Summary
Visualizar e medir raiz crescimento em situ são extremamente desafiador. Apresentamos um método rhizobox personalizável para controlar o desenvolvimento radicular e proliferação ao longo do tempo em resposta ao enriquecimento de nutrientes. Este método é usado para analisar diferenças genotípicas milho na plasticidade da raiz em resposta a uma fonte de nitrogênio orgânico.
Abstract
As raízes são notoriamente difíceis de estudar. O solo é tanto uma barreira visual e mecânica, tornando difícil rastrear raízes em situ sem colheita destrutiva ou equipamento caro. Apresentamos um método de rhizobox acessível e personalizável que permite a visualização não-destrutiva de crescimento das raízes ao longo do tempo e é particularmente bem adaptado para estudar a plasticidade da raiz em resposta a patches de recurso localizado. O método foi validado pela avaliação milho variação genotípica em respostas de plasticidade para patches contendo resíduo vegetal N-rotulado de 15. Métodos são descritos para obter medições do desenvolvimento representante ao longo do tempo, medir a densidade de comprimento raiz em patches contendo recursos e controle, calcular taxas de crescimento de raiz e determinar recuperação 15N pela planta raízes e brotos. Vantagens, limitações e potenciais aplicações futuras do método também são discutidas. Embora deve ter cuidado para garantir que as condições experimentais não viés dados de crescimento de raiz, o protocolo de rhizobox apresentado aqui produz resultados confiáveis se realizado com suficiente atenção aos detalhes.
Introduction
Embora muitas vezes negligenciado em comparação com suas contrapartes na superfície, as raízes desempenham um papel fundamental na aquisição de nutrientes de planta. Dado o custo do carbono substancial de manutenção e construção de raiz, as plantas desenvolveram mecanismos para desenvolver raízes somente onde forrageamento vale a pena o investimento. Sistemas da raiz pode, portanto, eficientemente e dinamicamente a mina patches de recurso por proliferando em hotspots, estrogenos taxas de absorção e rapidamente se nutrientes para o floema por mais transporte1. Respostas de plasticidade podem variar amplamente entre planta espécies ou genótipos2,3 e dependendo da forma química do nutriente envolvido4,5. Variação na plasticidade de raiz deve ser explorada ainda mais, como compreensão respostas raiz complexa de recursos heterogêneos solo poderiam informar reprodução e estratégias de gestão para aumentar a eficiência de utilização de nutrientes na agricultura.
Apesar de sua necessidade e relevância para os sistemas de planta de entendimento, Visualizar e quantificar a plasticidade de raiz em escalas relevantes coloca desafios técnicos. Escavando a coroa da raiz do solo (6de "shovelomics") é um método comum, mas raizes finas exploram pequenos poros entre agregados de solo, e escavação, inevitavelmente, leva a algum grau de perda dessas raízes frágeis. Além disso, colheita destrutiva torna impossível acompanhar as mudanças em um sistema de raiz ao longo do tempo. In situ métodos de imagem como tomografia computadorizada de radiografia computadorizada permitem a visualização directa dos recursos de solo e raízes em alta resolução espacial7, mas são caros e requerem o equipamento especializado. Hidropônicas experiências evitar restrições associadas com a extração de raízes do solo, mas arquitetura e morfologia da raiz diferem em meios aquosos em comparação com as restrições mecânicas e complexidade biofísica dos solos8,9. Finalmente, funções e processos de rizosfera não podem ser integradas com plasticidade do desenvolvimento nestes meios artificiais.
Apresentamos um protocolo para a construção e uso de rhizoboxes (recipientes retangulares estreitas, clear-face) como um método de baixo custo, personalizável para caracterizar o crescimento da raiz no solo ao longo do tempo. Quadros especialmente projetados incentivam as raizes cresçam preferencialmente contra o painel traseiro devido ao geotropismo, aumentando a precisão das medições de comprimento de raiz. Rhizoboxes são comumente usados para estudar o crescimento das raízes e rizosfera interações10,11,12, mas o método apresentado aqui oferece uma vantagem na simplicidade, com seu design único compartimento e barato materiais e é projetado para estudar respostas de raiz para nutrientes localizadas. No entanto, o método também pode ser adaptado para estudar uma gama de outros processos de raiz e rizosfera como concorrência intra/interspecies, distribuição espacial de compostos químicos, micróbios ou atividade enzimática. Aqui, vamos investigar diferenças genotípicas entre híbridos de milho em resposta a patches de 15N-rotulado vegetal resíduo e destaque resultados representativos para validar o método de rhizobox.
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Protocol
1. preparação da frente e traseiros painéis e espaçadores
- Prepare os painéis dianteiros e traseiros.
- Cortados dois pedaços de acrílico grosso de clara 0,635 cm a 40,5 cm de largura por 61 cm longo por caixa ou comprar peças pré-cortadas (ver Tabela de materiais).
- Usando uma broca projetada para acrílico, furos 0,635 cm de diâmetro de 1,3 cm entre as bordas de lado no 2.5, 19, 38 e 53,3 cm do topo. Furos de 1,3 cm da borda inferior a 2,5 e 20,3 cm 38 do lado esquerdo (Figura 1).
Nota: É mais eficiente usar uma furadeira para uma pilha de seis a dez folhas de cada vez, mas uma furadeira de mão também pode ser usada. - Remova quaisquer revestimentos protetores de acrílico e limpar delicadamente os dois painéis antes de montar as caixas.
Figura 1: Layout de buracos perfurados. Furos são perfurado 1,3 cm entre as bordas de lado no 2.5, 19, 38 e 53,3 cm do topo e 1,3 cm da borda inferior no 2.5, 20,3 e 38 cm da margem esquerda. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Prepare os espaçadores lateral e inferior.
- Corte três espaçadores por caixa de polietileno de alta densidade (PEAD) ou compra dois espaçadores de corte lateral (0,635 cm de espessura, 2,5 cm de largura, 57 cm de comprimento) e um corte fundo do espaçador (0,635 cm de espessura, 2,5 cm de largura, 40,5 cm de comprimento). Consulte a tabela de materiais.
- Alinhe os espaçadores entre os painéis frontais e traseiras ao longo dos lados e fundo da caixa. Usando uma broca de mão ou furadeira, broca através dos orifícios existentes na frente e novamente para que os furos atravessam todas as três camadas corretamente.
- Segure as camadas Coloque usando braçadeiras ou através da instalação de uma combinação de parafusos, porcas e arruelas em cada recém furo (ver passo 3.1).
2. instalação de uma tira de poliéster rebatidas na parte inferior da caixa
Nota: Isto irá impedir solo e água vazando através de articulações entre os espaçadores.
- Cortar o poliéster rebatidas em 2,5 cm de largura por 40,5 cm de comprimento tiras (consulte a Tabela de materiais).
- Com painel traseiro mentindo plana e os espaçadores em cima dele, colocar a batedura diretamente acima do espaçador de fundo e segure-o no lugar com o painel superior (Figura 2).
Figura 2: montado rhizobox com rebatidas. Uma estreita faixa de rebatidas na parte inferior da rhizobox impede a solo e areia de vazar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. montagem da Rhizoboxes
- Montar o rhizoboxes usando parafusos de rosca-20 (3,2 cm de comprimento por 0,635 cm de diâmetro), arruelas (0,635 cm de diâmetro interno) e porcas sextavadas (tamanho para encaixar os parafusos, ver Tabela de materiais.
- Aperte cada parafuso através de uma máquina de lavar, painel frontal, espaçador, painel traseiro, arruela e porca sextavada. Verifique se que os parafusos estão muito apertados; se a caixa é montada livremente, solo vai derramar para fora através de aberturas entre os painéis e os espaçadores de lado.
Nota: Acrílico é facilmente arranhado, e os arranhões podem interferir com as medições de raiz, para segurar as caixas montadas com cuidado. Evite empilhar caixas a menos material protetor é colocado entre eles. - Prepare dois espaçadores de remendo (espaçadores que serão usados para criar os patches de tratamento e controle) por caixa. Cortar os espaçadores de polietileno de alta densidade (PEAD) folhas ou comprá-los pré-cortado (0,635 cm de espessura, 3,8 cm de largura, 28 cm de comprimento; ver Tabela de materiais). Faça um furo 0,635 cm de diâmetro em cada espaçador, 2cm do topo ao longo da linha mediana (Figura 3).
Figura 3: Patch espaçadores. Parafusos inseridos através as tiras de centro de HDPE mantém-los de cair no caixa. O rhizobox é preenchido com o solo em torno os espaçadores, o solo está molhado, e os espaçadores são removidos a fim de deixar vazios patches de tratamento e controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Prenda um parafuso por cada buraco com uma porca, de modo a que o espaçador pode ser inserido parcialmente o rhizobox até o parafuso impede-o de ir mais longe (Figura 3).
Nota: Quando o solo está molhado ao redor os espaçadores e os espaçadores são removidos, permanecerão dois espaços vazios que pode ser preenchido com os substratos adequados para o remendo de tratamento contendo nitrogênio e patch de controle.
4. construção do PVC quadros para apoiar a Rhizoboxes em ângulo
Nota: Quando a caixa é colocada em um ângulo, geotropismo incentivará as raízes a crescer contra o painel traseiro para que todas as raízes são visíveis para rastreamento. Cloreto de polivinila (PVC) dimensões na Figura 4 resultado em um quadro que mantém a rhizobox em um ângulo de aproximadamente 55 ° para o banco.
- Corte 13 peças de 1,3 cm de diâmetro do PVC por caixa: 2 × 44 centímetros de comprimentos, 3 comprimentos de cm × 42, 2 × 36,3 cm comprimentos, 2 × 25,4 centímetros de comprimentos e 4 × 3,8 centímetros de comprimentos (consulte Tabela de materiais).
Nota: Uma serra é altamente recomendada para eficiência e até mesmo cortes. - Use os cotovelos de forma-2 × 4, 2 × 3 vias cotovelos e 4 T-junções (ver Tabela de materiais) para montar a caixa, como mostrado na Figura 4.
Nota: Os óculos devem ser estáveis sem colagem adicional, mas cola de PVC pode ser usada se necessário.
Figura 4: quadro de apoio rhizoboxes. O frame de pouco peso é construído de PVC cortado aos comprimentos especificados e conectado usando os tipos comuns indicados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. costura capas protetoras para refletir a luz e o calor
Nota: Raízes evita a luz, então estes casos eliminar a luz para se certificar de que observaram respostas de plasticidade de raiz são conduzidas pela fonte de nutrientes nas manchas e não por evasão de luz. Tecido leve de privação também reduz a temperatura no interior da rhizoboxes, ajudando a evitar o stress de calor.
- Corte o tecido de privação de luz (material especializado que é branco de um lado e preto do outro) em pedaços aproximadamente 95 cm de largura e 69 cm de comprimento (veja Tabela de materiais). Uma parte por caixa é necessária.
- Dobre cada pedaço ao meio ao longo da borda longa para formar uma manga de 47,5 cm x 69 cm. Usando uma agulha de costura máquina projetada para o denim, estofando pesados thread e uma fenda estreita, costure ao longo da parte inferior e ¾ do caminho até o lado de cada manga. Pino de topo cantos juntamente com um alfinete de segurança.
6. preparação do solo de 1:1 (V/V): substrato para encher o Rhizoboxes de areia
- Colete aproximadamente 1.000 cm3 de solo de campo (a partir do site de interesse) por caixa. Secar o solo até peso constante em bandejas rasas a 60 ° C.
Nota: O solo para este experimento foi coletado imediatamente após a colheita em um campo de milho organicamente gerenciado de 0\u201210 cm de profundidade. - Triture o solo com um almofariz e um pilão que passe por uma peneira de 2 mm. Medir a densidade do solo por pesagem, um volume conhecido de solo.
- Obter areia (como jogar areia, que pode ser comprada barata de uma loja de ferragem; consulte Tabela de materiais) e medir a densidade a granel.
- Medir volumes iguais de areia e solo em um balde e misture bem. Use um funil para encher a caixa lentamente e uniformemente a 2,5 cm do topo, sem tremer a caixa para fazer com que o substrato resolver. Medir este volume de substrato; deve ser aproximadamente 1.272 cm3.
- Multiplique a densidade de areia por metade deste volume para obter a massa de areia necessária para cada caixa. Faça o mesmo com a densidade do solo para obter a massa de solo necessária para cada caixa.
Nota: Para o solo de campo e areia utilizada neste experimento, foi 976 g de areia e 774 g de solo, mas estes valores variam de acordo com a densidade do solo usado. - Rotular um grande zip-top saco plástico por rhizobox, pesar as massas adequadas de solo e areia dentro do saco e homogeneizar completamente.
- Analisar este solo de 1:1- e substrato para o teor de nutrientes e a abundância natural de 15N (δ15N).
7. preparadores para o tratamento e controle de Patches
- Rotule pequenos sacos zip-top de plástico de dois por rhizobox, um para o patch de tratamento e uma para o patch de controle. Pesa 30 g de solo: substrato de cada saco grande (etapa 6.6) de areia para os dois sacos pequenos correspondentes.
- Misture o substrato com uma fonte de nitrogênio N-rotulado de 15para o patch de tratamento. Por isso, pesar 1 g de resíduo de 15N-rotulado planta ou outra fonte de N (a quantidade pode ser ajustada como desejado) em cada saco de tratamento (pequeno saco zip-top) e misture bem.
Nota: Para este experimento, foi usada uma mistura de 15N-rotulado trevo e ervilhaca resíduo. Sementes de trevo e ervilhaca foram plantadas em uma mistura 1:1 de vermiculita e areia e cultivadas sob condições de estufa. As plantas foram regada diariamente com água desionizada e duas vezes por semana com força de 1/100 de Long Ashton solução13 contendo 15fontes de nitrogênio N-rotulados. Todos biomassa acima do solo foi colhida em quatro semanas após o plantio, seco e moído para passar por uma peneira de 2 mm. Se for escolhido um nutriente diferente, especialmente se esse elemento é móvel no solo, experiências piloto para testar a lixiviação são incentivadas. Formas de liberação lenta de nutrientes podem ser usadas ou um design diferente rhizobox poderia ser escolhido para restringir a lixiviação (por exemplo, por compartimentos separados10) se necessário.
8. Rhizobox com substrato e estabelecendo o tratamento e o controle de carregamento Patches
- Pesar cada rhizobox vazio e registar os pesos para uso posterior.
- Inserir dois espaçadores de remendo (consulte a etapa 3.2) em um rhizobox até o parafuso os impede de ir mais longe. Marque a profundidade da borda inferior com uma marca de luz no lado do rhizobox (Figura 3) e retire os espaçadores.
- Usando um funil com uma abertura de tronco que é tão estreita como a abertura de rhizobox, preencher o rhizobox do saco grande correspondente de substrato para a profundidade de marcado. Mover o funil e para trás lentamente e uniformemente para que o substrato preenche uniformemente e não criar canais preferenciais de fluxo.
- Quando o nível de substrato atinge a profundidade marcada, coloque os espaçadores em 5 cm de cada lado da caixa. Continue enchendo a caixa até o nível de substrato é de aproximadamente 5 cm da parte superior da caixa (deve haver substrato restante no saco).
- Molhar cuidadosamente ao redor cada espaçador.
Nota: Neste experimento, isto foi conseguido através da entrega de 50 mL de água através de emissores de gotejamento inserido entre a borda externa de cada espaçador e do lado do rhizobox e derramando a 50 mL de água uniformemente entre os dois espaçadores. Irrigação lenta é necessária para molhamento uniforme. - Retire os espaçadores, enquanto que o solo está molhado, deixando uma cavidade vazia para os patches.
- Gravar um filme de transparência para o exterior de cada rhizobox (ver Tabela de materiais). Marcar um lado como tratamento e como controle e preencher os patches os sacos apropriados usando o funil. Traçar os limites de cada patch na transparência usando marcador permanente.
- Preencha o rhizobox uniformemente com o restante do substrato. Rastrear o topo do substrato sobre a transparência.
- Repita para o restante rhizoboxes. Salve todas as malas para a colheita.
9. mesmo molhando para 60% a capacidade de retenção de água
Nota: Esta quantidade de umidade do solo foi encontrada para impedir que as plantas estressado seca, evitando o desenvolvimento de condições anóxica ou crescimento das algas.
- Medir a capacidade de retenção de água (CRA) do substrato14.
- Calcular o peso ideal de cada caixa; aqui definido como a soma do peso do rhizobox vazio, combinado com o peso do substrato com 60% de capacidade de retenção de água.
- Multiplique a CRA (gramas de água / gramas de substrato seco) por 0,6 para obter a massa de água realizada no substrato em 60% CRA. Adicione esta massa para a massa de substrato seco e a massa da fonte 15N.
- Adicione o peso vazio de cada caixa para o número obtido acima.
- Pese as caixas, uma vez que eles foram preenchidos. Subtrai o peso de cada caixa (g) nesse ponto de seu peso ideal (em g) calculado na etapa 9.2. Água com esse volume (em mL) de eliminação ionizado (DI) água lentamente e uniformemente.
Nota: Este passo pode ser feito usando a irrigação por gotejamento ou molhar com a mão. Se molhar com a mão, deixe a água infiltrar completamente antes de adicionar mais para evitar condições de umidade do solo heterogêneo e canais preferenciais de fluxo.
10. sementes, germinação e transplante de órgãos
- Se usando controles unplanted, anular esses rhizoboxes.
- Superfície-esterilize as sementes de milho por agitação por 1 min em 5% NaOCl e, em seguida, enxaguar cuidadosamente em água DI.
Nota: Neste experimento, as sementes de seis diferentes genótipos de milho foram usadas para investigar diferenças genotípicas em plasticidade de raiz. - Germinar sementes esterilizadas colocando-os em um tecido de laboratório molhado (por exemplo, Kimwipe) no interior de placas de Petri e cobrindo com outro tecido úmido. Não deve haver qualquer água parada. Pratos de Petri de lugar em lugar escuro para 48\u201272 h até a radícula só começa a emergir.
- Use uma espátula estreita para escavar um furo a 2,5 cm de profundidade no centro de cada rhizobox. Transplantar uma semente germinada dentro do buraco, garantindo que a radícula é orientada diretamente para baixo.
Nota: Se a radícula é inclinada em direção de qualquer remendo, a comparação das taxas de crescimento de raiz vai ser tendencioso. - Marque a localização da semente na transparência.
- Cobrir a semente e a água com até 50 mL de água Desionizada.
11. plantas crescimento
- Cultivar plantas para 25 dias (ou contanto que desejado), mantendo 60% CRA durante todo o período de crescimento. Monitorar o crescimento da raiz ao traçar as raízes.
- Cada caixa pesa todos os dias de 3\u20124 e água até que fica a cerca de 5 g do seu peso ideal. Pare de regar o rhizoboxes quatro dias antes da colheita, para facilitar a separação dos painéis. Remova as ervas daninhas à mão com frequência para que apenas as raízes das plantas de interesse estão presentes.
- Rastrear as raízes visíveis todos os dias de 3\u20124 usando um marcador permanente com cores claramente distinguíveis por cada dia de rastreamento.
Nota: Os marcadores de diâmetro diferente podem ser usados para raízes principais e laterais, se desejado. Pode ser útil definir critérios para raiz rastreamento desde o início, desde um grau de subjetividade está envolvido, especialmente se vários pesquisadores será raízes de rastreamento ou raízes de diferentes ordens ou diâmetro para que sejam distinguidos com marcadores diferentes. Neste experimento, a precisão das raízes visíveis em apenas um lado da caixa de rastreamento foi testada traçando raízes visíveis em ambos os lados e comparar o comprimento total de raiz medido sobre as transparências digitalizadas para comprimento de raiz total, medido por lavagem e varredura de raízes. A correlação entre o comprimento de raiz rastreado e digitalizado foi significativa independentemente se só a transparência volta ou ambos transparências foram usadas. Portanto, é possível traçar apenas raízes visíveis no painel traseiro.
12. colheita de brotos e obtenção de raiz e amostras de solo para análise
- Coloque o rhizobox primeiro plano e retire todos os parafusos.
- Colheita das amostras de atirar. Clip de rebentos na base, enxaguar qualquer tipo de solo com água e seque a 60 ° C. Moagem atira com um almofariz e um pilão que passe por uma peneira de 2 mm e pesa subamostras para cápsulas de estanho para análise isotópica (ver seção 14).
- Usando a transparência como um guia, cortou os patches de tratamento e controle com uma navalha. Use uma colher ou espátula para colher as raízes e o solo rizosfera aderente dentro do respectivo saco de tratamento ou controle.
Nota: Embora muitos métodos existem para solo rizosfera separado, o solo sob a influência de planta raízes15e rizosfera pode ser considerada um gradiente ao invés de uma zona estritamente delineadas16, este método segue o amplamente utilizado definição de solo que adere para plantar raízes após agitação17. - Acrescente o restante raízes e solo o terceiro saco.
- Passar o tratamento, controle e do volume de amostras através de uma peneira de 2 mm para separar as raízes do substrato, removendo qualquer raízes visíveis ou fragmentos > 1 cm de comprimento com pinça fina. Mantenha estas amostras separadas um do outro para um total de três raiz e três amostras de substrato.
13. validação de traçados e estimativa das taxas de crescimento relativo de raiz
- Digitalizar o tratamento, controle e as amostras a granel e calcular o comprimento da raiz.
- Trabalhando com uma amostra de cada vez, enxague raízes cuidadosamente com água para remover qualquer substrato restante. Organize as amostras em uma bandeja de clara para que as raízes não se sobrepõem.
- Varredura de amostras usando um scanner compatível com software de análise de raiz (por exemplo, WinRhizo). Certifique-se de que o software está calibrado para confiantemente distinguir as raízes do plano de fundo da imagem.
- Use o software para medir o comprimento total da raiz e o comprimento de raiz nas classes de interesse (por exemplo, < 0.2 mm, 0.2\u20120.4 mm, 0.4\u20120.8 mm, 0.8\u20121.6 mm, > 1,6 mm) de diâmetro.
- Calcule a raiz comprimento densidade (RLD) para controle e tratamento de manchas e para cada rhizobox como um todo.
- Calcular o volume de tratamento e controle de patches multiplicando a área traçada em cada transparência (ver passo 8.1) por 0,635 cm, a profundidade da caixa. Usar esses volumes para calcular a densidade de comprimento raiz no tratamento e controle de patches usando o comprimento total de raiz em cada patch (consulte a etapa 13.1.3).
- Calcular o volume de substrato em cada rhizobox multiplicando a área traçada na transparência (ver passo 8.1) por 0,635 cm. Calculate RLD quanto os patches de tratamento e controle.
- Calcular o volume de tratamento e controle de patches multiplicando a área traçada em cada transparência (ver passo 8.1) por 0,635 cm, a profundidade da caixa. Usar esses volumes para calcular a densidade de comprimento raiz no tratamento e controle de patches usando o comprimento total de raiz em cada patch (consulte a etapa 13.1.3).
- Valide a raiz método de rastreamento, comparando sistemas digitalizados de raiz e cujas imagens.
- Varredura de cada transparência e calcular o comprimento total de raiz, usando o software. Salve a imagem digitalizada para o crescimento de cálculos da taxa.
- Resumir as medições de comprimento de raiz total de tratamento, controle e a maioria de amostras para cada caixa (consulte a etapa 13.1.3).
- Teste as medições digitalizadas e rastreadas de comprimento raiz total, para ver se a correlação é estatisticamente significativa.
Nota: Em caso afirmativo, o método de rastreamento é validado, e taxas de crescimento relativo podem ser calculadas em cada ponto de tempo. Se não, apenas os dados digitalizados de raiz de sistema fornecem uma indicação precisa do crescimento da raiz. Este poderia ser o caso se a metodologia de rastreamento foi inconsistente ou se as raízes não foram igualmente visíveis para todos os genótipos, por exemplo.
- Se o método de rastreamento foi validado, calcule taxas de crescimento relativo de raiz para cada rhizobox.
- Use o software de análise de raiz calibrado para distinguir entre as cores de rastreamento escolhido para medir o comprimento total da raiz no tratamento, controle e a maioria de amostras em cada ponto de tempo. Calcule o comprimento de raiz total cumulativo em cada ponto de tempo.
- Calcule taxas de crescimento de raiz relativa (RGRraiz) para cada rhizobox, bem como para o tratamento e controle de patches para cada intervalo do tempo t1-t2 , como segue.
Nota: Aqui L1 é o comprimento total de raiz no patch (soma cumulativa de 11,3) em dias de1 t após o transplantio (DAT) e L2é o comprimento total de raiz no patch em t2 DAT.
14. análise de 15N particionamento entre raiz, atirar e tratamento de amostras de solo
- Raízes secas a 60 ° C, pesar a biomassa e moer para passar por uma peneira de 2 mm.
- Secas subamostras de solo de tratamento a 60 ° C.
- Pacote de raízes e tratamento para cápsulas de estanho como com os brotos.
Nota: Peso Ideal da amostra por cápsula deve ser calculado separadamente para brotos, raízes e solo baseada na relação C/N estimada do material para atingir a quantia de N total para análise. Entre em contato com o isótopo estável onde as amostras devem ser enviadas para obter mais informações. Para este experimento, as instruções de preparação de amostra e calculadora de peso de amostra fornecidos pela UC Davis estável Isotope facilidade foram seguidos18.
Atenção: Tenha especial cuidado ao misturar amostras uniformemente antes da embalagem em cápsulas e preparar várias cápsulas por amostra. Se as amostras não estão uniformemente misturadas, recuperação aparente de 15N pode exceder a quantidade originalmente presente. - Analise o N total, δ15 e 15N conteúdo de cada sessão, raiz e amostra de solo de tratamento.
Nota: Neste experimento, as amostras de plantas foram analisadas através de combustão com um analisador elementar PDZ Europa ANCA-GSL interfaceado com um PDZ Europa 20-20 isótopo relação espectrômetro de massa na UC Davis estável isótopo instalação (UCD SIF). Amostras de solo foram analisadas com um analisador elementar Elementar Vario EL cubo interfaceado com um PDZ Europa 20-20 isótopo relação espectrômetro de massa na UCD SIF. - Calcular a quantidade de 15N obtido a partir do rótulo na planta atirar e amostras de raiz.
- Em primeiro lugar, calcule o montante de 15N superiores a atmosférica 15N em cada piscina, 15P *:
onde 15P é o conteúdo de 15N % atômica da piscina de interesse. - Em segundo lugar, calcule o montante de 15N superiores a atmosférica 15N no rótulo, 15L *:
onde 15L é o conteúdo de 15N % atômica da fonte rotulada de N. - Em terceiro lugar, calcule a quantidade de N total em cada piscina, Np:
onde mp é a massa do pool (por exemplo, total tiro seco ou biomassa de raiz) e %p é a porcentagem de N de piscina. - Finalmente, use os resultados de 14.5.1\u201214.5.3 na Ndff equação19 para calcular a quantidade de N obtido a partir da etiqueta, Nl:
Nota: A equação de Ndff é usada para determinar a quantidade de N de uma fonte rotulada que é recuperada por plantas. Ele assume que não há discriminação isotópica ocorre durante a absorção de N pela planta e é geralmente válida para N fontes enriquecido ~1\u201210%19.
- Em primeiro lugar, calcule o montante de 15N superiores a atmosférica 15N em cada piscina, 15P *:
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Representative Results
As raízes cresceram preferencialmente contra a parte de trás da caixa, como previsto. Comprimento total rastreados raiz na parte de trás da caixa variou entre 400 e 1.956 cm, em comparação com 758-93 cm na frente da caixa. Coeficientes de correlação de Pearson emparelhados foram calculados entre tamanho de raiz digitalizada e rastreados raiz na frente da caixa, parte traseira da caixa, e a soma de frente e de trás foi usada para determinar se o rastreamento com precisão refletido comprimento total raiz (n = 23, como a planta em uma caixa morreu durante o experimento). Comprimento de raiz total digitalizada correlacionou-se significativamente com comprimento de raiz rastreados na parte de trás da caixa (Figura 5A, p = 0,0059), da frente da caixa (Figura 5B, p = 0,022) e soma de trás e da frente (Figura 5, p = 0.0036). apenas atrás da caixa de rastreamento é validado assim como dando uma medida representativa de crescimento de raiz ao reduzir para metade o tempo necessário para as raízes de rastreamento. Convém, no entanto, que o rastreamento de captura apenas 21,6-54,6% do comprimento total da raiz. Enquanto as raízes crescem preferencialmente contra a superfície da rhizobox, raizes laterais finas em particular podem não ser visíveis para rastreamento. Rastreamento é well-suited ao relativas comparações de comprimento da raiz ao longo do tempo, especialmente no início do desenvolvimento, mas a colheita e digitalização de sistemas da raiz são preferível se o objetivo é quantificar com precisão o comprimento total da raiz.
Figura 5: correlações entre rastreados e verificados dados de comprimento raiz. A) comprimento de raiz Traced significativamente correlacionou-se com comprimento de raiz digitalizada quando apenas a frente da caixa foi traçada. B) rastreamento de raízes na parte de trás da caixa, onde a maioria das raízes eram visível, melhorou o valor de2 R da regressão contra comprimento de raiz digitalizada traçando a frente da caixa; a correlação foi novamente significativa. C) o método mais preciso é raízes de rastreamento em ambos os lados da caixa, como mostrado pelo valor máximo de2 R dos três métodos e a correlação significativa com digitalizados comprimento de raiz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Taxas de crescimento de raiz ao longo do tempo foram semelhantes entre caixas, conforme mostrado pelas encostas consistentes ao plotar o logaritmo natural do comprimento total da raiz contra o tempo (Figura 6). Enquanto ligeira variabilidade é de se esperar, as taxas de crescimento consistente indicam que condições experimentais foram uniformes para todas as caixas. Drasticamente diferentes pistas indicam que as plantas foram crescendo em taxas diferentes, sugerindo a necessidade de verificar se há diferenças nas variáveis como temperatura ou umidade.
Figura 6: taxas de crescimento de raiz ao longo do tempo. Inclinações semelhantes de raiz comprimento vs tempo entre rhizoboxes indicam que as raízes cresceram a taxas iguais. O non-uniform encostas poderiam indicar que as condições experimentais variam entre rhizoboxes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Raízes de todos os genótipos de milho proliferaram em patches contendo resíduos de culturas de cobertura N-rotulado de 15. ANOVA de duas vias com tipo de remendo e genótipo como fixo fatores (n = 23) revelou que a densidade de comprimento de raiz foi superior no tratamento patches de controle usando dados digitalizados raiz (Figura 7a, p = 0,013) bem como dados rastreados raiz (Figura 7b, p = 0,005). RLD não foi significativamente diferente entre os genótipos em ambos os casos.
Figura 7: densidade de comprimento por genótipo e raiz dados tipo. de raiz um) Dados digitalizados raiz mostram que todos os genótipos (A-F) proliferaram no patch de tratamento (T), e genotípicas diferenças não foram significativas. b) colhidas e dados digitalizados raiz confirmaram o efeito significativo do resíduo vegetal, mas não o genótipo (A-F), em densidade de comprimento em patches de raiz. Letras A-F representam seis genótipos diferentes e barras de erro representam o erro padrão. C: controle; T: tratamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Diâmetro da raiz pode ser usado para fazer inferências sobre a função de raiz e o volume de negócios. Raizes finas são mais propensos a ser raízes laterais que desenvolvem rapidamente e se proliferam em resposta a pontos de acesso de recursos, enquanto maiores raízes grossas são mais propensos a ser raízes axiais long-lived, lento-de-resposta. Sistemas de raiz digitalizados foram analisados para a proporção de raízes em cada classe de diâmetro: < 0.2 mm, 0,2 a 0,4 mm, 0.4-0.8 mm, 0.8-1.6 mm, e > 1,6 mm e cada classe de tamanho foi testado para diferenças genotípicas. Genótipos com mais raizes finas em patches de tratamento podem indicar uma resposta mais eficaz de proliferação. One-Way ANOVA com genótipo como um fator fixo (n = 23) revelou que genótipos não diferem em comprimento de raiz em cada classe de tamanho para o sistema raiz global (figura 8a), patches de tratamento (Figura 8b), ou controlar os patches (Figura 8C). A maioria das raízes foram raizes finas (< 0.2 mm).
Figura 8: proporções de raízes em classes de diâmetro diferente por genótipo e localização. um) em cada rhizobox (excluindo patches de tratamento e controle), a maioria das raízes estava bem (< 0.2 mm de diâmetro). Genótipos não diferiram nas proporções de raízes em cada classe de diâmetro. b) em patches de tratamento, comprimento de raiz por classe de tamanho da mesma forma diminuíram com o aumento de diâmetro entre genótipos. c) controle patches foram caracterizados pelos mesmos padrões. Letras A-F representam seis genótipos diferentes e barras de erro representam o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Etiqueta N foi superior em atirar em amostras de raiz em genótipos de acordo com ANOVA de duas vias com tipo de amostra e genótipo como fatores fixos (n = 23, Figura 9), mostrando que 77-81% de N do patch de tratamento foi translocada de raízes de brotos durante o experimento. ANOVA One-Way (n = 23) mostrou que δ15N da raiz e atirar amostras não variou pelo genótipo.
Figura 9: nitrogênio obtidos de resíduo vegetal em raízes e brotos na colheita. Todos os genótipos foram igualmente eficazes em ocupar N do patch contendo resíduo vegetal N-rotulado de 15. A maioria de N do patch foi translocada das raízes de brotos. Letras A-F representam seis genótipos diferentes e barras de erro representam o erro padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O rhizoboxes descrito neste protocolo pode ser usado para responder a perguntas variadas em raízes e rizosfera de ciência e ter encontrado diversas noutro local usa10,20,21,22,23 , 24 , 25. outros pesquisadores capturaram imagens do tempo-lapso de rhizoboxes21,25,26, alguns usando automatizado sistemas22,27. Essas abordagens podem ser utilizadas para análises quantitativas de comprimento da raiz e a arquitetura não é possível com métodos de rastreamento. Rhizoboxes também têm sido usados para visualizar as comunidades microbianas com técnicas como a hibridação fluorescente em situ (FISH) e microautoradiografia (MAR)21,22, ou para capturar espacialmente explícitos padrões de recursos de água e nutrientes com imagem de RGB24 ou atividade enzimática extracelular com zimografia11,30. Os rhizoboxes aqui apresentados são exclusivos dos projetos anteriores em que eles são relativamente grandes, tornando possível estudar espécies com sistemas extensivos de raiz; têm um design único compartimento simples; use materiais prontamente disponíveis e baratos; e são projetados especialmente para estudar patches localizados. A versatilidade deste protocolo rhizobox pode permitir que ser personalizadas para uma variedade de outras aplicações na plasticidade de raiz e interações da rizosfera. Outros nutrientes poderiam substituir o nitrogênio nas manchas. Imóveis nutrientes tais como fósforo sujeitaria à menor lixiviação, provavelmente tornando-os adequados para esta abordagem. Os rhizoboxes também são well-suited para comparações de solo em massa e a rizosfera, como a zona de influência de raiz (uma definição de longa data para a rizosfera15) pode ser mais claramente delineada do que em estudos de pote e separada do solo em massa com uma lâmina de barbear no momento da colheita. Abre-se uma ampla gama de Nova maneiras de estender o protocolo, incluindo o estudo das interações abióticas e bióticas23adaptar esse método para estudar processos de rizosfera.
O método de rhizobox apresentado aqui é bem adequado para medição diferenças relativas entre espécies ou genótipos no crescimento das raízes no início do desenvolvimento, caracterizando as relações entre os traços de raiz e explorar os efeitos das características do solo no crescimento da raiz . Determinadas etapas do protocolo são particularmente críticas porque eles afetam fatores com influência desproporcional sobre o crescimento de raiz: inclinação, densidade e umidade do solo. Molhar uniformemente e igualmente horizontal caixas é crítico tendo em conta a influência da umidade do solo no crescimento de raiz a padrões1,31. Experiências piloto mostraram que entregue através de emissores de gotejamento de água tornou-se uniformemente distribuída após 24-48 h, devido à ação capilar; no entanto, variabilidade entre emissores do volume de água distribuída durante um período determinado de irrigação era demasiado elevada para recomendar esse método usando nosso acordo. Mão molhar lentamente e uniformemente foi o melhor das técnicas testadas, mas outros métodos de irrigação são certamente possíveis. Rega-se com um peso calculado anteriormente garante que todas as caixas de mantenham o mesmo teor de umidade de solo, impedindo a variabilidade de crescimento da raiz devido ao estresse de água32. O peso do vazio rhizoboxes pode variar significativamente, para que calcular o peso ideal para caixas individuais é importante.
Como com a umidade, estabelecer mesmo densidade do substrato durante todo o rhizobox é fundamental para medir respostas de proliferação de raiz. As raízes crescem mais extensivamente em solo menos densa33 e compactação pode criar canais para escoamento preferencial, afetando ainda mais o recurso distribuição e raiz crescimento padrões34. Secagem e peneirar o solo do campo, completamente mistura de areia e o solo e movendo-se o funil e para trás lentamente e uniformemente ajudam a criar uma matriz homogênea para o crescimento da raiz.
Um número de componentes dentro esta experiência vai depender as perguntas de pesquisa de interesse, bem como as espécies de tipo e planta de solo utilizadas dentro do estudo. A proporção de areia ao solo pode precisar de ser ajustados para solos de textura diferente, para garantir que o substrato uniformemente molha sem aglutinação. Experiências piloto mostraram que um solo de 1:1 (v/v): mistura de areia foi superior às misturas 1:2 ou 1:3 para o solo utilizado neste experimento, um muito bem arenoso. As dimensões da rhizoboxes e a duração do experimento podem ser ajustadas dependendo da questão de investigação, traços de raiz e espécies de plantas de interesse. O milho é uma espécie de planta crescente relativamente rápido; Portanto, selecionamos maiores dimensões de rhizobox, em comparação com outras rhizobox20,de estudos35 para fornecer um volume suficiente do solo que permite que o experimento continuar para a duração ideal como plantas tornam-se cada vez mais rootbound ao longo do tempo. Finalmente, a montagem de modelos estatísticos para crescimento visível e rastreados raiz deve ser determinada para cada estudo e espécies de interesse, talvez com experiências piloto. O crescimento visível de raiz pode seguir uma curva de saturação, ao invés de um modelo linear de25,36, e a inclinação da regressão de visível nas raízes colhidas varia conforme a planta espécie21.
As raízes têm uma tendência inerente para perseguir a gravidade e evite luz37, mas deve ter cuidado para garantir que o geotropismo e evitar a luz não viés dados de crescimento de raiz. Se bancos com efeito de estufa são inclinados ligeiramente, por exemplo, raízes crescerão para baixo a inclinação ao invés de responder aos remendos nutrientes. Da mesma forma, luz gradientes na estufa poderiam causar mudanças no crescimento de tiro e as raizes cresçam preferencialmente de um lado, se o rhizoboxes não são mantidos completamente escuros. Os casos de privação de luz, apresentados no protocolo são um meio eficaz de reduzir incidentes leves, mas outros métodos, tais como o rhizoboxes de embrulho em papel de alumínio também pode funcionar.
O método não-destrutivo rhizobox apresentado aqui facilita o acompanhamento das raízes em situ ao longo do tempo38 e pode ser implementado por um estudante de graduação com um conhecimento básico do funcionamento das ferramentas de poder. Como tal, oferece vantagens sobre os métodos de colheita destrutivos como shovelomics6, que são mais adequados para estudar arquitetura raiz maduro mas não permitem medições repetidas do mesmo sistema raiz ao longo do tempo e a ressonância magnética ou radiografia computadorizada tomografia computadorizada39,,40, que permitem imagens de alta qualidade de interações de raiz-substrato mas exige equipamento caro. No entanto, não é sem limitações. Construção do rhizoboxes pode ser demorada e garantindo que fatores como umidade, densidade, inclinação e luz são tão uniformes quanto possível, como descrito acima, não é trivial. Não obstante, dado suficiente tempo e atenção aos detalhes, os rhizoboxes entregar resultados fiáveis e pode ser reutilizados por muitas experiências.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostaria de reconhecer os revisores anônimos para seus comentários, bem como J.C. Cahill e Tan Bao para orientação inicial no desenvolvimento do protocolo rhizobox. O financiamento foi fornecido pela Fundação para alimentos e agricultura Research, Instituto Nacional nos departamento de agricultura (USDA) de alimentos e agricultura, agrícola Experiment Station projeto CA-D-PLS-2332-H, a A.G. e pela UC Davis departamento de planta Ciências através de uma bolsa de J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.27 cm diameter PVC pipe | JM Eagle | 530048 | 305 cm per box, cut into lengths as specified in the protocol |
| PVC side elbows | Lasco | 315498 | 2 per box |
| PVC 90-degree elbows | Charlotte | PVC 02300 0600 | 4 per box |
| PVC T joints | Charlotte | PVC 02402 0600 | 4 per box |
| Extruded acrylic panes | TAP Plastics | N/A | 2 per box, 0.64 cm thick x 40.5 cm wide x 61 cm long |
| HDPE spacers (sides) | TAP Plastics | N/A | 2 per box, 0.64 cm thick x 2.5 cm wide x 57 cm long |
| HDPE spacers (bottom) | TAP Plastics | N/A | 1 per box, 0.64 cm thick x 2.5 cm wide x 40.5 cm long |
| HDPE spacers (patch) | TAP Plastics | N/A | 2 per box, 0.64 cm thick x 3.8 cm wide x 28 cm long |
| Polyester batting | Fairfield | #A-X90 | 2.5 cm x 40.5 cm strip per box |
| 20-thread screws | N/A | N/A | 3.2 cm long, 0.64 cm diameter |
| Washers | N/A | N/A | 0.64 cm internal diameter |
| Hex nuts | N/A | N/A | sized to fit the screws |
| Light deprivation fabric | Americover, Inc. | Bold 8WB26.5 | 1 piece 95 cm wide and 69 cm long per box |
| Sand | Quikrete | No. 1113 | |
| Field soil | N/A | N/A | |
| Transparencies for tracing | FXN | FXNT1319100S | One per side of the box to be traced |
References
- Hodge, A. Roots: The Acquisition of Water and Nutrients from the Heterogeneous Soil Environment. Progress in Botany 71. , 307-337 (2010).
- Grossman, J. D., Rice, K. J. Evolution of root plasticity responses to variation in soil nutrient distribution and concentration. Evolutionary Applications. 5 (8), 850-857 (2012).
- Melino, V. J., Fiene, G., Enju, A., Cai, J., Buchner, P., Heuer, S. Genetic diversity for root plasticity and nitrogen uptake in wheat seedlings. Functional plant biology. , Available from: http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201600101375 (2015).
- Zhang, H., Forde, B. G. An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrient-induced changes in root architecture. Science. 279 (5349), 407-409 (1998).
- Hodge, A., Stewart, J., Robinson, D., Griffiths, B. S., Fitter, A. H. Competition between roots and soil micro-organisms for nutrients from nitrogen-rich patches of varying complexity. Journal of Ecology. 88 (1), 150-164 (2000).
- Trachsel, S., Kaeppler, S. M., Brown, K. M., Lynch, J. P. Shovelomics: high throughput phenotyping of maize (Zea mays L.) root architecture in the field. Plant and Soil. 341 (1-2), 75-87 (2011).
- Rogers, E. D., Monaenkova, D., Mijar, M., Nori, A., Goldman, D. I., Benfey, P. N. X-ray computed tomography reveals the response of root system architecture to soil texture. Plant Physiology. , (2016).
- Groleau-Renaud, V., Plantureux, S., Guckert, A. Effect of mechanical constraint on nodal and seminal root system of maize plants. Comptes Rendus De L Academie Des Sciences Serie Iii-Sciences De La Vie-Life Sciences. 321 (1), 63-71 (1998).
- Lin, Y., Allen, H. E., Di Toro, D. M. Barley root hair growth and morphology in soil, sand, and water solution media and relationship with nickel toxicity. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (8), 2125-2133 (2016).
- Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
- Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
- Vollsnes, A. V., Futsaether, C. M., Bengough, A. G. Quantifying rhizosphere particle movement around mutant maize roots using time-lapse imaging and particle image velocimetry. European Journal of Soil Science. 61 (6), 926-939 (2010).
- Hewitt, E. J. Sand and Water Culture Methods Used in the Study of Plant Nutrition. , Commonwealth Bureau. London. (1966).
- Choudhary, M. I., Shalaby, A. A., Al-Omran, A. M. Water holding capacity and evaporation of calcareous soils as affected by four synthetic polymers. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 26 (13-14), 2205-2215 (1995).
- Bakker, P. A. H. M., Berendsen, R. L., Doornbos, R. F., Wintermans, P. C. A., Pieterse, C. M. J. The rhizosphere revisited: root microbiomics. Frontiers in Plant Science. 4, 2013 (2013).
- McNear, D. H. Jr The Rhizosphere - Roots, Soil, and Everything In Between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
- Ortas, I. Determination of the extent of rhizosphere soil. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 28 (19-20), 1767-1776 (1997).
- UC Davis Stable Isotope Facility. Carbon (13C) and Nitrogen (15N) Sample Preparation. , Available from: https://stableisotopefacility.ucdavis.edu/13cand15nsamplepreparation.html (2018).
- Barraclough, D. 15N isotope dilution techniques to study soil nitrogen transformations and plant uptake. Fertilizer research. 42 (1-3), 185-192 (1995).
- Belter, P. R., Cahill, J. F. Disentangling root system responses to neighbours: identification of novel root behavioural strategies. AoB PLANTS. 7, (2015).
- Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Functional Plant Biology. 39 (11), 891-904 (2012).
- Adu, M. O., Yawson, D. O., Bennett, M. J., Broadley, M. R., Dupuy, L. X., White, P. J. A scanner-based rhizobox system enabling the quantification of root system development and response of Brassica rapa seedlings to external P availability. Plant Root. 11, 16-32 (2017).
- Neumann, G., George, T. S., Plassard, C. Strategies and methods for studying the rhizosphere-the plant science toolbox. Plant and Soil. 321 (1-2), 431-456 (2009).
- Bodner, G., Alsalem, M., Nakhforoosh, A., Arnold, T., Leitner, D. RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (126), e56251-e56251 (2017).
- Kuchenbuch, R. O., Ingram, K. T. Image analysis for non-destructive and non-invasive quantification of root growth and soil water content in rhizotrons. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 165 (5), 573-581 (2002).
- Dresbøll, D. B., Thorup-Kristensen, K., McKenzie, B. M., Dupuy, L. X., Bengough, A. G. Timelapse scanning reveals spatial variation in tomato (Solanum lycopersicum L.) root elongation rates during partial waterlogging. Plant and Soil. 369 (1-2), 467-477 (2013).
- Wu, J., et al. RhizoChamber-Monitor: a robotic platform and software enabling characterization of root growth. Plant Methods. 14 (1), 44 (2018).
- Rogers, S. W., Moorman, T. B., Ong, S. K. Fluorescent In Situ Hybridization and Micro-autoradiography Applied to Ecophysiology in Soil. Soil Science Society of America Journal. 71 (2), 620-631 (2007).
- Eickhorst, T., Tippkötter, R. Detection of microorganisms in undisturbed soil by combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and micropedological methods. Soil Biology and Biochemistry. 40 (6), 1284-1293 (2008).
- Spohn, M., Kuzyakov, Y. Distribution of microbial- and root-derived phosphatase activities in the rhizosphere depending on P availability and C allocation - Coupling soil zymography with 14C imaging. Soil Biology and Biochemistry. 67, 106-113 (2013).
- Lv, G., Kang, Y., Li, L., Wan, S. Effect of irrigation methods on root development and profile soil water uptake in winter wheat. Irrigation Science. 28 (5), 387-398 (2010).
- Asseng, S., Ritchie, J. T., Smucker, A. J. M., Robertson, M. J. Root growth and water uptake during water deficit and recovering in wheat. Plant and Soil. 201 (2), 265-273 (1998).
- Hernandez-Ramirez, G., et al. Root Responses to Alterations in Macroporosity and Penetrability in a Silt Loam Soil. Soil Science Society of America Journal. 78 (4), 1392-1403 (2014).
- Zhang, Y. L., Wang, Y. S. Soil enzyme activities with greenhouse subsurface irrigation. Pedosphere. 16 (4), 512-518 (2006).
- Robinson, D., Hodge, A., Griffiths, B. S., Fitter, A. H. Plant root proliferation in nitrogen-rich patches confers competitive advantage. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 266 (1418), 431-435 (1999).
- Lobet, G., Draye, X. Novel scanning procedure enabling the vectorization of entire rhizotron-grown root systems. Plant Methods. 9, 1 (2013).
- Swarup, R., Wells, D. M., Bennett, M. J. Root Gravitropism. Plant Roots: The Hidden Half. , (2013).
- Smit, A. L., Bengough, A. G., Engels, C., van Noordwijk, M., Pellerin, S., van de Geijn, S. C. Root Methods: A Handbook. , Springer Science & Business Media. (2000).
- van Dusschoten, D., et al. Quantitative 3D Analysis of Plant Roots Growing in Soil Using Magnetic Resonance Imaging1[OPEN]. Plant Physiology. 170 (3), 1176-1188 (2016).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 17 (2015).
