Summary
Her beskriver vi en detaljert protokoll beskriver en ny fluorescerende flekker teknikk for totalt proteinet oppdagelsen i polyakrylamid gels. Protokollen bruker en sølv ion-spesifikke fluorescens turn-on sonde, som oppdager Ag+-protein komplekser, og eliminerer visse begrensninger av tradisjonelle kromogent sølv flekker.
Abstract
Sølv flekker er en kolorimetrisk teknikk brukte å visualisere protein band i polyakrylamid gels etter natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side). Klassisk sølv flekker har visse ulemper, som høy bakgrunnsfarge flekker, dårlig protein utvinning, lav reproduserbarhet, en smal lineær dynamiske området for kvantifisering og begrenset kompatibilitet med massespektrometri (MS). Nå, med bruk av en fluorogenic Ag+ sonde, TPE-4TA, vi utviklet fluorescerende sølv flekker metode for totalt protein effekten i polyakrylamid gels. Denne nye flekken unngår plagsom sølv reduksjon trinnet i tradisjonelle sølv flekker. Videre viser fluorescerende sølv flekken god reproduserbarhet, følsomhet og lineær kvantifisering i proteinet oppdagelsen, gjør det en nyttig og praktisk protein gel flekk.
Introduction
Mange flekker metoder har blitt brukt til å visualisere proteiner følgende gel geleelektroforese, for eksempel bruker kolorimetrisk fargestoffer som Coomassie briljant blå, sølv flekken, fluorescens eller radioaktivt merking1,2, 3 , 4. sølv flekker anses å være en av de mest følsomme teknikkene for proteinet oppdagelsen som trenger enkel og billig reagenser. Det kan kategoriseres i to store familier: ammoniacal sølv flekken og sølv nitrat flekken5,6. I alkalisk ammoniacal sølv metoden, er sølv-diamine komplekset produsert med ammoniakk og natriumhydroksid og redusert til metallic sølv under utvikling ved hjelp av en syrlig formaldehyd løsning. Flekken passer effektivt for grunnleggende proteiner, men viser en kompromittert ytelsen for syreholdig og nøytralt proteiner og er videre begrenset til klassisk glysin og taurine electrophoretic systemer. Sammenligning Sølvnitrat flekker utnytter det høy bio-affinitet sølv ioner protein, hovedsakelig av sulfhydryl og carboxyl grupper fra siden kjedene, og pleier å flekken surt proteiner mer effektivt7. Etter sølv ion binding, en utvikling løsning (vanligvis laget av en metall karbonat løsning som inneholder formaldehyd og natrium thiosulphate) brukes til å redusere sølv ioner metallisk sølv korn, som bygger opp en brunt til mørkt farge å visualisere den protein band.
Selv om sølv flekker har vært kjent for sin allsidighet og høy følsomhet siden utviklingen i 1970-tallet8, er metoden ofte ansett som vanskelig. Sølv flekker metoder har tid-begrenset trinn og viser lav reproduserbarhet. Siden fargen på sølv stain ikke er vanligvis uniform og avhengig av reduksjon-trinnet, som er vanskelig å kontrollere, sølv flekken er ikke en kvantitativ metode og, derfor, anbefalt ikke for gel sammenligning studier og protein kvantifisering9. Metoder optimert i følsomhet kan benytte aldehyder som gir også en mer enhetlig flekker10. Dette er imidlertid på bekostning av videre nedstrøms analyse på grunn av crosslinking proteiner av aldehyder. Rask protokoller hovedsakelig kombinere eller kortere for å redusere tiden, at reproduserbarhet og ensartethet av flekken5. Derfor finnes det mange sølv flekker varianter i protein gel flekker, hver optimalisert for å passe visse krav; for eksempel enkelhet, følsomhet eller peptid utvinningsgrad for nedstrøms. Disse attributtene kan også ha innvirkning på hverandre, og oppfyller alle krav i én protokoll kan være vanskelig.
I dette arbeidet introduserer vi en ny fluorescerende sølv flekker metode for proteinet oppdagelsen i polyakrylamid gel. I denne metoden bruker vi en fluorogenic sonde for sølv ioner, TPE-4TA (figur 1), visualisere sølv-impregnert proteiner11. TPE-4TA er designet av aggregering-indusert utslipp (AIE) prinsippet. Det er ikke-emissive når oppløst i vandig løsning, men er svært emissive i nærvær av sølv ioner. Erstatter kromogent utviklingen i tradisjonelle sølv flekker med en fluorogenic utvikle trinn, gjør fluorescerende sølv metoden den robuste flekker av totale proteiner med redusert bakgrunn.
Videre fluorescerende sølv flekken viste en god lineær dynamikk for protein kvantifisering, som er sammenlignbare med brukte SYPRO Ruby flekken og ikke oppnåelig med tradisjonelle sølv flekker. Gelen kan avbildes på brukte gel dokumentasjonssystemer med en ultrafiolett lampe (eksitasjon bølgelengde: 302/365 nm kanal, utslipp: ~ 490-530 nm) på mange biologiske laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av Gel
Merk: Demonstrasjonen følger en standardprotokoll for å forberede gel flekker etter SDS-side12. I korte trekk følgende beskriver utarbeidelse av prøvene og gel geleelektroforese.
- Utføre SDS-side med 4% - 12% Bis-Tris protein gels (1 mm, 15-vel) ved hjelp av en mini gel tank fylt med 2-(N -morpholino) ethanesulfonic syre (MES) buffer.
- Fortynne prøvene med en blanding av destillert vann, litium dodecyl sulfate (LDS) buffer og en eksempel-reduserende agent.
- Legg den første lane med doble av lager (10 µL), etterfulgt av lager lang (5 µL) og en rekke todelt fortynninger av aksjen etterpå (13 fortynninger, fra 2 x til 8192 x).
- Kjør gel med en konstant spenning på 200 V for 30 min.
2. fiksering av Gel
- Etter geleelektroforese, senke geléer i en 100 mL løsning av eddiksyre 40% ethanol/10% på en orbital shaker på 50 rpm ved romtemperatur 2 x (hver for 30 min), eller over natten i 4 ° C.
- Vask geléer 3 x 10 min hver i ultrapure vann i en ren beholder. Vask trinnet er avgjørende. Hvis syre fra fikse løsning ikke fjernes riktig i fluorogenic utvikling trinn, overdreven TPE-4TA aktiveres av syre og føre til sterk bakgrunn fluorescens i gel.
3. forberedelse av AgNO3løsning og sølv impregnering av Gel
- Å gjøre AgNO3 løsningen (0,0001%) for impregnering, først oppløse 0,01 g AgNO3 i 10 mL ultrapure vann å forberede en 0,1% AgNO3 lagerløsning. Deretter legge til 100 µL av 0,1% AgNO3 lager løsningen i 100 mL ultrapure vann for å lage den arbeider løsningen.
Merk: AgNO3 løsningen skal lagres i mørket før bruk. - Impregner gel med 100 mL sølv løsning for 1t bearbeider en orbital shaker på 50 rpm i en forseglet glassbeholder. Det er viktig å utføre sølv impregnering under avtrekksvifte, beskyttet fra lys med aluminiumsfolie.
- Vaske gel med ultrapure vann (ca 100 mL) i en ren beholder for 2 x 60 s.
4. Fluorogenic utvikling av Gel
- For å forberede fargestoff lager løsningen (0,1 mM), legger du til 3.0 mg av TPE-4TA fargestoff i 50 mL ultrapure vann. Sonicate løsningen i noen minutter og legge noen NaOH løsning (for eksempel 1 M) for å hjelpe oppløse fargestoff.
- Sjekk fluorescens løsningen under en 365 nm UV-lampe å sikre at fargestoff molekylet er fullstendig oppløst. Bare viser svak eller nonemissive løsninger full oppløsning.
Merk: Fargestoff TPE-4TA ble syntetisert følgende protokollen nylig rapportert av Xie et al. 10 TPE-4TA løsningen er svært stabil og kan holdes i mørket i måneder. - For å forberede 100 mL fluorogenic utvikle løsningen (10 µM), legger du til 10 mL av TPE-4TA lager løsningen i 90 mL ultrapure vann. Sjekk pH av løsningen med en pH-meter og tune det 7-9 ved hjelp av en natriumhydroksid løsning (1 µM).
- Overføre gel til en ren og sealable beholder med 100 mL fluorogenic utvikle løsningen. Kontroller gel er totalt oppslukt i løsningen. Sel beholderen. Dekk den fra lys og rist den natten på en orbital shaker på 50 rpm ved romtemperatur. Alternativt kan inkubasjon trinnet også forkortes til ca ~ 2 h av forvarming AIE utvikle løsningen til 80 ° C for flekk og la ved romtemperatur.
5. destaining og tenkelig
- Overføre gel til en ren beholder, og destain det i 100 mL 10% etanol i 30 min.
Merk: Vann alene kan brukes å vaske gel. Det er imidlertid mer tidkrevende å bruke en 10% etanol løsning for den destaining. Dette vil bidra til å redusere destaining prosessen fra timer til 30 min. - Skyll gel i ultrapure vann i 5 minutter.
- Bilde gel på 365 nm kanalen eller 302 nm kanal av en gel dokumentasjon maskin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protein bandene farget av fluorescerende sølv flekken forevise en intens grønne fluorescens under en 365 nm UV-lampe. Alle 14 protein band (10-200 kDa), var fra topp til bunn, tydelig, samkjøre godt med de 14 rød-farget farget av SYPRO Ruby fargestoff (figur 2)10.
Når det gjelder kvantitativt proteinet oppdagelsen, geléer ble fotografert av en gel imaging system som bruker automatiserte prosedyrer, og bildene ble analysert og forhold ved hjelp av kommersiell programvare. Denne fluorescerende sølv flekker metoden synes å ha en høy oppløsning. For noen protein band er sensitiviteten av lysrør sølv flekken også litt bedre enn lysstoffrør SYPRO Ruby flekken. Spesielt ble ytelsen til fluorescerende sølv flekken forbedret for ~ 10 til 40 kDa protein band, som angir at den nye metoden er spesielt nyttig for påvisning av proteiner med lav molekyl vekt. Data tyder også på at fluorescerende sølv flekken ga en god og ensartet linearitet for alle 14 proteiner over et relativt bredt spekter for protein kvantifisering (Figur 3)11.
I motsetning til sølv nitrat flekken som ga høy bakgrunn signal og forvrengt topper, oppdaget fluorescerende sølv flekken band med god kontrast og uniform intensitet distribusjon sammenlignes for SYPRO Ruby flekken over alle 14 proteiner (Figur 3).
Merk at utilstrekkelig vaske etter gel fiksering vil resultere i høy bakgrunn flekker (Figur 4). Den gjenværende eddiksyre vil lyse opp TPE-4PA og føre til en sterk bakgrunn.
Figur 1: Kjemisk struktur av TPE-4TA og dens sensing mekanikk AG+. X = H eller Na+. Tilpasset fra tidligere arbeid, copyright 2018 WILEY-VCH11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: fluorescerende sølv farging. A) Sammendrag av protokollen. B) en sammenligning av gels farget av fluorescerende sølv flekk (venstre) og SYPRO Ruby flekk (høyre) fotografert sammen med en håndholdt UV-lampe under 365 nm bestråling. Proteiner (10-200 kDa) ble lastet av todelt føljetong fortynning fra 200-500 ng/band på de venstre veibane. Tilpasset fra tidligere arbeid, copyright 2018 WILEY-VCH11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: fluorescens intensiteten av proteiner mot protein beløpet, representant gel bilder og signal profiler (fra femte kjørefelt) av gels med tre ulike flekker. (A) Sølvnitrat flekken,(B) fluorescerende sølv flekken (365 nm eksitasjon), og (C) SYPRO Ruby flekken. Den første kolonnen i figuren viser intensiteten av flekken for hvert band av 14 proteiner (10-200 kDa) mot mengden av protein normalisert til første felt (starter til venstre). Den andre kolonnen viser representant gel bildene tilsvarende flekken. Mengden av protein lastet inn gel er beskrevet i figur 2. Tilpasset fra tidligere arbeid, copyright 2018 WILEY-VCH11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: farget gel fra en suboptimal eksperiment. I dette eksperimentet var vask utilstrekkelig etter fiksering trinn. Den gjenværende eddiksyre indusert aggregering av TPE-4TA og forårsaket en sterk bakgrunn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presenteres her er romanen fluorescerende sølv flekker metode for proteiner i polyakrylamid gels. Denne strategien integrerer konvensjonell sølv flekker og fluorescerende flekker. Farging bedriftene selektiv binding av sølv ion proteiner som andre sølv flekker, men bruker svært sensitive fluorogenic sølv sonde TPE-4TA å lyse opp en bundet proteiner. Siden fluorogenic sonden TPE-4TA kan forstand sølv ioner i en relativt lav konsentrasjon i nanomolar området11, gjør det en svært følsom oppdagelsen uten ytterligere etterspørsel et reductive visualisering trinn etter behov i tradisjonelle sølv flekker. Dette vil minimere Kjør bruk varianter. I mellomtiden, unngår bruk av sterke kjemikalier, inkludert formaldehyd og glutaraldehyde, som ofte forstyrre peptid identifikasjon i MS analyse. Videre, ettersom TPE-4TA er AIE-aktiv og gratis selv slukke problemer, tett akkumulert fargestoffer på et protein band kan avgi kollektivt svar på antallet fargestoff molekyler. Dette bidrar til en bred lineær dynamiske området (LDR) for proteinet oppdagelsen og en mye lysere flekker sammenlignet med SYPRO Ruby flekken.
Sammenlignet med tradisjonelle sølv flekker, en betydelig mindre mengde Sølvnitrat kreves for denne nye flekker teknikk-spesielt, 0,0001% fra 0,1% rapportert i vanligvis brukt Sølvnitrat flekker protokoller4. Det kan være hypotese at suksessen til nye flekken er rent ned kombinasjonen av utrolig lyse og følsom fluorescerende sonden mot en bakgrunn med høy kontrast. Sammenligning krever reduksjon i det tredje trinnet i tradisjonelle sølv flekker et høyere antall sølv å produsere mørke synlige bånd, spesielt når det oppstår en høy bakgrunn. I denne metoden er fluorogenic utviklingstid lengre enn tradisjonelle kjemiske utvikling; men kan dette diskuteres som en begrensning eller som en fordel. Gelen kan stå i utvikle løsningen for lange perioder uten konsekvenser, noe som resulterer i lavere varianter som kan komme fra operatøren. Ikke bare er det færre trinn kreves, men også mer pauser kan tas, noe som gjør denne protokollen ganske praktisk. Det er ingen risiko for overstaining i motsetning til i tradisjonell utvikling trinn som kan overdevelop gel, som resulterer i en mørk bakgrunn. Denne fluorescerende sølv flekken forventes også å ha en mindre interprotein variant, men en videre evaluering av ekstra protein prøver garanteres (Figur 3).
Det er viktig å følge den foreslåtte Sølvnitrat konsentrasjonen fra protokollen; bruke en høyere konsentrasjon resulterer ikke i bedre ytelse og følsomhet men i stedet gir en sterk bakgrunn fluorescens som kan sluke fluorescens band. I feilsøking, kan tap i følsomhet og lysstyrke resultere fra over vask i vask trinn før fluorogenic utvikling eller utilstrekkelig sølv impregnering. For denne metoden er fluorescens signalet av protein bandet avhengig av antall protein-bundet sølv ioner, som er viktig for dannelsen av fluorescerende TPE-4TA-Ag+ kompleks. Proteinet skal fuktes med sølv ioner å maksimere potensialet i denne flekker metoden.
Til slutt, som nevnt tidligere, fluorogenic farge for sølv ion brukes i denne metoden, TPE-4TA, er også pH følsom. En lav pH kan protonere gratis TPE-4TA til fluoresce i gel, som resulterer i en høye flekk. Derfor vil uriktig vask skritt, som lar gjenværende eddiksyre fra fiksering løsning, sterkt påvirke flekken kvaliteten. Det er viktig å holde gel relativt nøytrale i pH i fluorogenic utvikling trinn (Figur 4). Det kan også være nyttig å justere pH i TPE-4TA løsningen før farging. Det forventes at dette fargestoffet ville være commercialized i nær fremtid.
I sammendraget beskrev vi en praktisk protokoll romanen fluorescerende sølv flekken for visualisering av totale proteiner i SDS side gel. Den flekker er enkel, lett-å-bruke, kostnadseffektiv, og har en god flekker ytelse. Denne metoden kan forenkle identifikasjon av protein bandene i gels og gir et nyttig verktøy for protein analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Blitt har arkivert en patent på denne fluorescerende sølv flekker.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Patrick Chan Ming Wai Lau sentrum for Reparative medisin, Karolinska Institutet, hans kundestøtte. S. X. er takknemlig for støtten fra den svenske Research Council (Grant No. 2017-06344).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
LDS Sample Buffer (4X) |
Thermo Fisher Scientific | NP0007 | Reagent |
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well |
Thermo Fisher Scientific | NP0323BOX | Precast gel |
| Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Fisher Scientific | NP0004 | Reagent |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher Scientific | NP0002 | Reagent |
| Mini Gel Tank | Thermo Fisher Scientific | A25977 | Equipment |
| 300W Power Supply (230 VAC) | Thermo Fisher Scientific | PS0301 | Equipment |
| Unstained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Sample |
| Silver nitrate | Sigma-Aldrich | 31630-25G-R | Reagent |
| Ethanol | Bragg and co. | 42520J | Reagent |
| Acetic acid | J.T. Baker | 103201A | Reagent |
| Milli-Q Synthesis A10 | Merk | - | Provides 18.2 MΩ.cm water |
| gel documentation system (c600 model) | Azure biosystems | - | Equipment |
References
- Chevalier, F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Science. 8 (1), (2010).
- Harris, L. R., Churchward, M. A., Butt, R. H., Coorssen, J. R. Assessing detection methods for gel-based proteomic analyses. Journal of Proteome Research. 6 (4), 1418-1425 (2007).
- Gauci, V. J., Wright, E. P., Coorssen, J. R. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. Journal of Chemical Biology. 4 (1), 3-29 (2011).
- Candiano, G., Bruschi, M., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).
- Jin, L. T., Hwang, S. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. Sensitive silver staining of protein in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels using an azo dye, calconcarboxylic acid, as a silver-ion sensitizer. Electrophoresis. 25 (15), 2494-2500 (2004).
- Celis, J. E., et al. Cell Biology: A Laboratory Handbook. , Elsevier Academic Press. Amsterdam, the Netherlands. (2006).
- Bartsch, H., Arndt, C., Koristka, S., Cartellieri, M., Bachmann, M. Silver Staining Techniques of Polyacrylamide Gels. Methods in Molecular Biology. 869 (1), 481-486 (2012).
- Rabilloud, T., Vuillard, L., Gilly, C., Lawrence, J. Silver-staining of proteins in polyacrylamide gels: a general overview. Cellular and Molecular Biology. 40 (1), 57-75 (1994).
- Zhou, M., Yu, L. Proteomic Analysis by Two-Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Advances in Protein Chemistry. 65 (1), 57-84 (2003).
- Xie, S., et al. Fluorogenic Ag+-Tetrazolate Aggregation Enables Efficient Fluorescent Biological Silver Staining. Angewandte Chemie International Edition. 57 (20), 5750-5753 (2018).
- Protein gel electrophoresis technical handbook. , Thermo Fisher Scientific. Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf (2015).
