Summary
ここでは、新しい蛍光染色ポリアクリルアミドゲルの総蛋白質の検出の技術をまとめた詳細なプロトコルについて述べる。プロトコルを利用して Ag+を検出する銀イオン固有蛍光ターンオン プローブ-タンパク質複合体、伝統的な発色銀汚れの特定の制限を排除します。
Abstract
銀染色は、ポリアクリルアミドゲル ナトリウム dodecyl 硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を次の蛋白質バンドの視覚化に広く用いられる比色法です。古典的な銀汚れ汚損、不良タンパク質の回収、低再現性、定量化、および質量分析法 (MS) と限られた互換性のダイナミック レンジの狭い線形高の背景など、いくつかの欠点があります。今、 TPE 4TA、Ag+蛍光発生プローブの使用と、蛍光銀染色ポリアクリルアミドゲルで総たんぱく可視化法を開発しました。この新しい汚れは、伝統的な銀汚れで面倒な銀削減ステップを回避できます。また、蛍光銀染色は良い再現性、感度、およびタンパク質検出後、有用かつ実用的な蛋白質ゲル染色で線形の数量を示します。
Introduction
多くの染色法がされている蛋白質ゲルの電気泳動、たとえば Coomassie 鮮やかな青、銀染色、蛍光など色の染料を使用して視覚化するために使用または放射性1,2,を表示3,4. 簡易かつ安価な試薬を必要とする蛋白質の検出のための最も敏感なテクニックの一つである銀製の汚損します。2 つの主要な家族に分類できます: 銀製硝酸塩、アンモニア銀染色染色5,6。アルカリのアンモニア銀法で銀ジアミン複合体はアンモニア、水酸化ナトリウムの生産、酸性ホルムアルデヒド溶液を用いた開発中に金属銀に減少します。汚れは、基本的な蛋白質に効率的に対応できる酸性および中性蛋白質のためパフォーマンスの低下を示していますは、さらに、古典的なグリシンやタウリン電気泳動システムに限定。比較では、硝酸銀の汚れは蛋白質に銀イオンの高い生体親和性を悪用する、主なスルフヒとカルボキシル基側鎖からグループ化しより効率的に酸性タンパク質を染色する傾向がある7。ブラウン-ダーク色を視覚化するを構築金属の銀粒子に銀イオンを抑える銀イオン結合後、現像液 (通常金属炭酸塩溶液におけるホルムアルデヒドおよびナトリウム チオ硫酸製) が適用される、タンパク質のバンド。
銀染色は 1970 年代8の開発以来その汎用性と高感度の知られているがメソッド頻繁にトリッキーないわ。銀染色方法はステップの時間制限があるし、低再現性を示します。銀染色の色は、通常ない均一でコントロールするは難しいが、削減の手順に依存しているので銀染色定量的方法ではありません、したがって、ゲルの比較研究とタンパク質定量9には推奨されません。感度の最適化方法は、アルデヒド10を染色より均一をまた提供することができますを利用できます。ただし、アルデヒドによるタンパク質の架橋によりさらに下流解析を犠牲になります。高速プロトコルは主を組み合わせるか、再現性と染色5の均一性を損なうこと、時間を短縮するには手順を短きます。その結果、多数の銀染色染色、特定の要件に合わせて最適化された各蛋白質ゲル内の亜種があります。たとえば、シンプルさ、感度、またはペプチドの回収率下流の分析。これらの属性は、互いに影響をあります、1 つのプロトコルのすべての要件を満たすは難しいことができます。
この作品は、新しい蛍光銀染色法電気泳動法でタンパク質検出用を紹介します。この方法で銀含浸タンパク質11を視覚化すると銀イオン、 TPE 4TA (図 1)、蛍光プローブを使用します。TPE 4TA凝集誘起発光 (AIE) 原則として設計されています。水溶液に溶解したとき、非発光ですが銀イオンの存在下で高発光性です。開発ステップ蛍光発色における伝統的な銀汚れに置き換える、蛍光銀法により総蛋白減少の背景を持つ堅牢な染色します。
さらに、蛍光の銀製の汚れはタンパク質の定量化は, 広く使用される可視ルビー汚れに匹敵する、伝統的な銀汚れで達成可能でない良い動的線形範囲を示した。紫外線ランプで一般的に使用されるゲルのドキュメント システムで視覚化されるゲル (励起波長: 302/365 nm チャンネル; 排出量: ~ 490-530 nm) 多くの生物のラボで。
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Protocol
1. ゲルの調製
注: デモ SDS ページ12後まもなく染色ゲルを準備する標準プロトコルに従います。簡単に言えば、次の手順は、サンプルの準備を記述する、ゲルの電気泳動。
- 4-12% ビス トリス タンパク質ゲル (1 mm、15 ウェル) と SDS ページの実行 2-(n-morpholino) 満ちてミニ ゲル槽を用いた ethanesulfonic 酸 (MES) バッファー。
- 蒸留水、リチウム dodecyl 硫酸塩 (LDS) バッファー、サンプル低減剤の混合試料を希釈します。
- 通常の在庫量 (5 μ L) と (8192 x 2 x から 13 希釈液) 株式の二重の希薄はその後のシリーズに続いてダブル ストック (10 μ L) の量と第 1 レーンをロードします。
- 30 分間 200 V の定電圧でゲルを実行します。
2. ゲルの固定
- 電気泳動後 50 rpm 4 ° C で室温 2 x (30 分ごと)、または一晩で軌道シェーカーで 40 %ethanol/10% 酢酸 100 mL の溶液でジェルを水没します。
- ゲル 3 x 10 分ずつ清潔な容器に超純水で洗います。洗浄のステップが重要です。蛍光開発ステップで定着液から酸が適切に削除されていない場合過剰なTPE 4TAは酸によってできるようになり、ゲルで強力なバック グラウンド蛍光に 。
3 作成、アグノ3ソリューションとゲルの鍍銀
- アグノ3ソリューション (0.0001%) を作成するには含浸、アグノ3 0.1% アグノ3ストック溶液を調製する純水 10 mL の 0.01 g をまず、解散します。次に、実用的なソリューションを作るために超純水水 100 mL に 0.1% アグノ3ストック溶液 100 μ L を追加します。
メモ: アグノ3ソリューションは、使用する前に暗闇の中で保存する必要があります。 - 1 h のためのソリューションに取り組んで密封されたガラス容器の 50 回転軌道シェーカー銀の 100 ml ゲルを含浸します。ヒューム フード、アルミ箔を光から保護の下で鍍銀を実行するが重要です。
- 2 x 60 の清潔な容器に超純水水 (約 100 mL) のゲルを洗う s。
4. 蛍光ゲルの開発
- 染料原液 (0.1 mM) を準備するには、50 ml の超純水のTPE 4TA色素の 3.0 mg を追加します。数分間ソリューションを超音波照射し、色素を溶解するためにいくつかの NaOH 溶液 (たとえば 1 M) を追加します。
- 蛍光色素分子が完全に解散したことを確保するため 365 nm の紫外線ランプの下で解決策を確認してください。弱いまたは発光のソリューションは、完全な分解を示すだけ。
注: TPE 4TAだった色素合成次プロトコルが最近謝らによって報告されました。10 TPE 4TAソリューションは非常に安定していると数ヶ月の暗闇の中で保つことができます。 - 蛍光現像液 (10 μ M) の 100 mL を準備するには、90 mL の純水にTPE 4TA原液 10 mL を追加します。PH メーターを使用して液の pH を確認し、7-9 は、水酸化ナトリウム溶液 (1 μ M) を使用して調整します。
- 蛍光現像液 100 mL で清潔で密閉容器にゲルを転送します。ゲルはソリューションに完全に浸漬されていることを確認します。容器を密封します光からカバーし、一晩室温で 50 回転軌道シェーカーで振る。また、潜伏ステップは、AIE 現像液で染色し、その後、室温でそれを残して 80 ° C に予熱して約 ~ 2 h も短縮できます。
5. 染め色とイメージング
- 清潔な容器にゲルを転送し、30 分間 10% エタノール 100 ml すすぐ。
注: ゲルを洗浄する水だけを使用できます。しかし、染め色に 10% のエタノールを使用する時間効率的です。これは時間から 30 分に染め色のプロセスを削減するのに役立ちます。 - 5 分間超純水でジェルを洗い流してください。
- 365 nm チャネルまたは 302 nm チャンネルでゲルをイメージすると、ゲルのマニュアル機をします。
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Representative Results
蛍光銀染色で染色蛋白質バンドは、365 nm の紫外線ランプの下で強烈な緑の蛍光性を表わします。すべて 14 タンパク質のバンド (10-200 kDa)、上下からから、染色可視ルビー色素 (図 2)1014 の赤いものによく相関、明確に表示でした。
量的蛋白質の検出に関するイメージング システムの自動化された手順を使用してゲル ゲルをイメージしました、画像を分析し、商用ソフトウェアを使用して比較しました。この蛍光の銀染色法は、高解像度を持って表示されます。いくつかのタンパク質のバンド蛍光銀染色の感度は蛍光可視ルビー汚れのそれよりわずかによいまた。特に、新しいメソッドが低分子の重量が付いている蛋白質の検出に特に有用であることを示す、~ 10 に 40 kDa 蛋白質バンドの蛍光銀染色法の性能が向上しました。またタンパク質定量 (図 3)11蛍光銀染色は、比較的広い範囲にわたって 14 タンパク質良いと均一な直線性を与えたことが示唆されました。
高いレベルのバック グラウンド信号と歪んだピークを与えた硝酸銀染色とは対照的蛍光銀染色はすべて 14 タンパク質の間で良好なコントラストで均一な強度分布可視ルビー汚れに匹敵するバンドを検出(図 3)。
高いバック グラウンド (図 4) を染色ゲル固定になります後その不十分な洗浄に注意してください。残留酢酸、 TPE-4 paが点灯、強力なバック グラウンドに 。
図 1: TPE 4TA と ag+センシング機構の化学構造。X = H または Na+。著作権 2018年ワイリー VCH11前作から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 蛍光銀染色します。A)プロトコルの概要。B)ゲル染色蛍光銀染色 (左) と可視ルビー汚れ (右) の比較イメージ 365 nm 照射下におけるハンドヘルド UV ランプと並行。タンパク質 (10-200 kDa) 二重シリアル希釈 200 500 ng/バンドから始まって、一番左車線を読み込みました。著作権 2018年ワイリー VCH11前作から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 蛋白質量、代表的なゲルの画像、および 3 つのさまざまな汚れが付いているゲルの (から 5 車線) 信号プロファイルに対するタンパク質の蛍光強度。(A) 硝酸銀染色、(B) 蛍光銀染色 (365 nm 励起)、および (C) 可視ルビー汚れ。図の最初の列は、(左から) 最初の車線に正規化された蛋白質の量に対して 14 蛋白質 (10-200 kDa) の各バンドの染色の強さを示しています。2 番目の列は、対応する汚れの代表的なゲル画像を示しています。ゲルにロードの蛋白質の量は、図 2で説明します。著作権 2018年ワイリー VCH11前作から適応。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 最適実験からゲルを染色します。この実験では、洗浄は不十分だった固定ステップの後。残留酢酸TPE 4TAの集計と強力なバック グラウンドを引き起こされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介は新規蛍光銀製の汚損ポリアクリルアミドゲルの蛋白質のためのメソッド。この戦略は、従来の銀汚れと蛍光汚れを統合します。染色攻撃他の銀のように蛋白質に銀イオンの選択的バインド汚れが高感度蛍光シルバーを採用してプローブTPE 4TA銀のバインドされた蛋白質を点灯します。それにより従来の必要に応じて還元的視覚化のステップの任意のさらなる需要がなく高感度検出、蛍光プローブTPE 4TAはナノモル範囲11でかなり低濃度の銀イオンを感じることができる、のでシルバーの汚れ。これは実行するバリエーションを最小限に抑えます。一方、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、頻繁 MS 分析ペプチッド識別を妨げるなどの過酷な化学薬品の使用を避けます。また、 TPE 4TA AIE アクティブは、任意の自己クエンチング問題の無料、蛋白質バンドに密に蓄積された染料は、まとめて色素分子数に対して生成できます。これは、広いダイナミック レンジ (LDR) 蛋白質の検出と可視ルビー汚れと比較するとはるかに明るい染色のために貢献します。
伝統的な銀染色に比べると、大幅に少ない銀製硝酸塩量はこの新しい染色技法-具体的に必要な 0.1% の一般的報告から 0.0001% 銀製硝酸塩の汚損のプロトコル4を使用します。これは、新しい汚れの成功は、高コントラストの背景に非常に明るく、敏感な蛍光プローブの組み合わせに純粋に下り、仮定されることができます。比較では、伝統的な銀汚れで発展途上の段階削減高を背景に発生したときに特に暗い目に見えるバンドを生成する銀の高い量を必要とします。この方法では蛍光開発時間が従来の化学の開発よりも長いただし、これは制限または利点として議論されることができます。ゲルは、オペレーターに由来する可能性があります下のバリエーションでない結果に時間の長い期間のため現像液に残すことが。以下の手順が必要ですがまたより多くの一時停止を実行できますこのプロトコルを非常に便利になるだけではなく。暗い背景で結果ゲルを overdevelop することができます伝統的な開発ステップで異なり overstaining の危険性はありません。この蛍光銀染色は小さい interprotein のバリエーションを持っているとはいえ、付加的な蛋白質のサンプルのさらなる評価は (図 3) を保証も期待されます。
プロトコルから提案された銀製硝酸塩濃度に従うことが重要です。高濃度を使用してより良い性能と感度では発生しませんが、代わりに、バンドの蛍光を巻き込むことができる強力なバック グラウンド蛍光性を作り出します。トラブルシューティングの観点から以上の洗浄は蛍光開発の前に洗浄工程に、または不十分な鍍銀から、感度と明るさの損失可能性があります。このメソッドに蛍光のTPE 4TA Ag+複雑な形成のために不可欠である蛋白質バンドの蛍光信号は蛋白結合銀イオンの数に依存します。タンパク質は、この染色法の可能性を最大限に銀イオンで飽和する必要があります。
最後に、前述、このメソッドで使用される銀イオンの蛍光染料、 TPE-4TAまた pH に敏感。低 pH では、ある無料TPE 4TAに高いバック グラウンド染色の結果、ゲルの蛍光を発することができます。したがって、固定の解決から残留の酢酸を出発、不適切な洗浄の手順は染色品質に大きく影響されます。蛍光開発手順 (図 4) ゲルの pH で比較的中立を保つことが重要です。染色前にTPE 4TA溶液の pH を調整する役に立つ可能性があります。この色素が、近い将来に商業化されることが期待されます。
要約すると、我々 は SDS ページのゲルの総蛋白質の可視化のための新規蛍光銀染色の実用的なプロトコルを記述しました。染色は簡単、使いやすい、低コスト、良好な染色。このメソッドは、ゲル内の蛋白質バンドの同定が非常に容易し、タンパク質解析のための便利なツールを提供します。
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Disclosures
この蛍光銀染色の特許出願が提出されています。
Acknowledgments
著者は、彼のサポートのため、修復医学教育研究、カロリンスカ研究所明カーウァイ ・ ラウ センターでパトリック ・ チャンを感謝したいです。S. x. はスウェーデン研究評議会 (グラント号 2017年-06344) からのサポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
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