इस विधि के लिए, प्रोटीन बैंड के प्रतिदीप्ति संकेत प्रोटीन से बंधे चांदी आयनों की संख्या पर निर्भर है, जो फ्लोरोसेंट tpe-4ta-एजी+ परिसर के गठन के लिए आवश्यक है । प्रोटीन चांदी आयनों के साथ संतृप्त किया जाना चाहिए इस धुंधला विधि की क्षमता को अधिकतम करने के लिए ।
अंत में, के रूप में पहले उल्लेख किया है, चांदी इस विधि में इस्तेमाल आयन के लिए फ्लोरोजेनिक डाई, Tpe-4TA, भी पीएच संवेदनशील है. एक कम पीएच मुफ्त Tpe-4TA जेल में fluoresce को protonate कर सकते हैं, एक उच्च पृष्ठभूमि दाग में जिसके परिणामस्वरूप । इसलिए, अनुचित धोने कदम है, जो निर्धारण समाधान से अवशिष्ट एसिटिक एसिड छोड़, बहुत दाग गुणवत्ता को प्रभावित करेगा । यह फ्लोजेनिक विकास चरण में पीएच में अपेक्षाकृत तटस्थ जेल रखने के लिए महत्वपूर्ण है (चित्रा 4). यह भी धुंधला से पहले Tpe 4TA समाधान के पीएच समायोजित करने के लिए उपयोगी हो सकता है । उम्मीद है कि इस डाई को निकट भविष्य में वाणिज्यीकृत किया जाएगा ।
संक्षेप में, हम SDS-पृष्ठ जेल में कुल प्रोटीन के दृश्य के लिए उपंयास फ्लोरोसेंट चांदी दाग के एक व्यावहारिक प्रोटोकॉल का वर्णन किया । धुंधला सीधा है, आसान करने के लिए उपयोग करते हैं, लागत कुशल, और एक अच्छा धुंधला प्रदर्शन किया है । इस विधि बहुत जैल में प्रोटीन बैंड की पहचान की सुविधा और प्रोटीन विश्लेषण के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान कर सकते हैं ।
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Disclosures
इस फ्लोरोसेंट चांदी धुंधला पर एक पेटेंट आवेदन दायर किया गया है ।
Acknowledgments
लेखकों को अपने तकनीकी समर्थन के लिए, Reparative चिकित्सा, Karolinska Institutet के लिए मिंग वाई Lau केंद्र में पैट्रिक चान शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । एस. एक्स स्वीडिश अनुसंधान परिषद (अनुदान No. 2017-06344) से समर्थन के लिए आभारी है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
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