Summary
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che delinea una fluorescente nuova tecnica per la rilevazione di proteine totali in gel di poliacrilammide di pittura. Il protocollo utilizza una sonda d'argento dello ione specifico fluorescenza accensione, rileva Ag+-complessi della proteina ed Elimina alcune limitazioni dei tradizionali cromogeniche macchie d'argento.
Abstract
Macchiatura d'argento è una tecnica colorimetrica ampiamente utilizzata per visualizzare le bande proteiche in gel di poliacrilammide dopo elettroforesi del gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE). Le macchie d'argento classiche hanno alcuni inconvenienti, come alta priorità bassa che macchia, recupero di proteina povera, scarsa riproducibilità, una gamma dinamica lineare stretta per la quantificazione e la limitata compatibilità con spettrometria di massa (MS). Ora, con l'uso di una sonda di fluorogenic Ag+ , TPE-4TA, abbiamo sviluppato un fluorescente argento che macchia il metodo per la visualizzazione di proteine totali in gel di poliacrilammide. Questa nuova macchia evita il passaggio di riduzione d'argento fastidioso in tradizionali macchie d'argento. Inoltre, la macchia d'argento fluorescente dimostra buona riproducibilità, sensibilità e quantificazione lineare nella rilevazione della proteina, rendendolo una macchia di gel di proteina utile e pratico.
Introduction
Molti metodi di colorazione sono state usate per visualizzare proteine elettroforesi su gel in seguito, ad esempio utilizzando coloranti colorimetrici come Coomassie Brilliant Blue, macchia d'argento, fluorescenza, o radioattivo etichettatura1,2, 3 , 4. macchiatura d'argento è considerata una delle tecniche più sensibili per la rilevazione di proteine che richiedono reagenti semplici ed economici. Possono essere classificato in due famiglie principali: la macchia d'argento ammoniacale e il nitrato d'argento macchia5,6. Nel metodo d'argento ammoniacale alcalino, il complesso di argento-diammina è prodotta con idrossido di sodio e ammoniaca e ridotto ad argento metallico durante lo sviluppo utilizzando una soluzione di formaldeide acide. La macchia può ospitare in modo efficiente per proteine basiche ma mostra una prestazione compromessa per le proteine acide e neutre ed è, inoltre, limitata ai sistemi elettroforetiche della taurina e glicina classica. In confronto, le macchie di nitrato d'argento sfruttano l'alta bio-affinità degli ioni d'argento per proteine, principalmente la solfidrilico e carbossilico gruppi da catene laterali e tendono a macchiare le proteine acide in modo più efficiente7. Dopo agli ioni d'argento vincolante, una soluzione in via di sviluppo (in genere in una soluzione di carbonato di metallo contenente formaldeide e sodio tiosolfato) viene applicata per ridurre gli ioni d'argento a grani d'argento metallici, che costruire un colore marrone-scuro per visualizzare la fasce della proteina.
Sebbene macchiatura d'argento è stato ben nota per la sua versatilità e l'alta sensibilità dal suo sviluppo nel 1970s8, il metodo è spesso considerato come difficile. Metodi di colorazione argento hanno passaggi di tempo-limitato e mostrano scarsa riproducibilità. Poiché il colore della macchia d'argento non è solitamente uniforme e dipende il passo di riduzione, che è difficile da controllare, la macchia d'argento non è un metodo quantitativo e, quindi, non raccomandato per gel confronto studio e proteina quantificazione9. Metodi ottimizzati nella sensibilità possono utilizzare aldeidi che possono anche fornire un aspetto più uniforme colorazione10. Tuttavia, questo è a scapito di ulteriore analisi a valle a causa la reticolazione delle proteine di aldeidi. Protocolli di veloce principalmente combinano o accorciano alla seguente procedura per ridurre il tempo di compromettere la riproducibilità e l'uniformità della macchia5. Di conseguenza, ci sono numerosi argento colorazione varianti all'interno di gel di proteina che macchia, ciascuno ottimizzato per soddisfare determinati requisiti; ad esempio, semplicità, sensibilità o peptide tasso di recupero per analisi a valle. Questi attributi possono anche avere un impatto su ogni altro, e soddisfare tutte le esigenze in un protocollo può essere difficile.
In questo lavoro, vi presentiamo un nuovo fluorescente argento che macchia il metodo per la rilevazione di proteine nel gel di poliacrilammide. In questo metodo, utilizziamo una sonda fluorogenic per ioni d'argento, TPE-4TA (Figura 1), per visualizzare le proteine impregnato di argento11. TPE-4TA è stato progettato dal principio di emissione indotta da aggregazione (AIE). È non-emissivo quando disciolto in soluzione acquosa, ma è altamente emissivo in presenza di ioni d'argento. Sostituendo lo sviluppo cromogeno in tradizionali macchie d'argento con un fluorogenic sviluppando passo, il metodo d'argento fluorescente consente la macchiatura robusta delle proteine totali con uno sfondo ridotto.
Inoltre, la macchia d'argento fluorescente ha mostrato una buona gamma dinamica lineare per quantificazione della proteina, che è paragonabile con la macchia di SYPRO Ruby ampiamente utilizzato e non ottenibile con le macchie d'argento tradizionale. Il gel può essere ripreso il gel comunemente utilizzati sistemi di documentazione con lampada a raggi ultravioletti (lunghezza d'onda di eccitazione: canale di 302/365 nm; emissione: ~ 490-530 nm) presso molti laboratori biologici.
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Protocol
1. preparazione del Gel
Nota: La dimostrazione segue un protocollo standard per preparare il gel per la colorazione poco dopo SDS-PAGE12. In breve, i passaggi seguenti descrivono la preparazione dei campioni e l'elettroforesi del gel.
- Eseguire SDS-PAGE con gel di proteina 4% - 12% Bis-Tris (1 mm, 15-bene) usando un carro armato del gel mini riempiti di 2-(N -morfolino) buffer di ethanesulfonic acido (MES).
- Diluire i campioni con una miscela di acqua distillata, litio dodecil solfato (LDS) buffer e un agente di riduzione del campione.
- Caricare la prima corsia con il doppio della quantità di stock (10 µ l), seguita dalla normale quantità di stock (5 µ l) e una serie di diluizioni dello stock da allora in poi (13 diluizioni, 2 x a 8192 x).
- Esegua il gel a una tensione costante di 200 V per 30 min.
2. fissazione del Gel
- Dopo l'elettroforesi, immergere il gel in una soluzione di 100 mL di acido acetico al 40% ethanol/10% su agitatore orbitale a 50 giri/min a temperatura ambiente 2 x (ogni 30 min), o durante la notte a 4 ° C.
- Lavare il gel 3 x 10 min ciascuno in acqua ultrapura in un recipiente pulito. La fase di lavaggio è critica. Se l'acido dalla soluzione di fissaggio non viene rimosso correttamente nel passaggio fluorogenici in via di sviluppo, l' eccessiva TPE-4TA verrà attivato dall'acido e portare alla fluorescenza di fondo forte nel gel.
3. preparazione dell'AgNO3soluzione e impregnazione d'argento del Gel
- Per rendere la soluzione di3 di AgNO (0,0001%) per l'impregnazione, in primo luogo, sciogliere 0,01 g di AgNO3 in 10 mL di acqua ultrapura per preparare una soluzione stock di AgNO3 0,1%. Successivamente, aggiungere 100 µ l di soluzione madre3 AgNO 0.1% in 100 mL di acqua ultrapura per rendere la soluzione di lavoro.
Nota: La soluzione di AgNO3 deve essere conservata al buio prima dell'uso. - Impregnare il gel con 100 mL di soluzione per 1 h di lavoro su agitatore orbitale a 50 rpm in un contenitore di vetro sigillato di argento. È fondamentale effettuare l'impregnazione d'argento sotto cappa aspirante, protetta dalla luce con carta stagnola.
- Lavare il gel con acqua ultrapura (circa 100 mL) in un contenitore pulito per 2 x 60 s.
4. Fluorogenic sviluppo del Gel
- Per preparare la soluzione di riserva di tintura (0,1 mM), è necessario aggiungere 3,0 mg della tintura TPE-4TA in 50 mL di acqua ultrapura. Sonicare la soluzione per qualche minuto e aggiungere qualche soluzione di NaOH (ad esempio 1 M) per aiutare a sciogliere il colorante.
- Controllare la fluorescenza della soluzione sotto una lampada di 365 nm UV per garantire che la molecola di colorante è completamente dissolto. Solo soluzioni deboli o nonemissive indicano la completa dissoluzione.
Nota: La tintura che TPE-4TA è stato sintetizzato seguendo il protocollo recentemente segnalato da Xie et al. 10 la soluzione TPE-4TA è molto stabile e può essere tenuta all'oscuro per mesi. - Per preparare 100 mL di soluzione di sviluppo fluorogenic (10 µM), aggiungere 10 mL della soluzione madre TPE-4TA in 90 mL di acqua ultrapura. Controllare il pH della soluzione utilizzando un pH-metro e sintonizzare per 7-9 usando una soluzione di idrossido di sodio (1 µM).
- Trasferire il gel in un contenitore pulito e sigillabile con 100 mL di soluzione di sviluppo fluorogenic. Assicurarsi che il gel è totalmente immerso nella soluzione. Sigillare il contenitore. Coprire dalla luce e scuoterlo durante la notte in un agitatore orbitale a 50 giri/min a temperatura ambiente. In alternativa, la fase di incubazione può anche essere ridotto a circa ~ 2 h di preriscaldamento la soluzione di sviluppo AIE a 80 ° C per la colorazione e poi lasciarlo a temperatura ambiente.
5. decolorante e Imaging
- Trasferire il gel in un contenitore pulito e decolorare esso in 100 mL di etanolo al 10% per 30 min.
Nota: Acqua da solo può essere usata per lavare il gel. Tuttavia, è più tempo-efficiente di utilizzare una soluzione di etanolo di 10% per la decolorazione. Questo vi aiuterà a ridurre il processo di decolorante da ore a 30 min. - Risciacquare il gel in acqua ultrapura per 5 min.
- Immagine del gel presso il canale di nm 365 o 302 nm da una macchina di documentazione del gel.
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Representative Results
Le bande proteiche macchiate dalla macchia d'argento fluorescente presentano una fluorescenza verde intensa sotto una lampada a UV 365 nm. Tutte le bande di proteina 14 (10-200 kDa), da cima a fondo, erano chiaramente visibili, che correlano bene con 14 quelli colore rosso macchiati dalla SYPRO Ruby tintura (Figura 2)10.
Per quanto riguarda la rilevazione quantitativa della proteina, i gel erano imaged da un gel sistema utilizzando procedure automatizzate di imaging, e le immagini sono state analizzate e confrontati utilizzando il software commerciale. Questo argento fluorescente che macchia il metodo sembra avere un'alta risoluzione. Per alcune fasce della proteina, la sensibilità della macchia fluorescente argento inoltre è leggermente migliore di quella della macchia fluorescente SYPRO Ruby. In particolare, le prestazioni della macchia d'argento fluorescente è stata migliorata per le bande proteiche di ~ 10 a 40 kDa, che indica che il nuovo metodo è particolarmente utile per la rilevazione di proteine con pesi bassi molecola. I dati inoltre suggeriscono che la macchia d'argento fluorescente ha dato una linearità buona ed uniforme per tutte le 14 proteine sopra una gamma relativamente vasta per proteina quantificazione (Figura 3)11.
In contrasto con la macchia di nitrato d'argento che ha dato un alto livello di segnale di fondo e picchi distorti, la macchia d'argento fluorescente rilevato le bande con un buon contrasto e distribuzione uniforme di intensità paragonabile alla macchia SYPRO Ruby attraverso tutte le 14 proteine (Figura 3).
Si noti che lavaggio insufficiente dopo la fissazione del gel si tradurrà in alta priorità bassa che macchia (Figura 4). Il residuo acido acetico si accendono il TPE-4PA e portare a un forte background.
Figura 1: Struttura chimica di TPE-4TA ed il suo meccanismo di rilevamento di Ag+. X = H o Na+. Adattato dal precedente lavoro, copyright 2018 WILEY-VCH11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: la macchiatura d'argento fluorescenti. A) Riassunto del protocollo. B) un confronto di gel macchiati dal fluorescente macchia d'argento (a sinistra) e macchia SYPRO Ruby (a destra) Imaging parallelo con una lampada UV portatile sotto irradiazione di 365 nm. Le proteine (10-200 kDa) sono state caricate dalla diluizione seriale a partire da 200-500 ng/banda doppia corsia di sinistra al massimo. Adattato dal precedente lavoro, copyright 2018 WILEY-VCH11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: intensità della fluorescenza delle proteine contro quantità di proteina, rappresentante gel immagini e profili di segnale (dalla Quinta corsia) di gel con tre macchie differenti. Macchia di nitrato d'argento (A),(B) fluorescente macchia d'argento (eccitazione 365 nm) e (C) SYPRO Ruby macchia. La prima colonna della figura mostra l'intensità della colorazione per ogni banda delle 14 proteine (10-200 kDa) contro la quantità di proteina normalizzata nella prima corsia (a partire da sinistra). La seconda colonna Mostra le immagini di gel rappresentativo della macchia corrispondente. La quantità di proteina caricata in gel è descritto nella Figura 2. Adattato dal precedente lavoro, copyright 2018 WILEY-VCH11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: macchiato gel da un esperimento suboptimale. In questo esperimento, il lavaggio era insufficiente dopo la fase di fissazione. Il residuo acido acetico ha indotto l'aggregazione di TPE-4TA e ha causato un forte background. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Presentato qui è un romanzo fluorescente argento che macchia il metodo per le proteine nel gel di poliacrilammide. Questa strategia integra le macchie d'argento convenzionale e la colorazione fluorescente. Le gesta di colorazione il legame selettivo di ioni d'argento per proteine come in altri argento macchie ma impiega un argento altamente sensibile fluorogenic sonda TPE-4TA per illuminare le proteine rilegate d'argento. Poiché la sonda fluorogenic TPE-4TA può percepire gli ioni d'argento ad una concentrazione piuttosto basso nella gamma nanomolar11, consente una rivelazione altamente sensibile senza qualsiasi ulteriore richiesta di un passo di visualizzazione riduttivo come necessario in tradizionale macchie d'argento. Questo ridurrà variazioni run-to-run. Nel frattempo, evita l'uso di prodotti chimici, tra cui la formaldeide e glutaraldeide, che spesso interferiscono con identificazione del peptide in analisi MS. Inoltre, come TPE-4TA è AIE-attivo e privo di qualsiasi problemi auto-estinguente, le tinture densamente accumulate in una fascia della proteina possono emettere collettivamente in risposta al numero di molecole di colorante. Ciò contribuisce ad una gamma dinamica ampia lineare (LDR) per la rilevazione di proteine e una colorazione molto più luminoso quando confrontato con la macchia di SYPRO Ruby.
Rispetto ai tradizionali macchiatura d'argento, una significativamente meno quantità di nitrato d'argento è richiesta per questa nuova tecnica-in particolare la colorazione, 0,0001% da 0,1% riferito a comunemente utilizzato nitrato d'argento che macchia i protocolli4. Si può ipotizzare che il successo della nuova macchia è puramente giù per la combinazione della sonda fluorescente incredibilmente sensibile e luminosa su uno sfondo di contrasto elevato. In confronto, riduzione durante la fase di sviluppo in macchie d'argento tradizionale richiede una maggiore quantità di argento per produrre bande scure visibili, specialmente quando si presenta contro un fondo elevato. In questo metodo, il tempo di sviluppo di fluorogenic è più il tradizionale sviluppo chimico; Tuttavia, questo può essere dibattuto come una limitazione o come un vantaggio. Il gel può essere lasciato nella soluzione in via di sviluppo per lunghi periodi di tempo senza conseguenze, con conseguente bassa variazioni che possono derivare dall'operatore. Non solo ci sono meno passaggi necessari, ma anche, più pause possono essere presa, che rende questo protocollo abbastanza conveniente. Non c'è alcun rischio di overstaining a differenza nel tradizionale passaggio in via di sviluppo che può SOVRASVILUPPARE il gel, risultante in uno sfondo scuro. Questa macchia fluorescente argento prevede inoltre di avere una più piccola variante interprotein, seppur un'ulteriore valutazione di campioni supplementari della proteina è autorizzata (Figura 3).
È fondamentale per seguire la concentrazione di nitrato d'argento suggeriti dal protocollo; usando una concentrazione più elevata non comporta prestazioni migliori e una sensibilità ma, invece, produce una fluorescenza di fondo forte che può inghiottire la fluorescenza delle bande. In termini di risoluzione dei problemi, perdita di sensibilità e di luminosità può derivare da eccessivo lavaggio nel passaggio lavare prima fluorogenic sviluppo o da insufficiente impregnazione d'argento. Per questo metodo, il segnale di fluorescenza della banda della proteina è dipenda dal numero di ioni d'argento legato alle proteine, che è essenziale per la formazione del fluorescente TPE-4TA-Ag+ complesso. La proteina deve essere saturata con gli ioni d'argento per massimizzare il potenziale di questo metodo di colorazione.
Infine, come accennato in precedenza, il colorante fluorogenic per ioni d'argento utilizzato in questo metodo, TPE-4TA, è anche pH sensibile. Un pH basso può protonare il gratuito TPE-4TA a fluorescenza nel gel, risultante in una macchia di alta priorità bassa. Pertanto, fasi di lavaggio improprio, che lasciano residui di acido acetico dalla soluzione di fissazione, influirà notevolmente sulla qualità di macchia. È importante mantenere il gel relativamente neutrale pH in fase di sviluppo fluorogenic (Figura 4). Potrebbe anche essere utile regolare il pH della soluzione TPE-4TA prima della colorazione. Si prevede che questa tintura sarà commercializzata nel prossimo futuro.
In sintesi, abbiamo descritto un protocollo pratico della romanzo fluorescente macchia d'argento per la visualizzazione delle proteine totali nel gel di SDS-PAGE. La colorazione è semplice, facile da usare, efficiente e ha una buona prestazione di colorazione. Questo metodo può facilitare notevolmente l'identificazione di bande proteiche in gel e fornisce un utile strumento per l'analisi della proteina.
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Disclosures
È stata presentata una domanda di brevetto su questo fluorescente macchiatura d'argento.
Acknowledgments
Gli autori vorrei ringraziare Patrick Chan presso il centro di Lau Wai Ming per Medicina riparativa, Karolinska Institutet, per il suo supporto tecnico. S. X. è grato per il sostegno del Consiglio di ricerca svedese (Grant No. 2017-06344).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
