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एक अनुकूलित Rhizobox प्रोटोकॉल मूल विकास और जवाबदेही स्थानीयकृत पोषक तत्वों को कल्पना करने के लिए

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/58674
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Plant Sciences, University of California at Davis, 2Department of Natural Resources and the Environment, University of New Hampshire

Summary

सीटू में रूट ग्रोथ को visualizing और मापने का बेहद चुनौतीपूर्ण है । हम पोषक तत्व संवर्धन के जवाब में समय के साथ जड़ विकास और प्रसार को ट्रैक करने के लिए एक अनुकूलन rhizobox विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि एक कार्बनिक नाइट्रोजन स्रोत के जवाब में जड़ प्लास्टिक में मक्का genotypic मतभेदों का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Abstract

जड़ें बेहद मुश्किल अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं । मृदा दोनों एक दृश्य और यांत्रिक बाधा है, यह मुश्किल विनाशकारी फसल या महंगे उपकरणों के बिना सीटू में जड़ों को ट्रैक करने के लिए बना । हम एक अनुकूलन योग्य और सस्ती rhizobox विधि है कि समय पर जड़ विकास के गैर विनाशकारी दृश्य की अनुमति देता है वर्तमान और विशेष रूप से स्थानीयकृत संसाधन पैच के जवाब में जड़ प्लास्टिक का अध्ययन करने के लिए अनुकूल है । विधि 15N-लेबल फली अवशेषों युक्त पैच को प्लास्टिक की प्रतिक्रियाओं में मक्का genotypic भिंनता का आकलन द्वारा मान्य किया गया था । तरीके समय पर प्रतिनिधि विकासात्मक माप प्राप्त करने के लिए, संसाधन युक्त और नियंत्रण पैच में जड़ लंबाई घनत्व को मापने, जड़ विकास दर की गणना, और संयंत्र की जड़ों और गोली से 15N वसूली निर्धारित करने के लिए वर्णित हैं । लाभ, निरंतर, और विधि के संभावित भविष्य अनुप्रयोगों पर भी चर्चा कर रहे हैं । हालांकि देखभाल सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए कि प्रयोगात्मक शर्तों मूल विकास डेटा पूर्वाग्रह नहीं है, rhizobox प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत की पैदावार विश्वसनीय परिणाम अगर विस्तार करने के लिए पर्याप्त ध्यान के साथ बाहर ले जाया ।

Introduction

हालांकि अक्सर अपने aboveground समकक्षों की तुलना में अनदेखी की, जड़ों संयंत्र पोषक तत्व अधिग्रहण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । रूट निर्माण और रखरखाव की पर्याप्त कार्बन लागत को देखते हुए, पौधों की जड़ें विकसित करने के लिए तंत्र विकसित किया है जहां चारा निवेश के लायक है । रूट सिस्टम इस प्रकार कुशलतापूर्वक और गतिशील मेरा संसाधन पैच कर सकते है proliferating के आकर्षण के बीच में, तेज की दर को विनियमित करने, और तेजी से translocating पोषक तत्वों के लिए आगे1परिवहन के लिए फ्लोएम । प्लास्टिक की प्रतिक्रियाओं संयंत्र प्रजातियों या पादी2,3 के बीच व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं और4,5शामिल पोषक तत्वों के रासायनिक रूप पर निर्भर करता है. जड़ प्लास्टिक में भिंनता आगे का पता लगाया जाना चाहिए, के रूप में जटिल विषम मृदा संसाधनों को जड़ प्रतिक्रियाओं को समझने प्रजनन और प्रबंधन रणनीतियों कृषि में पोषक तत्वों का उपयोग क्षमता बढ़ाने के लिए सूचित कर सकता है ।

अपनी आवश्यकता और प्रासंगिकता संयंत्र प्रणालियों को समझने के लिए के बावजूद, visualizing और प्रासंगिक तराजू पर जड़ प्लास्टिक को बढ़ाता तकनीकी चुनौतियों बन गया है । मिट्टी से जड़ मुकुट खुदाई ("shovelomics"6) एक आम तरीका है, लेकिन ठीक जड़ों का दोहन छोटे मिट्टी समुच्चय के बीच pores, और खुदाई अनिवार्य रूप से इन नाजुक जड़ों के नुकसान के कुछ डिग्री की ओर जाता है । इसके अलावा, विनाशकारी फसल यह असंभव समय के साथ एक जड़ प्रणाली में परिवर्तन का पालन करने के लिए बनाता है । में सीटू इमेजिंग तरीकों जैसे एक्स-रे गणना टोमोग्राफी उच्च स्थानिक संकल्प7पर जड़ों और मिट्टी संसाधनों के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति है, लेकिन महंगे है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है । Hydroponic प्रयोगों मिट्टी से जड़ों को निकालने के साथ जुड़े बाधाओं से बचने के लिए, लेकिन रूट आकृति विज्ञान और वास्तुकला यांत्रिक बाधाओं और मिट्टी की शारीरिक जटिलता की तुलना में जलीय मीडिया में अलग8,9. अंत में, rhizosphere प्रक्रियाओं और कार्यों इन कृत्रिम मीडिया में विकासात्मक प्लास्टिक के साथ एकीकृत नहीं किया जा सकता है ।

हम निर्माण और rhizoboxes के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल वर्तमान (संकीर्ण, स्पष्ट तरफा आयताकार कंटेनरों) के रूप में एक कम लागत, अनुकूलन विधि समय के साथ मिट्टी में जड़ विकास की विशेषता है । विशेष रूप से डिजाइन फ्रेम जड़ों gravitropism के कारण वापस पैनल के खिलाफ तरजीही बढ़ने के लिए प्रोत्साहित, जड़ लंबाई माप की सटीकता में वृद्धि. Rhizoboxes सामांयतः रूट विकास और rhizosphere बातचीत10,11,12का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, लेकिन यहां प्रस्तुत विधि अपनी एकल डिब्बे डिजाइन और सस्ती के साथ सादगी में एक लाभ प्रदान करता है सामग्री, और स्थानीयकृत पोषक तत्वों के लिए रूट प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए बनाया गया है । हालांकि, विधि भी अन्य जड़ और rhizosphere प्रक्रियाओं की एक सीमा का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है इस तरह के इंट्रा/प्रजाति प्रतियोगिता, रासायनिक यौगिकों, रोगाणुओं, या एंजाइम गतिविधि के स्थानिक वितरण. यहां, हम 15N-लेबल फली अवशेषों के पैच के जवाब में मक्का संकर के बीच genotypic मतभेदों की जांच और प्रतिनिधि परिणामों को उजागर करने के लिए rhizobox विधि को मांय ।

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Protocol

1. आगे और पीछे पैनलों, और स्पेसिंग की तैयारी

  1. आगे और पीछे पैनल तैयार करते हैं ।
    1. कट के दो टुकड़े स्पष्ट ०.६३५ सेमी मोटी एक्रिलिक के लिए ४०.५ सेमी चौड़ा द्वारा ६१ सेमी लंबे समय प्रति बॉक्स या खरीद पूर्व कट टुकड़े ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. एक ड्रिल एक्रिलिक, ड्रिल छेद ०.६३५ सेमी व्यास १.३ सेमी में साइड किनारों से २.५, 19, ३८, और ऊपर से ५३.३ सेमी के लिए डिजाइन का उपयोग करना । ड्रिल २.५, २०.३ पर नीचे बढ़त से १.३ सेमी छेद, और बाईं ओर से ३८ सेमी (चित्रा 1) ।
      नोट: यह सबसे कुशल है एक समय में छह से दस चादरें के ढेर के लिए एक ड्रिल प्रेस का उपयोग करें, लेकिन एक हाथ ड्रिल भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    3. एक्रिलिक से किसी भी सुरक्षात्मक आवरण निकालें और धीरे बक्से कोडांतरण से पहले दोनों पैनलों साफ ।

Figure 1
चित्रा 1: ड्रिल्ड छेद का लेआउट । छेद २.५, 19, ३८ पर पक्ष किनारों से १.३ सेमी drilled रहे हैं, और ५३.३ सेमी ऊपर से, और नीचे बढ़त से १.३ सेमी पर २.५, २०.३, और बाएं हाशिए से ३८ सेमी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. साइड और बॉटम स्पेसर्स तैयार करें ।
    1. उच्च घनत्व पॉलीथीन (एचडीपीई) से प्रति बॉक्स तीन स्पेसर्स कट या दो पूर्व कट साइड स्पेसर (०.६३५ सेमी मोटी, २.५ सेमी चौड़ा, ५७ सेमी लंबी), और एक पूर्व कटौती नीचे स्पेसर (०.६३५ सेमी मोटी, २.५ सेमी चौड़ा, ४०.५ सेमी लंबी) खरीद । सामग्री की तालिकादेखें ।
    2. पक्ष और बॉक्स के नीचे के साथ आगे और पीछे पैनलों के बीच स्पेसर्स संरेखित करें । एक हाथ ड्रिल या ड्रिल प्रेस का प्रयोग, सामने में मौजूदा छेद के माध्यम से ड्रिल और वापस फिर इतना है कि छेद सभी तीन परतों के माध्यम से सफाई से गुजारें ।
    3. परतों की जगह clamps का उपयोग कर पकड़ो या बोल्ट, नट, और वाशर का एक संयोजन स्थापित करने के द्वारा प्रत्येक नव drilled छेद में (३.१ कदम देखें) ।

2. बॉक्स के तल पर पॉलिएस्टर बल्लेबाजी की एक पट्टी की स्थापना

नोट: इससे मिट्टी और पानी को स्पेसर्स के बीच जोड़ों के माध्यम से लीक होने से रोका जा सकेगा ।

  1. कट पॉलिएस्टर ४०.५ सेमी लंबी स्ट्रिप्स द्वारा २.५ सेमी चौड़ा में बल्लेबाजी ( सामग्री की मेजदेखें) ।
  2. पीछे पैनल झूठ बोल सपाट और इसके शीर्ष पर स्पेसर्स के साथ, सीधे नीचे स्पेसर के ऊपर बल्लेबाजी करना और जगह में शीर्ष पैनल के साथ पकड़ (चित्रा 2) ।

Figure 2
चित्रा 2: बल्लेबाजी के साथ इकट्ठे rhizobox । rhizobox के तल पर बल्लेबाजी की एक संकीर्ण पट्टी बाहर लीक होने से मिट्टी और रेत को रोकती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

3. Rhizoboxes की सभा

  1. rhizoboxes 20-धागा शिकंजा (०.६३५ cm व्यास द्वारा ३.२ cm लंबाई), वाशर (०.६३५ सेमी आंतरिक व्यास), और हेक्स नट का उपयोग कर इकट्ठा (शिकंजा फिट करने के लिए आकार, सामग्री की मेजदेखते हैं ।
  2. एक वॉशर, सामने पैनल, स्पेसर, वापस पैनल, वॉशर, और हेक्स अखरोट के माध्यम से प्रत्येक पेंच कस । सुनिश्चित करें कि शिकंजा बहुत तंग कर रहे हैं; यदि बॉक्स ढीला इकट्ठा है, मिट्टी पैनलों और पक्ष स्पेसर्स के बीच अंतराल के माध्यम से बाहर फैल जाएगा ।
    नोट: एक्रिलिक आसानी से खरोंच है, और खरोंच जड़ माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, तो देखभाल के साथ इकट्ठे बक्से संभाल । बक्से स्टैकिंग से बचें जब तक सुरक्षात्मक सामग्री उन दोनों के बीच रखा गया है ।
  3. बॉक्स प्रति (उपचार और नियंत्रण पैच बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा कि स्पेसर) दो पैच स्पेसर्स तैयार करें । उच्च घनत्व पॉलीथीन (एचडीपीई) शीट से कट स्पेसर या खरीद उंहें पूर्व में कटौती (०.६३५ सेमी मोटी, ३.८ सेमी चौड़ा, 28 सेमी लंबा; सामग्री की तालिकादेखें) । ड्रिल एक छेद में ०.६३५ सेमी व्यास में प्रत्येक स्पेसर, मध्य लाइन (चित्रा 3) के साथ शीर्ष से 2 सेमी ।

Figure 3
चित्रा 3: पैच स्पेसर्स । शिकंजा एचडीपीई स्ट्रिप्स के केंद्र के माध्यम से डाला बॉक्स में गिरने से उन्हें रखने के लिए । rhizobox स्पेसर्स के आसपास मिट्टी से भर जाता है, मिट्टी गीला है, और स्पेसर को खाली उपचार और नियंत्रण पैच छोड़ने के लिए हटा दिया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. एक नट के साथ एक छेद के माध्यम से एक पेंच सुरक्षित ताकि स्पेसर आंशिक रूप से rhizobox में डाला जा सकता है जब तक पेंच इसे आगे जाने से रोकता है (चित्रा 3) ।
    नोट: जब मिट्टी स्पेसर के आसपास गीला है और स्पेसर हटा दिया जाता है, दो खाली जगह है कि नाइट्रोजन युक्त उपचार पैच और नियंत्रण पैच के लिए उपयुक्त सब्सट्रेट के साथ भरा जा सकता रहेगा ।

4. इमारत पीवीसी फ्रेम एक कोण पर Rhizoboxes समर्थन करने के लिए

नोट: जब बॉक्स एक कोण पर रखा गया है, gravitropism जड़ों को वापस पैनल के खिलाफ इतना है कि सभी जड़ों अनुरेखण के लिए दिखाई दे रहे है विकसित करने के लिए प्रोत्साहित करेंगे । चित्रा 4 में polyvinyl क्लोराइड (पीवीसी) आयाम एक फ्रेम है कि बेंच के लिए एक लगभग ५५ ° कोण पर rhizobox का कहना है में परिणाम ।

  1. कट बॉक्स प्रति १.३ cm व्यास पीवीसी के 13 टुकड़े: 2 × ४४ सेमी लंबाई, 3 × ४२ सेमी लंबाई, 2 × ३६.३ सेमी लंबाई, 2 × २५.४ सेमी लंबाई, और 4 × ३.८ सेमी लंबाई ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    नोट: एक काट देखा अत्यधिक दक्षता और भी कटौती के लिए सिफारिश की है ।
  2. 4 × 2 तरह कोहनी का प्रयोग करें, 2 × 3 तरह कोहनी, और 4 टी जोड़ों ( सामग्री की तालिकादेखें) के रूप में चित्र 4में दिखाया बॉक्स को इकट्ठा ।
    नोट: फ्रेम अतिरिक्त गोंद के बिना स्थिर होना चाहिए, लेकिन पीवीसी गोंद यदि आवश्यक हो तो इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Figure 4
चित्रा 4: rhizoboxes का समर्थन करने के लिए फ़्रेम । हल्के फ्रेम पीवीसी कट से निर्दिष्ट लंबाई और संयुक्त प्रकार का उपयोग कर जुड़ा का निर्माण किया है संकेत दिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

5. सिलाई सुरक्षात्मक मामलों प्रकाश और गर्मी को प्रतिबिंबित करने के लिए

ध्यान दें: जड़ों प्रकाश से बचने के लिए, तो इन मामलों में आदेश सुनिश्चित करें कि मनाया रूट प्लास्टिक की प्रतिक्रियाओं पैच में पोषक तत्व स्रोत और नहीं प्रकाश परिहार द्वारा संचालित कर रहे हैं बनाने के लिए प्रकाश को बाहर । प्रकाश अभाव कपड़े भी rhizoboxes के अंदर तापमान कम कर देता है, गर्मी तनाव से बचने में मदद ।

  1. कटौती प्रकाश अभाव कपड़े (विशेष सामग्री है कि एक तरफ सफेद और अंय पर काला है) टुकड़ों में लगभग ९५ सेमी चौड़ा और ६९ सेमी लंबे ( सामग्री की तालिकादेखें) । प्रति बॉक्स एक टुकड़ा की आवश्यकता है ।
  2. एक ४७.५ cm × ६९ cm आस्तीन फार्म करने के लिए लंबी बढ़त के साथ आधे में प्रत्येक टुकड़ा गुना । एक सिलाई मशीन सुई डेनिम के लिए डिजाइन का उपयोग करना, भारी शुल्क रजाई बना हुआ धागा, और एक संकीर्ण सीवन, नीचे के साथ सीना और प्रत्येक आस्तीन के पक्ष को रास्ते के ¾. सुरक्षा पिन के साथ शीर्ष कोनों को एक साथ पिन करना ।

6.1:1 की तैयारी (v/v) मिट्टी: रेत सब्सट्रेट Rhizoboxes भरने के लिए

  1. लगभग १,००० सेमी3 क्षेत्र की मिट्टी (ब्याज की साइट से) प्रति बॉक्स ले लीजिए । ६० डिग्री सेल्सियस पर उथले ट्रे में लगातार वजन के लिए मिट्टी सूखी ।
    नोट: इस प्रयोग के लिए मिट्टी तुरंत एकत्र किया गया था एक बवाल में कामयाब मकई क्षेत्र से 0 \ u201210 सेमी गहराई ।
  2. एक मोर्टार और मूसल के साथ मिट्टी पीस एक 2 मिमी छलनी के माध्यम से पारित करने के लिए । मिट्टी के एक ज्ञात मात्रा वजनी द्वारा मिट्टी के थोक घनत्व को मापने ।
  3. रेत प्राप्त करें (जैसे play रेत, जो एक हार्डवेयर की दुकान से सस्ते में खरीदा जा सकता है; सामग्री की तालिकादेखें) और थोक घनत्व को मापने ।
  4. एक बाल्टी में बराबर मात्रा में रेत और मिट्टी को मापने और अच्छी तरह से मिश्रण । बॉक्स को भरने के लिए एक कीप का प्रयोग करें धीरे और समान रूप से ऊपर से २.५ cm के लिए, बॉक्स मिलाते हुए सब्सट्रेट के कारण के बिना बसने के लिए । सब्सट्रेट की इस मात्रा को मापने; यह लगभग १,२७२ सेमी3होना चाहिए ।
  5. रेत के आधे से इस खंड के थोक घनत्व गुणा प्रत्येक बॉक्स के लिए आवश्यक रेत के द्रव्यमान प्राप्त करने के लिए । मिट्टी के थोक घनत्व के साथ एक ही करने के लिए प्रत्येक बॉक्स के लिए आवश्यक मिट्टी के द्रव्यमान प्राप्त करते हैं ।
    नोट: क्षेत्र मिट्टी और रेत इस प्रयोग में इस्तेमाल के लिए, यह रेत के ९७६ ग्राम और मिट्टी के ७७४ ग्राम था, लेकिन इन मात्रा में इस्तेमाल किया मिट्टी के थोक घनत्व के आधार पर भिंन होगा ।
  6. rhizobox प्रति एक बड़े ज़िप-शीर्ष प्लास्टिक बैग लेबल, बैग में रेत और मिट्टी की उचित जनता का वजन, और अच्छी तरह से homogenize ।
  7. इस 1:1 मिट्टी का विश्लेषण और पोषक तत्व सामग्री और 15n (δ15एन) के प्राकृतिक बहुतायत के लिए सब्सट्रेट ।

7. उपचार और नियंत्रण पैच के लिए सब्सट्रेट तैयारी

  1. लेबल दो छोटे ज़िप-शीर्ष rhizobox प्रति प्लास्टिक बैग, उपचार पैच के लिए एक और नियंत्रण पैच के लिए एक । मिट्टी के 30 ग्राम वजन: रेत सब्सट्रेट प्रत्येक बड़े बैग से दो इसी छोटे बैग में (६.६ कदम) ।
  2. उपचार पैच के लिए एक 15N-लेबल नाइट्रोजन स्रोत के साथ सब्सट्रेट मिश्रण. इस के लिए, 15N के 1 g-लेबल संयंत्र अवशेषों या अंय n-स्रोत (राशि के रूप में वांछित समायोजित किया जा सकता है) प्रत्येक उपचार बैग में (छोटे ज़िप-टॉप बैग), और अच्छी तरह से मिश्रण बाहर वजन ।
    नोट: इस प्रयोग के लिए, 15N-लेबल तिपतिया घास और वेच अवशेषों का मिश्रण इस्तेमाल किया गया था । तिपतिया घास और वेच बीज vermiculite और रेत का एक 1:1 मिश्रण में लगाए गए थे, और ग्रीनहाउस शर्तों के तहत हो । पौधों दैनिक जल रहे थे और लंबे समय के 1/100 ताकत के साथ साप्ताहिक दो बार-एस्टन समाधान 15N-लेबल नाइट्रोजन स्रोतों युक्त13 । सभी aboveground बायोमास रोपण के बाद चार सप्ताह में काटा गया था, सूख, और जमीन के माध्यम से पारित करने के लिए एक 2 मिमी छलनी । यदि एक अलग पोषक तत्व चुना जाता है, विशेष रूप से यदि वह एलिमेंट मिट्टी में मोबाइल है, तो पायलट प्रयोगों के लिए परीक्षण करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है । पोषक तत्वों की धीमी गति से जारी रूपों या इस्तेमाल किया जा सकता है एक अलग rhizobox डिजाइन के लिए (उदाहरण के लिए, अलग डिब्बों10) यदि आवश्यक हो तो नमकीन पानी को प्रतिबंधित चुना जा सकता है ।

8. सब्सट्रेट के साथ Rhizobox लोड हो रहा है, और उपचार और नियंत्रण पैच की स्थापना

  1. प्रत्येक खाली rhizobox तौलना और बाद में उपयोग के लिए वजन रिकॉर्ड ।
  2. दो पैच स्पेसर डालें (चरण ३.२ देखें) एक rhizobox में जब तक पेंच उंहें आगे जाने से रोकता है । rhizobox (चित्रा 3) की ओर एक हल्के निशान के साथ नीचे बढ़त की गहराई को चिह्नित करें और स्पेसर्स निकालें ।
  3. एक स्टेम खोलने कि rhizobox खोलने के रूप में के रूप में संकीर्ण है के साथ एक कीप का उपयोग करना, चिह्नित गहराई को सब्सट्रेट के इसी बड़े थैले से rhizobox भरें । कीप को आगे-पीछे और समान रूप से आगे ले जाएं ताकि सब्सट्रेट समान रूप से भरता है और अधिमानी प्रवाह चैनल नहीं बना पाता है ।
  4. जब सब्सट्रेट स्तर चिह्नित गहराई तक पहुँच जाता है, स्पेसर्स बॉक्स के प्रत्येक पक्ष से 5 सेमी में वापस डाल दिया. सब्सट्रेट स्तर बॉक्स के ऊपर से लगभग 5 सेमी है जब तक बॉक्स को भरने जारी रखें (बैग में शेष सब्सट्रेट होना चाहिए).
  5. प्रत्येक स्पेसर के आसपास अच्छी तरह से गीला ।
    नोट: इस प्रयोग में, यह एक स्पेसर के बाहरी छोर और rhizobox के किनारे के बीच डाला ड्रिप उत्सर्जक के माध्यम से पानी की ५० मिलीलीटर पहुंचाने के द्वारा प्राप्त किया गया था, और दो स्पेसर्स के बीच समान रूप से पानी की ५० मिलीलीटर डालना । धीमी सिंचाई वर्दी गीला करने के लिए आवश्यक है ।
  6. , जबकि मिट्टी गीला है, पैच के लिए एक खाली गुहा छोड़ने स्पेसर्स निकालें ।
  7. टेप प्रत्येक rhizobox के बाहर करने के लिए एक पारदर्शिता फिल्म ( सामग्री की तालिकादेखें) । एक तरफ उपचार के रूप में चिह्नित करें और नियंत्रण के रूप में एक, और कीप का उपयोग कर उचित बैग से पैच भरें । स्थायी मार्कर का उपयोग पारदर्शिता पर प्रत्येक पैच की सीमाओं का पता लगाएँ.
  8. शेष सब्सट्रेट के साथ समान रूप से rhizobox भरें । पारदर्शिता पर सब्सट्रेट के शीर्ष ट्रेस ।
  9. शेष rhizoboxes के लिए दोहराएं । फसल के लिए सभी बैग बचाओ ।

9. ६०% जल धारण क्षमता तक जल भी

नोट: मिट्टी की नमी की यह मात्रा anoxic स्थितियों या मनोरथ वृद्धि के विकास को रोकने के दौरान सूखे तनाव का अनुभव करने से पौधों को रोकने के लिए पाई गई ।

  1. सब्सट्रेट14की जल-धारण क्षमता (WHC) को मापने ।
  2. प्रत्येक बॉक्स के आदर्श वजन की गणना; यहां खाली rhizobox के वजन की राशि के रूप में परिभाषित सब्सट्रेट के वजन के साथ संयुक्त ६०% जल धारण क्षमता में ।
  3. WHC गुणा (जल के ग्राम/०.६ द्वारा) को ६०% WHC पर सब्सट्रेट में आयोजित पानी के द्रव्यमान प्राप्त करने के लिए । शुष्क सब्सट्रेट और 15N स्रोत के द्रव्यमान के द्रव्यमान के लिए इस मास जोड़ें ।
  4. ऊपर प्राप्त संख्या के लिए प्रत्येक बॉक्स के खाली वजन जोड़ें ।
  5. एक बार वे भर गया है बक्से तौलना । (जी में) प्रत्येक बॉक्स के वजन घटाना अपने आदर्श वजन से इस बिंदु पर (में जी) चरण ९.२ में परिकलित । इस मात्रा के साथ पानी (एमएल) डे के (DI) पानी धीरे और समान रूप से ।
    नोट: यह कदम ड्रिप सिंचाई या हाथ से पानी का उपयोग किया जा सकता है । यदि हाथ से पानी, heterogenous मिट्टी की नमी की स्थिति और तरजीही प्रवाह चैनलों से बचने के लिए और अधिक जोड़ने से पहले पानी को पूरी तरह से चूना लगाने की अनुमति दें ।

10. बीज अंकुरण और प्रत्यारोपण

  1. यदि इंप्लांट किए गए नियंत्रणों का उपयोग करें, तो उन rhizoboxes को अलग सेट करें.
  2. सतह-5% NaOCl में 1 मिनट के लिए सरगर्मी से मक्का बीज निष्फल, तो DI पानी में अच्छी तरह से कुल्ला ।
    नोट: इस प्रयोग में, छह अलग मक्का पादी के बीज रूट प्लास्टिक में genotypic मतभेदों की जांच करने के क्रम में इस्तेमाल किया गया ।
  3. उन्हें एक गीला प्रयोगशाला ऊतक (जैसे, Kimwipe) पेट्री व्यंजन के अंदर और एक और नम ऊतक के साथ कवर पर रखकर निष्फल बीज अंकुरित । इसमें कोई भी खडा पानी नहीं होना चाहिए । 48 के लिए एक अंधेरी जगह में पेट्री व्यंजन प्लेस \ u201272 h जब तक radicle बस उभरने शुरू होता है ।
  4. एक संकीर्ण रंग का प्रयोग करें प्रत्येक rhizobox के केंद्र में २.५ सेमी गहराई के लिए एक छेद खोदना । छेद में एक अंकुरित बीज प्रत्यारोपण, यह सुनिश्चित करना है कि radicle सीधे नीचे उंमुख है ।
    नोट: यदि radicle या तो पैच की ओर angled है, जड़ विकास दर की तुलना पक्षपातपूर्ण होगा ।
  5. पारदर्शिता पर बीज के स्थान का पता लगाएं ।
  6. के साथ में बीज और पानी को कवर DI पानी की ५० मिलीलीटर ।

11. पौधों की वृद्धि

  1. 25 दिनों के लिए पौधों को विकसित (या के रूप में लंबे समय के रूप में वांछित), बढ़ती अवधि के दौरान ६०% WHC बनाए रखने । जड़ों अनुरेखण द्वारा जड़ विकास की निगरानी ।
  2. प्रत्येक बॉक्स वजन हर 3 u20124 दिन और पानी जब तक यह अपने आदर्श वजन के 5 जी के भीतर है । कटाई से पहले चार दिन rhizoboxes पानी बंद पैनलों की जुदाई की सुविधा के लिए । अक्सर हाथ से खरपतवार निकालें ताकि केवल ब्याज की जड़ें संयंत्र मौजूद हैं ।
  3. प्रत्येक ट्रेसिंग दिन के लिए स्पष्ट रूप से अलग रंग के साथ एक स्थायी मार्कर का उपयोग कर दिखाई जड़ों हर 3 \ u20124 दिन का पता लगाएं.
    नोट: यदि वांछित अलग व्यास मार्करों प्राथमिक और पार्श्व जड़ों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह मनोवाद की डिग्री के बाद से शुरू में ट्रेसिंग रूट के लिए मानदंड को परिभाषित करने के लिए उपयोगी हो सकता है शामिल है, विशेष रूप से यदि एकाधिक शोधकर्ताओं जड़ों पता लगाने हो जाएगा या अलग आदेश या व्यास की जड़ों अलग मार्करों के साथ प्रतिष्ठित किया जा करने के लिए कर रहे हैं । इस प्रयोग में, बॉक्स के केवल एक तरफ दिखाई जड़ों अनुरेखण की सटीकता दोनों पक्षों पर दिखाई जड़ों अनुरेखण द्वारा परीक्षण किया गया था और कुल रूट लंबाई की तुलना करने के लिए स्कैन transparencies पर मापा कुल रूट लंबाई धोने और स्कैनिंग जड़ों द्वारा मापा । का पता लगाया और स्कैन रूट लंबाई के बीच सहसंबंध महत्वपूर्ण था चाहे केवल वापस पारदर्शिता या दोनों transparencies इस्तेमाल किया गया था । इसलिए यह सिर्फ वापस पैनल पर दिखाई जड़ों का पता लगाने के लिए संभव है ।

12. संचयन गोली मारता है, और विश्लेषण के लिए जड़ और मिट्टी के नमूने प्राप्त करने

  1. पहले rhizobox फ्लैट रखना और सभी शिकंजा हटा दें ।
  2. फसल गोली के नमूने । आधार पर क्लिप गोली मारता है, DI पानी के साथ किसी भी मिट्टी कुल्ला, और ६० डिग्री सेल्सियस पर सूखी । एक मोर्टार और मूसल के साथ गोली मारता है एक 2 मिमी चलनी के माध्यम से पारित और आइसोटोप विश्लेषण के लिए टिन कैप्सूल में उपनमूना वजन (14 अनुभाग देखें) ।
  3. एक गाइड के रूप में पारदर्शिता का उपयोग करना, एक रेजर के साथ उपचार और नियंत्रण पैच के आसपास काट । एक चंमच या रंग का प्रयोग जड़ों और संबंधित उपचार या नियंत्रण बैग में पालन rhizosphere मिट्टी स्कूप ।
    नोट: जबकि कई तरीकों rhizosphere मिट्टी अलग करने के लिए मौजूद है, पौधे की जड़ें15के प्रभाव में मिट्टी, और rhizosphere एक ढाल माना जा सकता है बजाय एक सख्ती से delineated क्षेत्र16, इस विधि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मिट्टी की परिभाषा है कि17मिलाने के बाद पौधों की जड़ों का पालन करता है ।
  4. शेष जड़ों और मिट्टी तीसरे बैग में स्कूप ।
  5. सब्सट्रेट से जड़ों को अलग करने के लिए एक 2 मिमी छलनी के माध्यम से उपचार, नियंत्रण, और थोक नमूने पास, किसी भी दिखाई जड़ों या टुकड़े को हटाने > ठीक चिमटी के साथ लंबाई में 1 सेमी. इन नमूनों को तीन रूट और तीन सब्सट्रेट नमूनों की कुल के लिए एक दूसरे से अलग रखें ।

13. पता लगाने और सापेक्ष जड़ विकास दर के आकलन के सत्यापन

  1. स्कैन उपचार, नियंत्रण, और थोक नमूने और रूट लंबाई की गणना ।
    1. एक समय में एक नमूना के साथ कार्य करना, जड़ों को ध्यान से DI पानी के साथ कुल्ला किसी भी शेष सब्सट्रेट हटाने । नमूनों को स्पष्ट ट्रे में व्यवस्थित करें ताकि जड़ें ओवरलैप न हों ।
    2. रूट विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, WinRhizo) के साथ संगत स्कैनर का उपयोग कर नमूनों को स्कैन करें । सुनिश्चित करें कि सॉफ्टवेयर मज़बूती से जड़ों को छवि पृष्ठभूमि से अलग करने पर तुले हुए है ।
    3. सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए कुल जड़ लंबाई और ब्याज की व्यास कक्षाओं में जड़ लंबाई मापने (जैसे, < 0.2 mm, 0.2 \ u 20120.4 mm, 0.4 \ u 20120.8 mm, 0.8 \ u 20121.6 mm, > 1.6 mm) ।
  2. उपचार और नियंत्रण पैच के लिए और एक पूरे के रूप में प्रत्येक rhizobox के लिए रूट लंबाई घनत्व (रालोद) की गणना ।
    1. प्रत्येक पारदर्शिता पर पता लगाया क्षेत्र गुणा करके उपचार और नियंत्रण पैच की मात्रा की गणना (चरण ८.१) द्वारा ०.६३५ सेमी, बॉक्स की गहराई देखें । प्रत्येक पैच में कुल जड़ लंबाई का उपयोग कर उपचार और नियंत्रण पैच में रूट लंबाई घनत्व की गणना करने के लिए उन संस्करणों का उपयोग करें (चरण 13.1.3 देखें).
      Equation 1
    2. क्षेत्र की पारदर्शिता पर पता लगाया गुणा द्वारा प्रत्येक rhizobox में सब्सट्रेट की मात्रा की गणना (८.१ कदम देखें) द्वारा ०.६३५ सेमी. उपचार और नियंत्रण पैच के लिए के रूप में रालोद की गणना ।
      Equation 2
  3. स्कैन रूट सिस्टम और ट्रेस्ड छवियाँ तुलना करके रूट ट्रेसिंग विधि मान्य है ।
    1. प्रत्येक पारदर्शिता स्कैन और सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कुल जड़ लंबाई की गणना । विकास दर परिकलनों के लिए स्कैन की गई छवि सहेजें ।
    2. प्रत्येक बॉक्स के लिए उपचार, नियंत्रण, और थोक नमूनों की कुल जड़ लंबाई माप का योग (चरण 13.1.3 देखें) ।
    3. परीक्षण स्कैन और कुल रूट लंबाई का पता लगाया माप को देखने के लिए कि क्या सहसंबंध सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है ।
      नोट: यदि ऐसा है, तो पता लगाएँ विधि मान्य है, और प्रत्येक समय बिंदु पर सापेक्ष वृद्धि दर परिकलित कर सकते हैं । यदि नहीं, तो केवल स्कैन रूट सिस्टम डेटा रूट वृद्धि का एक सटीक संकेत प्रदान करता है । यह मामला हो सकता है अगर अनुरेखण पद्धति असंगत था या यदि जड़ें सभी पादी के लिए समान रूप से दिखाई नहीं थे, उदाहरण के लिए ।
  4. यदि पता लगाने विधि सत्यापित किया गया था, प्रत्येक rhizobox के लिए सापेक्ष रूट वृद्धि दर की गणना ।
    1. रूट विश्लेषण सॉफ्टवेयर हर समय बिंदु पर उपचार, नियंत्रण में कुल जड़ लंबाई, और थोक नमूनों को मापने के लिए चुना अनुरेखण रंग के बीच अंतर करने के लिए तुले हुए का प्रयोग करें । प्रत्येक समय बिंदु पर संचई कुल रूट लंबाई परिकलित करें ।
    2. प्रत्येक rhizobox के लिए सापेक्षिक मूल वृद्धि दर (RGRroot) की गणना करें और साथ ही प्रत्येक समय अंतराल के लिए उपचार और नियंत्रण पैच के लिए निम्नानुसार टी1-टी2 .
      Equation 3
      नोट: यहां l1 पैच में कुल रूट लंबाई (११.३ से संचयी राशि) टी1 दिनों में रोपाई के बाद (DAT) और एल2टी पर पैच में कुल रूट लंबाई है2 dat.

14. रूट, गोली मारो, और उपचार मिट्टी के नमूनों के बीच 15N विभाजन का विश्लेषण

  1. ६० ° c पर सूखी जड़ें, बायोमास वजन, और एक 2 मिमी छलनी के माध्यम से पारित पीसने ।
  2. ६० ° c पर उपचार मिट्टी के सूखे उपनमूना ।
  3. पैकेज जड़ों और टिन कैप्सूल में उपचार के रूप में शूटिंग के साथ ।
    नोट: आदर्श नमूना वजन प्रति कैप्सूल गोली मारता है, जड़ों के लिए अलग से गणना की जानी चाहिए, और मिट्टी की अनुमानित सी/n अनुपात के आधार पर सामग्री के विश्लेषण के लिए कुल N की लक्ष्य राशि प्राप्त करने के लिए । जहां अधिक जानकारी के लिए नमूने सबमिट करने के लिए है स्थिर आइसोटोप सुविधा से संपर्क करें । इस प्रयोग के लिए, नमूना तैयारी निर्देशों और नमूना वजन कैलक्यूलेटर यूसी डेविस स्थिर आइसोटोप सुविधा द्वारा प्रदान की गई18पीछा किया गया.
    चेतावनी: कैप्सूल में पैकेजिंग से पहले समान रूप से नमूनों को मिश्रण करने के लिए विशेष ध्यान रखें और प्रति नमूना कई कैप्सूल तैयार करें । यदि नमूने समान रूप से मिश्रित नहीं हैं, 15N की स्पष्ट वसूली मूल रूप से मौजूद राशि से अधिक हो सकती है ।
  4. कुल n, δ15, और प्रत्येक गोली मार, जड़, और उपचार मिट्टी के नमूने के 15n सामग्री का विश्लेषण करें ।
    नोट: इस प्रयोग में, संयंत्र नमूने एक PDZ यूरोपा ऐंका-GSL तात्विक विश्लेषक UC डेविस स्थिर आइसोटोप सुविधा (PDZ यूरोपा) पर एक स्पेक्ट्रोमीटर UCD 20-20 आइसोटोप अनुपात द्रव्यमान SIF करने के लिए इंटरफेस के साथ दहन के माध्यम से विश्लेषण किया गया. मिट्टी के नमूनों एक Elementar Vario एल घन तात्विक विश्लेषक के साथ विश्लेषण किया गया स्पेक्ट्रोमीटर UCD में एक PDZ यूरोपा 20-20 आइसोटोप अनुपात जन SIF करने के लिए इंटरफेस.
  5. 15N की राशि की गणना संयंत्र गोली मार और रूट नमूनों में लेबल से प्राप्त की ।
    1. सबसे पहले, प्रत्येक पूल, 15पी *में वायुमंडलीय 15n के अतिरिक्त 15n की राशि की गणना:
      Equation 4
      जहां 15P ब्याज के पूल के परमाणु% में 15N सामग्री है ।
    2. दूसरा, 15n की राशि की गणना वायुमंडलीय 15एन के अतिरिक्त में लेबल, 15L *:
      Equation 5
      जहां 15एल लेबल n स्रोत के परमाणु% में 15n सामग्री है ।
    3. तीसरा, प्रत्येक पूल में कुल n की राशि की गणना, एनपी:
      Equation 6
      जहां एमपी पूल के द्रव्यमान (जैसे, कुल सूखी गोली मार या जड़ बायोमास) और %p है कि पूल के N का प्रतिशत है ।
    4. अंत में, 14.5.1 \ u 201214.5.3 के परिणामों का उपयोग करें Ndff समीकरण19 में n की राशि की गणना करने के लिए लेबल से प्राप्त, nl:
      Equation 7
      नोट: Ndff समीकरण का उपयोग पौधों द्वारा पुनर्प्राप्त किए गए लेबल वाले स्रोत से N की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है । यह मानता है कि कोई isotopic भेदभाव n के दौरान संयंत्र द्वारा नहीं होता है और आम तौर पर n सूत्रों के लिए मांय है समृद्ध ~ 1 \ u201210%19।

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Representative Results

जड़ें तरजीही बॉक्स के पीछे के खिलाफ बढ़ी, के रूप में प्रत्याशित । बॉक्स के सामने पर 93-758 सेमी की तुलना में ४०० से १,९५६ सेमी तक की दूरी पर कुल का पता लगाया रूट लंबाई, बक्से के पीछे । Pairwise पियरसन सहसंबंध गुणांक स्कैन रूट लंबाई के बीच परिकलित किए गए थे और बॉक्स के सामने पर रूट लंबाई का पता लगाया, बॉक्स के पीछे, और आगे और पीछे का योग निर्धारित करें कि क्या tracing सही रूप से प्रतिबिंबित कुल रूट लंबाई (n = 23, के रूप में किया गया था एक बॉक्स में संयंत्र प्रयोग के दौरान मर गया) । स्कैन किए गए कुल रूट लंबाई काफी बॉक्स के पीछे (चित्रा5, पी = ०.००५९), बॉक्स के सामने (चित्रा 5B, पी = ०.०२२), और वापस और सामने का योग (चित्रा5C, पी =) पर पता लगाया रूट लंबाई के साथ संबंधित था ०.००३६). केवल बॉक्स के पीछे अनुरेखण इस प्रकार जड़ का पता लगाने के लिए आवश्यक समय halving जबकि रूट विकास का एक प्रतिनिधि उपाय देने के रूप में मान्य है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए, तथापि, कि अनुरेखण केवल 21.6-कुल रूट लंबाई का 54.6% कब्जा । जड़ों rhizobox की सतह के खिलाफ तरजीही विकसित करते हैं, विशेष रूप से ठीक पार्श्व जड़ों अनुरेखण के लिए दृश्यमान नहीं हो सकता है । अनुरेखण अच्छी तरह से समय के साथ रूट की लंबाई के सापेक्ष तुलना करने के लिए अनुकूल है, विशेष रूप से विकास में जल्दी है, लेकिन फसल और स्कैनिंग रूट सिस्टम बेहतर है अगर लक्ष्य को सही कुल जड़ लंबाई मात्रा है ।

Figure 5
चित्रा 5: traced और स्कैन रूट लंबाई डेटा के बीच सहसंबंध । एक) का पता लगाया रूट लंबाई काफी स्कैन रूट लंबाई जब केवल बॉक्स के सामने का पता लगाया गया था के साथ संबंधित था । ख) बॉक्स के पीछे, जहां जड़ों के बहुमत दिखाई दे रहे थे पर अनुरेखण जड़ों, बॉक्स के सामने अनुरेखण पर स्कैन रूट लंबाई के खिलाफ प्रतिगमन के आर2 मूल्य में सुधार; सहसंबंध फिर से महत्वपूर्ण था । ग) सबसे सटीक तरीका है, बॉक्स के दोनों किनारों पर जड़ों का पता लगाने के रूप में तीन तरीकों और स्कैन रूट लंबाई के साथ महत्वपूर्ण संबंध के उच्चतम R2 मूल्य से दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

समय के साथ रूट विकास दर बक्से के बीच समान थे, जब समय (चित्रा 6) के खिलाफ कुल जड़ लंबाई के प्राकृतिक प्रवेश की साजिश रचने लगातार ढलानों से दिखाया गया है । जबकि थोड़ी सी परिवर्तनशीलता की उंमीद की जानी है, लगातार वृद्धि दर संकेत मिलता है कि प्रयोगात्मक शर्तों सभी बक्से के लिए वर्दी थे । नाटकीय रूप से अलग ढलानों का संकेत होता है कि पौधों को अलग दरों पर बढ़ रहे थे, इस तरह के तापमान या नमी के रूप में चर में अंतर के लिए जांच करने की आवश्यकता का सुझाव ।

Figure 6
चित्रा 6: समय के साथ जड़ वृद्धि दर । rhizoboxes के बीच जड़ लंबाई बनाम समय के समान ढलानों संकेत मिलता है कि जड़ों बराबर दरों पर बढ़ी । गैर वर्दी ढलानों संकेत मिलता है कि प्रयोगात्मक स्थितियों rhizoboxes के बीच बदलती हो सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

15एन-लेबल कवर फसल अवशेषों युक्त पैच में सभी मक्का पादी proliferated की जड़ें । पैच प्रकार और निश्चित कारकों (n = 23) के रूप में जीनोटाइप के साथ दो-तरफा ANOVA पता चला कि जड़ लंबाई घनत्व से उपचार में उच्च था स्कैन रूट डेटा का उपयोग कर नियंत्रण पैच (चित्रा 7a, पी = ०.०१३) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पता लगाया रूट डेटा (चित्रा 7b, पी = ०.००५) । रालोद दोनों ही मामले में पादी के बीच काफी अलग नहीं थी.

Figure 7
चित्रा 7: जीनोटाइप और रूट डेटा प्रकार द्वारा रूट लंबाई घनत्व. a) स्कैन किए गए रूट डेटा से पता चला कि सभी पादी (A-F) proliferated में उपचार (T) पैच, और genotypic अंतर महत्वपूर्ण नहीं थे । ख) काटा और स्कैन रूट डेटा फली अवशेषों की महत्वपूर्ण प्रभाव की पुष्टि की है, लेकिन नहीं जीनोटाइप (ए-एफ), पैच में जड़ लंबाई घनत्व पर. पत्र A-F छह भिंन पादी का प्रतिनिधित्व करते है और त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि दर्शाते हैं । C: नियंत्रण; टी: उपचार । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

रूट व्यास जड़ समारोह और कारोबार के बारे में अनुमान बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ठीक जड़ों अधिक पार्श्व जड़ें होने की संभावना है कि तेजी से विकसित करने और संसाधन के आकर्षण के पैदा करना के जवाब में, जबकि बड़े मोटे जड़ों और अधिक लंबे समय तक रहने की संभावना है, धीमी-प्रतिक्रिया के सलए जड़ें । स्कैन रूट सिस्टम प्रत्येक व्यास वर्ग में जड़ों के अनुपात के लिए विश्लेषण किया गया: < 0.2 mm, 0.2-0.4 mm, 0.4-0.8 mm, 0.8-1.6 mm, and > 1.6 mm, और प्रत्येक आकार वर्ग genotypic मतभेदों के लिए परीक्षण किया गया था । उपचार पैच में और अधिक ठीक जड़ों के साथ पादी एक अधिक प्रभावी प्रसार प्रतिक्रिया का संकेत हो सकता है । एक निश्चित कारक (n = 23) के रूप में जीनोटाइप के साथ ANOVA एक तरह से पता चला कि पादी रूट की लंबाई में जड़ प्रणाली समग्र (चित्रा 8a), उपचार पैच (चित्रा 8b), या नियंत्रण पैच (चित्रा8c) के लिए प्रत्येक आकार वर्ग में अलग नहीं किया । जड़ों के बहुमत ठीक जड़ें थे (< 0.2 mm) ।

Figure 8
चित्रा 8: जीनोटाइप और स्थान से अलग व्यास वर्गों में जड़ों के अनुपात । एक) प्रत्येक rhizobox में (उपचार और नियंत्रण पैच को छोड़कर), जड़ों के बहुमत (व्यास में < 0.2 mm) ठीक किया गया । पादी प्रत्येक व्यास वर्ग में जड़ों के अनुपात में अलग नहीं किया । ख) उपचार पैच में, आकार वर्ग प्रति रूट लंबाई इसी तरह पादी भर में व्यास में वृद्धि के साथ कम हुई । ग) नियंत्रण पैच एक ही पैटर्न के द्वारा विशेषता थे । पत्र A-F छह भिंन पादी का प्रतिनिधित्व करते है और त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि दर्शाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

लेबल n गोली में पादी भर में जड़ नमूने से दो तरह ANOVA के अनुसार नमूना प्रकार और जीनोटाइप के रूप में तय कारकों (n = 23, चित्रा 9) के रूप में अधिक था, दिखा रहा है कि n के 77-81% उपचार पैच से लिया गया था जड़ों से translocated के दौरान गोली मारता है प्रयोग । एक तरफ़ ANOVA (n = 23) से पता चला कि δ15n रूट और गोली के नमूने जीनोटाइप द्वारा भिन्न नहीं थे ।

Figure 9
चित्रा 9: जड़ों और फसल में गोली मारता में फली अवशेषों से नाइट्रोजन प्राप्त की । सभी पादी 15n-लेबल फली अवशेषों से युक्त पैच से n लेने में समान रूप से प्रभावी थे. N के बहुमत पैच से लिया गया था जड़ों से translocated को गोली मारता है । पत्र A-F छह भिंन पादी का प्रतिनिधित्व करते है और त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि दर्शाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में वर्णित rhizoboxes के लिए रूट और rhizosphere विज्ञान में विभिंन प्रश्नों के उत्तर इस्तेमाल किया जा सकता है, और विविध का उपयोग करता है कहीं पाया है10,20,21,22,23 , 24 , 25. अंय शोधकर्ताओं rhizoboxes21,25,26, कुछ स्वचालित प्रणाली22,27का उपयोग कर के समय चूक छवियों पर कब्जा कर लिया है । इन तरीकों जड़ लंबाई और वास्तुकला के तरीके अनुरेखण के साथ संभव नहीं के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । Rhizoboxes भी सीटू संकरण (मछली) और सूक्ष्म autoradiography (मार्च)21,22, या स्थानिकी पर कब्जा करने के लिए स्पष्ट रूप में तकनीक के साथ माइक्रोबियल समुदायों कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है आरजीबी इमेजिंग24 या zymography11,30के साथ extracellular एंजाइम गतिविधि के साथ पानी और पोषक तत्वों के संसाधनों के पैटर्न । यहां प्रस्तुत rhizoboxes में पिछले डिजाइनों से अद्वितीय है कि वे अपेक्षाकृत बड़े हैं, यह व्यापक जड़ प्रणालियों के साथ प्रजातियों के अध्ययन के लिए संभव बनाने; एक साधारण एकल डिब्बे डिजाइन किया है; आसानी से उपलब्ध है, सस्ती सामग्री का उपयोग करें; और विशेष रूप से स्थानीयकृत पैच का अध्ययन करने के लिए डिजाइन किए हैं । इस rhizobox प्रोटोकॉल की बहुमुखी प्रतिभा यह जड़ प्लास्टिक और rhizosphere बातचीत में अंय अनुप्रयोगों की एक सीमा के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । अंय पोषक तत्वों के धब्बे में नाइट्रोजन की जगह सकता है । ऐसे फास्फोरस के रूप में मोबाइल पोषक तत्वों कम नमकीन पानी के अधीन है, की संभावना उंहें इस दृष्टिकोण के लिए एक अच्छा फिट बना । rhizoboxes भी अच्छी तरह से थोक और rhizosphere मिट्टी की तुलना के लिए अनुकूल हैं, जड़ प्रभाव के क्षेत्र के रूप में (एक लंबी rhizosphere15के लिए परिभाषा खड़े) अधिक स्पष्ट रूप से बर्तन अध्ययन में delineated और एक उस्तरा के साथ थोक मिट्टी से अलग हो सकता है फसल पर । इस विधि rhizosphere प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूल करने के तरीके प्रोटोकॉल का विस्तार, दोनों अजैव और बायोटिक23बातचीत के अध्ययन सहित की एक व्यापक नई रेंज खुल जाता है ।

rhizobox विधि यहां प्रस्तुत अच्छी तरह से जड़ विकास में पादी या प्रजातियों के बीच सापेक्ष मतभेदों को मापने के लिए अनुकूल है, जड़ लक्षण के बीच संबंधों निस्र्पक, और जड़ विकास पर मिट्टी विशेषताओं के प्रभाव की खोज . प्रोटोकॉल के कुछ कदम विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि वे जड़ विकास पर आय से अधिक प्रभाव के साथ कारकों को प्रभावित: मिट्टी की नमी, थोक घनत्व, और ढलान । समान रूप से पानी और भी बक्से भर में जड़ विकास पैटर्न1,31पर मिट्टी की नमी के प्रभाव को देखते हुए महत्वपूर्ण है । पायलट प्रयोगों से पता चला कि ड्रिप उत्सर्जक के माध्यम से वितरित पानी समान रूप से 24-48 केशिका कार्रवाई के कारण एच के बाद वितरित हो गया; हालांकि, एक दी गई सिंचाई अवधि के दौरान वितरित पानी की मात्रा में उत्सर्जन के बीच परिवर्तनशीलता बहुत अधिक था हमारी व्यवस्था का उपयोग कर इस विधि की सिफारिश करने के लिए । हाथ धीरे पानी और समान रूप से परीक्षण तकनीक का सबसे अच्छा था, लेकिन अंय सिंचाई के तरीके निश्चित रूप से संभव हैं । एक पहले से परिकलित वजन को पानी सुनिश्चित करता है कि सभी बक्से एक ही मिट्टी की नमी सामग्री को बनाए रखने, जड़ में परिवर्तनशीलता को रोकने पानी तनाव३२के कारण विकास । खाली rhizoboxes का वजन काफी भिंन हो सकते हैं, तो व्यक्तिगत बक्से के लिए आदर्श वजन की गणना महत्वपूर्ण है ।

नमी के साथ के रूप में, rhizobox भर सब्सट्रेट के भी थोक घनत्व की स्थापना के लिए रूट प्रसार प्रतिक्रियाओं को मापने के लिए महत्वपूर्ण है । जड़ें कम घने मिट्टी में अधिक बड़े पैमाने पर विकसित३३ और संकुचन तरजीही जल प्रवाह के लिए चैनल बना सकते हैं, आगे संसाधन वितरण और जड़ विकास पैटर्न३४को प्रभावित । सुखाने और sieving क्षेत्र मिट्टी, अच्छी तरह से रेत और मिट्टी का मिश्रण है, और आगे पीछे और धीरे आगे कीप चलती है और समान रूप से रूट विकास के लिए एक सजातीय मैट्रिक्स बनाने में मदद ।

इस प्रयोग के भीतर घटकों की एक संख्या ब्याज के अनुसंधान के सवालों के साथ ही मिट्टी के प्रकार और संयंत्र के अध्ययन के भीतर उपयोग प्रजातियों पर निर्भर करेगा । मिट्टी के लिए रेत का अनुपात अलग बनावट की मिट्टी के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि सब्सट्रेट wets समान रूप से झुरमुट के बिना । पायलट प्रयोगों से पता चला कि एक 1:1 (v/v) मिट्टी: रेत मिश्रण इस प्रयोग, एक बहुत ठीक रेतीली दोमट में इस्तेमाल मिट्टी के लिए 1:2 या 1:3 मिश्रण करने के लिए बेहतर था । rhizoboxes के आयामों और प्रयोग की अवधि के अनुसंधान प्रश्न, जड़ लक्षण, और ब्याज की प्रजातियों के पौधे के आधार पर समायोजित किया जा सकता है । मक्का एक अपेक्षाकृत तेजी से बढ़ रही संयंत्र प्रजातियों है; इसलिए हम बड़े rhizobox आयामों का चयन अंय rhizobox अध्ययन20,३५ की तुलना में मिट्टी की पर्याप्त मात्रा प्रदान करने के लिए है कि प्रयोग के लिए इष्टतम अवधि के लिए जारी रखने के लिए अनुमति देता है पौधों के रूप में तेजी से हो समय के साथ rootbound । अंत में, दिखाई और रूट विकास का पता लगाया करने के लिए सांख्यिकीय मॉडलों की फिटिंग प्रत्येक अध्ययन और ब्याज की प्रजातियों के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए, शायद पायलट प्रयोगों के साथ. दृश्य जड़ विकास के बजाय एक रैखिक मॉडल से एक संतृप्ति वक्र का पालन कर सकते हैं25,३६, और काटा जड़ों पर दिखाई के हीनता की ढलान संयंत्र प्रजातियों21से भिन्न होता है.

जड़ें गुरुत्वाकर्षण को आगे बढ़ाने और प्रकाश३७से बचने के लिए एक अंतर्निहित प्रवृत्ति है, लेकिन देखभाल कि gravitropism और प्रकाश परिहार रूट विकास डेटा पूर्वाग्रह नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए लिया जाना चाहिए । यदि ग्रीनहाउस बेंच थोड़ा झुका, उदाहरण के लिए कर रहे हैं, जड़ें नीचे ढाल के बजाय पोषक तत्वों पैच का जवाब हो जाना होगा । इसी तरह, ग्रीनहाउस में हल्की ढाल गोली वृद्धि और जड़ों में बदलाव के कारण एक तरफ तरजीही हो सकता है अगर rhizoboxes पूरी तरह से अंधेरा नहीं रखा जाता है । प्रकाश अभाव प्रोटोकॉल में प्रस्तुत मामलों घटना प्रकाश को कम करने का एक प्रभावी साधन हैं, लेकिन ऐसे एल्यूमीनियम पंनी में rhizoboxes लपेटन के रूप में अंय तरीकों से भी काम कर सकते हैं ।

गैर विनाशकारी rhizobox विधि यहां प्रस्तुत समय३८ पर सीटू में जड़ों की ट्रैकिंग की सुविधा और बिजली उपकरणों का एक बुनियादी काम ज्ञान के साथ एक स्नातक छात्र द्वारा लागू किया जा सकता है । जैसे, यह shovelomics6के रूप में विनाशकारी कटाई तरीकों पर लाभ प्रदान करता है, जो बेहतर परिपक्व रूट वास्तुकला का अध्ययन करने के लिए अनुकूल हैं, लेकिन समय पर एक ही रूट प्रणाली के दोहराया माप की अनुमति नहीं है, और एमआरआई या एक्स-रे की गणना टोमोग्राफी३९,४०, जो जड़ सब्सट्रेट बातचीत के उच्च गुणवत्ता इमेजिंग की अनुमति है, लेकिन महंगे उपकरणों की आवश्यकता है । हालांकि, यह सीमाओं के बिना नहीं है । rhizoboxes का निर्माण समय लेने वाली हो सकता है, और यह सुनिश्चित करना है कि नमी के रूप में कारकों, थोक घनत्व, ढलान, और प्रकाश के रूप में संभव के रूप में समान हैं, जैसा कि ऊपर वर्णित है, गैर तुच्छ है । फिर भी, पर्याप्त समय और विस्तार के लिए ध्यान दिया, rhizoboxes विश्वसनीय परिणाम देने और कई प्रयोगों के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को अपनी प्रतिक्रिया के लिए अनाम समीक्षक, साथ ही साथ J.C. काहिल और टैन rhizobox प्रोटोकॉल विकसित करने पर प्रारंभिक मार्गदर्शन के लिए बाऊ स्वीकार करना चाहूंगा । वित्त पोषण के लिए फाउंडेशन द्वारा प्रदान किया गया था खाद्य और कृषि अनुसंधान, अमेरिका के कृषि विभाग (USDA) राष्ट्रीय खाद्य और कृषि संस्थान, कृषि प्रयोग स्टेशन परियोजना CA-D-PLS-२३३२-H, A.G. के लिए और UC डेविस संयंत्र विभाग द्वारा J.S. के लिए एक फैलोशिप के माध्यम से विज्ञान

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.27 cm diameter PVC pipe JM Eagle 530048 305 cm per box, cut into lengths as specified in the protocol
PVC side elbows Lasco 315498 2 per box
PVC 90-degree elbows Charlotte PVC 02300 0600 4 per box
PVC T joints Charlotte PVC 02402 0600 4 per box
Extruded acrylic panes TAP Plastics N/A 2 per box, 0.64 cm thick x 40.5 cm wide x 61 cm long
HDPE spacers (sides) TAP Plastics N/A 2 per box, 0.64 cm thick x 2.5 cm wide x 57 cm long
HDPE spacers (bottom) TAP Plastics N/A 1 per box, 0.64 cm thick x 2.5 cm wide x 40.5 cm long
HDPE spacers (patch) TAP Plastics N/A 2 per box, 0.64 cm thick x 3.8 cm wide x 28 cm long
Polyester batting Fairfield #A-X90 2.5 cm x 40.5 cm strip per box
20-thread screws N/A N/A 3.2 cm long, 0.64 cm diameter
Washers N/A N/A 0.64 cm internal diameter
Hex nuts N/A N/A sized to fit the screws
Light deprivation fabric Americover, Inc. Bold 8WB26.5 1 piece 95 cm wide and 69 cm long per box
Sand Quikrete No. 1113
Field soil N/A N/A
Transparencies for tracing FXN FXNT1319100S One per side of the box to be traced

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References

  1. Hodge, A. Roots: The Acquisition of Water and Nutrients from the Heterogeneous Soil Environment. Progress in Botany 71. , 307-337 (2010).
  2. Grossman, J. D., Rice, K. J. Evolution of root plasticity responses to variation in soil nutrient distribution and concentration. Evolutionary Applications. 5 (8), 850-857 (2012).
  3. Melino, V. J., Fiene, G., Enju, A., Cai, J., Buchner, P., Heuer, S. Genetic diversity for root plasticity and nitrogen uptake in wheat seedlings. Functional plant biology. , Available from: http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201600101375 (2015).
  4. Zhang, H., Forde, B. G. An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrient-induced changes in root architecture. Science. 279 (5349), 407-409 (1998).
  5. Hodge, A., Stewart, J., Robinson, D., Griffiths, B. S., Fitter, A. H. Competition between roots and soil micro-organisms for nutrients from nitrogen-rich patches of varying complexity. Journal of Ecology. 88 (1), 150-164 (2000).
  6. Trachsel, S., Kaeppler, S. M., Brown, K. M., Lynch, J. P. Shovelomics: high throughput phenotyping of maize (Zea mays L.) root architecture in the field. Plant and Soil. 341 (1-2), 75-87 (2011).
  7. Rogers, E. D., Monaenkova, D., Mijar, M., Nori, A., Goldman, D. I., Benfey, P. N. X-ray computed tomography reveals the response of root system architecture to soil texture. Plant Physiology. , (2016).
  8. Groleau-Renaud, V., Plantureux, S., Guckert, A. Effect of mechanical constraint on nodal and seminal root system of maize plants. Comptes Rendus De L Academie Des Sciences Serie Iii-Sciences De La Vie-Life Sciences. 321 (1), 63-71 (1998).
  9. Lin, Y., Allen, H. E., Di Toro, D. M. Barley root hair growth and morphology in soil, sand, and water solution media and relationship with nickel toxicity. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (8), 2125-2133 (2016).
  10. Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
  11. Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
  12. Vollsnes, A. V., Futsaether, C. M., Bengough, A. G. Quantifying rhizosphere particle movement around mutant maize roots using time-lapse imaging and particle image velocimetry. European Journal of Soil Science. 61 (6), 926-939 (2010).
  13. Hewitt, E. J. Sand and Water Culture Methods Used in the Study of Plant Nutrition. , Commonwealth Bureau. London. (1966).
  14. Choudhary, M. I., Shalaby, A. A., Al-Omran, A. M. Water holding capacity and evaporation of calcareous soils as affected by four synthetic polymers. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 26 (13-14), 2205-2215 (1995).
  15. Bakker, P. A. H. M., Berendsen, R. L., Doornbos, R. F., Wintermans, P. C. A., Pieterse, C. M. J. The rhizosphere revisited: root microbiomics. Frontiers in Plant Science. 4, 2013 (2013).
  16. McNear, D. H. Jr The Rhizosphere - Roots, Soil, and Everything In Between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
  17. Ortas, I. Determination of the extent of rhizosphere soil. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 28 (19-20), 1767-1776 (1997).
  18. UC Davis Stable Isotope Facility. Carbon (13C) and Nitrogen (15N) Sample Preparation. , Available from: https://stableisotopefacility.ucdavis.edu/13cand15nsamplepreparation.html (2018).
  19. Barraclough, D. 15N isotope dilution techniques to study soil nitrogen transformations and plant uptake. Fertilizer research. 42 (1-3), 185-192 (1995).
  20. Belter, P. R., Cahill, J. F. Disentangling root system responses to neighbours: identification of novel root behavioural strategies. AoB PLANTS. 7, (2015).
  21. Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Functional Plant Biology. 39 (11), 891-904 (2012).
  22. Adu, M. O., Yawson, D. O., Bennett, M. J., Broadley, M. R., Dupuy, L. X., White, P. J. A scanner-based rhizobox system enabling the quantification of root system development and response of Brassica rapa seedlings to external P availability. Plant Root. 11, 16-32 (2017).
  23. Neumann, G., George, T. S., Plassard, C. Strategies and methods for studying the rhizosphere-the plant science toolbox. Plant and Soil. 321 (1-2), 431-456 (2009).
  24. Bodner, G., Alsalem, M., Nakhforoosh, A., Arnold, T., Leitner, D. RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (126), e56251-e56251 (2017).
  25. Kuchenbuch, R. O., Ingram, K. T. Image analysis for non-destructive and non-invasive quantification of root growth and soil water content in rhizotrons. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 165 (5), 573-581 (2002).
  26. Dresbøll, D. B., Thorup-Kristensen, K., McKenzie, B. M., Dupuy, L. X., Bengough, A. G. Timelapse scanning reveals spatial variation in tomato (Solanum lycopersicum L.) root elongation rates during partial waterlogging. Plant and Soil. 369 (1-2), 467-477 (2013).
  27. Wu, J., et al. RhizoChamber-Monitor: a robotic platform and software enabling characterization of root growth. Plant Methods. 14 (1), 44 (2018).
  28. Rogers, S. W., Moorman, T. B., Ong, S. K. Fluorescent In Situ Hybridization and Micro-autoradiography Applied to Ecophysiology in Soil. Soil Science Society of America Journal. 71 (2), 620-631 (2007).
  29. Eickhorst, T., Tippkötter, R. Detection of microorganisms in undisturbed soil by combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and micropedological methods. Soil Biology and Biochemistry. 40 (6), 1284-1293 (2008).
  30. Spohn, M., Kuzyakov, Y. Distribution of microbial- and root-derived phosphatase activities in the rhizosphere depending on P availability and C allocation - Coupling soil zymography with 14C imaging. Soil Biology and Biochemistry. 67, 106-113 (2013).
  31. Lv, G., Kang, Y., Li, L., Wan, S. Effect of irrigation methods on root development and profile soil water uptake in winter wheat. Irrigation Science. 28 (5), 387-398 (2010).
  32. Asseng, S., Ritchie, J. T., Smucker, A. J. M., Robertson, M. J. Root growth and water uptake during water deficit and recovering in wheat. Plant and Soil. 201 (2), 265-273 (1998).
  33. Hernandez-Ramirez, G., et al. Root Responses to Alterations in Macroporosity and Penetrability in a Silt Loam Soil. Soil Science Society of America Journal. 78 (4), 1392-1403 (2014).
  34. Zhang, Y. L., Wang, Y. S. Soil enzyme activities with greenhouse subsurface irrigation. Pedosphere. 16 (4), 512-518 (2006).
  35. Robinson, D., Hodge, A., Griffiths, B. S., Fitter, A. H. Plant root proliferation in nitrogen-rich patches confers competitive advantage. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 266 (1418), 431-435 (1999).
  36. Lobet, G., Draye, X. Novel scanning procedure enabling the vectorization of entire rhizotron-grown root systems. Plant Methods. 9, 1 (2013).
  37. Swarup, R., Wells, D. M., Bennett, M. J. Root Gravitropism. Plant Roots: The Hidden Half. , (2013).
  38. Smit, A. L., Bengough, A. G., Engels, C., van Noordwijk, M., Pellerin, S., van de Geijn, S. C. Root Methods: A Handbook. , Springer Science & Business Media. (2000).
  39. van Dusschoten, D., et al. Quantitative 3D Analysis of Plant Roots Growing in Soil Using Magnetic Resonance Imaging1[OPEN]. Plant Physiology. 170 (3), 1176-1188 (2016).
  40. Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 17 (2015).

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पर्यावरण विज्ञान अंक १४० आइसोटोप लेबलिंग नाइट्रोजन पोषक तत्वों की अधिकता प्लास्टिक प्रसार rhizobox rhizosphere जड़
एक अनुकूलित Rhizobox प्रोटोकॉल मूल विकास और जवाबदेही स्थानीयकृत पोषक तत्वों को कल्पना करने के लिए
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Schmidt, J. E., Lowry, C., Gaudin, A. C. M. An Optimized Rhizobox Protocol to Visualize Root Growth and Responsiveness to Localized Nutrients. J. Vis. Exp. (140), e58674, doi:10.3791/58674 (2018).

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