Summary
Visualisera och mätning rot tillväxt i situ är extremt utmanande. Vi presenterar en anpassningsbar rhizobox metod för att spåra rotutveckling och spridning över tid i Svaren till näringsberikande. Denna metod används för att analysera majs genotypisk skillnader i roten plasticitet som svar på en organiskt kväve källa.
Abstract
Rötterna är notoriskt svåra att studera. Marken är både visuella och mekaniska hinder, vilket gör det svårt att spåra rötter i situ utan destruktiva skörd eller dyr utrustning. Vi presenterar en anpassningsbar och prisvärd rhizobox metod som tillåter icke-förstörande visualisering av rottillväxt över tid och är särskilt väl lämpad att studera rot plasticitet i svar till lokaliserade resurs patchar. Metoden validerades genom att bedöma majs genotypisk variation i plasticitet Svaren till patchar som innehåller 15N-märkt baljväxter rester. Metoder beskrivs att erhålla representativa utvecklingsmässiga mätningar över tid, mäta rot längd täthet i resurs-innehållande och kontroll fläckar, beräkna roten tillväxttakt och avgöra 15N återhämtning av växternas rötter och skott. Fördelar, varningar och potentiella framtida tillämpningar av metoden diskuteras också. Men var noga med att säkerställa att experimentella förhållanden inte bias rot tillväxtdata, ger protokollet rhizobox presenteras här tillförlitliga resultat om genomförts med tillräcklig uppmärksamhet på Detaljer.
Introduction
Även om ofta förbises jämfört med deras aboveground motsvarigheter, rötter spelar en avgörande roll i växten näringsämne förvärv. Tanke på den betydande kol kostnaden av roten uppbyggnad och underhåll, har växter utvecklats mekanismer för att utveckla rötter endast där födosök är värt investeringen. Rotsystem kan därmed effektivt och dynamiskt gruva resurs fläckar av frodas i hotspots, upregulating priser upptag och snabbt translocating näringsämnen till floem för ytterligare transporter1. Plasticitet Svaren kan variera bland växt arter eller genotyper2,3 och beroende på vilken kemisk form av näringsämnen inblandade4,5. Variation i roten plasticitet bör undersökas ytterligare, som förstå komplexa rot Svaren till heterogena markresurserna kunde informera avel och strategier att öka näringsämnen användning effektivitet i jordbruket.
Trots dess nödvändighet och betydelse för förståelse växt system innebär visualisera och kvantifiera rot plasticitet på relevanta skalor tekniska utmaningar. Gräva upp roten kronan från marken (”shovelomics”6) är en vanlig metod, men fina rötter utnyttja små porer mellan jord aggregat och utgrävning oundvikligen leder till viss grad av förlust av dessa ömtåliga rötter. Dessutom gör destruktiva skörd det omöjligt att följa förändringar i ett rotsystem över tid. In situ bildmedicinska metoder såsom röntgen beräknas tomografi tillåta direkt visualisering av rötter och markresurserna på hög rumslig upplösning7, men är dyra och kräver specialutrustning. Hydroponiska experiment undvika problemen med att utvinna rötter från marken, men roten morfologi och arkitektur skiljer sig i vattenmedium jämfört med de mekaniska begränsningar och biofysiska komplexitet jordar8,9. Slutligen kan inte odlingsbädden processer och funktioner integreras med utvecklingsmässiga plasticitet i dessa konstgjorda media.
Vi presenterar ett protokoll för konstruktion och användning av rhizoboxes (smala, rensa dubbelsidig rektangulär behållare) som en låg kostnad, anpassningsbara metod att karakterisera rottillväxt i jord över tid. Specialdesignade ramar uppmuntra rötter att växa företrädesvis mot baksidan på grund av gravitropism, öka noggrannheten av roten längd mätningar. Rhizoboxes används vanligen för att studera rottillväxt och odlingsbädden interaktioner10,11,12, men metoden presenteras här erbjuder en fördel i enkelhet med sin singel-fack design och billig material, och syftar till att studera rot Svaren till lokaliserade näringsämnen. Metoden kan dock också anpassas att studera en rad andra rot och odlingsbädden processer såsom intra/SAR konkurrens, rumslig distribution av kemiska föreningar, mikrober eller enzymaktivitet. Här, undersöker vi genotypisk skillnader bland majshybrider svar till fläckar av 15N-märkt baljväxter rester och höjdpunkten representativa resultat att validera metoden rhizobox.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av främre och bakre paneler och distanser
- Förbereda de främre och bakre panelerna.
- Kapade två bitar av tydliga 0,635 cm tjock akryl till 40,5 cm bred 61 cm lång per låda eller köpa färdigskurna bitar (se Tabell för material).
- Med en borr utformad för akryl, borra hål 0,635 cm i diameter 1,3 cm från kanterna på 2,5, 19, 38 och 53,3 cm från toppen. Borra hål 1,3 cm från nederkanten på 2,5, 20,3 och 38 cm på vänster sida (figur 1).
Obs: Det är mest effektivt att använda en drill press för en stack av sex till tio ark i taget, men en handborr kan också användas. - Ta bort eventuella skyddande beläggningar från akryl och försiktigt rengöra båda paneler innan du monterar rutorna.
Figur 1: Layout av borrade hål. Hålen är borrade 1,3 cm från kanterna på 2,5, 19, 38, och 53,3 cm från toppen och 1,3 cm från nederkanten på 2,5, 20,3 och 38 cm från vänstermarginalen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Förbereda sidan och undersidan distanserna.
- Skär tre distanser per låda från högdensitetspolyeten (HDPE) eller Köp två utstansade sida distanser (0,635 cm tjock, 2,5 cm bred, 57 cm lång) och en färdigskurna botten spacer (0,635 cm tjock, 2,5 cm breda, 40,5 cm långa). Se tabell över material.
- Justera distanserna mellan de främre och bakre panelerna längs sidorna och botten av lådan. Använda en handborr eller borrmaskin, borra igenom de befintliga hålen i fronten och tillbaka igen så att hålen passerar alla tre lager renlig.
- Hålla lager placera med hjälp av klämmor eller genom att installera en kombination av bultar, muttrar och brickor i varje nyligen borrade hål (se steg 3.1).
2. installation av en remsa av Polyester vadd längst ned i rutan
Obs: Detta kommer att förhindra mark och vatten från att läcka igenom skarvarna mellan distanser.
- Skär polyester vadd in 2,5 cm bred av remsor 40,5 cm långa (se Tabell för material).
- Med den bakre liggande platt och distanserna ovanpå det lay vadd direkt ovanför botten mellanlägget och håller den på plats med den övre panelen (figur 2).
Figur 2: monterade rhizobox med vadd. En smal remsa av vadd längst ned i rhizobox förhindrar jord och sand från att läcka ut. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. montering av Rhizoboxes
- Montera på rhizoboxes med 20-gänga skruvar (3,2 cm längd av 0,635 cm diameter), brickor (0,635 cm inre diameter) och sexkantmuttrar (storlek passar skruvarna, se Tabell för material.
- Dra åt varje skruv genom en bricka, frontpanelen, spacer, baksidan, bricka och hex mutter. Kontrollera att skruvarna är mycket snäva; Om rutan är monterad löst, kommer att jord spilla ut genom luckor mellan paneler och sida distanser.
Obs: Akryl är lätt repig och repor kan störa rot mätningar, så hantera rutorna monterade med omsorg. Undvik att stapla lådor om skyddande material placeras mellan dem. - Förbered två patch distanser (distanser som kommer att användas att skapa behandling och kontroll patchar) per låda. Skär distanser från högdensitetspolyeten (HDPE) ark eller köpa dem före cut (0,635 cm tjock, 3,8 cm brett, 28 cm lång, se Tabell för material). Borra ett hål 0,635 cm i diameter i varje spacer, 2 cm från toppen längs mittlinjen (figur 3).
Figur 3: lapp distanser. Skruvar in genom centrum av HDPE remsorna hålla dem från att falla i rutan. Rhizobox är fylld med jord runt distanserna, marken är fuktade och distanserna tas bort för att lämna tomma behandling och kontroll fläckar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- Säkra en skruv genom varje hål med en mutter så att mellanlägget delvis kan infogas i rhizobox tills skruven hindrar den från att gå vidare (figur 3).
Obs: När jorden är fuktad runt distanserna och distanserna tas bort, två tomma utrymmen förblir som kan fyllas med de lämpliga substratesna för kvävehaltiga behandling patch och kontroll patch.
4. bygga PVC ramar att stödja Rhizoboxes vinkel
Obs: När rutan placeras i en vinkel, gravitropism kommer att uppmuntra rötterna att växa mot baksidan så att alla rötter är synliga för spårning. Polyvinylklorid (PVC) mått i figur 4 resultera i en ram som upprätthåller rhizobox på en ca 55 ° vinkel till bänken.
- Skär 13 bitar diameter 1,3 cm PVC per låda: 2 × 44 cm längder, 3 × 42 cm längder, 2 × 36,3 cm längder, 2 × 25,4 cm längder och 4 × 3,8 cm längder (se Tabell för material).
Obs: En chop såg rekommenderas för effektivitet och även nedskärningar. - Använd 4 × 2-vägs armbågar, 2 × 3-vägs armbågar och 4 T-muffar (se Tabell för material) att montera rutan som visas i figur 4.
Obs: Ramar bör vara stabil utan extra lim, men PVC lim kan användas vid behov.
Figur 4: ram för att stödja rhizoboxes. Den lätta ramen är tillverkad av PVC skär i de angivna längderna och anslutna använder gemensamma typer anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
5. sy skyddande fall att reflektera ljus och värme
Obs: Rötter undvika ljus, så dessa fall utesluta ljus för att se till som observerats rot plasticitet Svaren drivs av näringskälla i fläckar och inte genom ljus undvikande. Light deprivation tyg minskar också temperaturen inuti rhizoboxes, hjälper till att undvika värmestress.
- Skär light deprivation tyget (specialiserade material som är vitt på ena sidan och svart på den andra) i bitar ca 95 cm bred och 69 cm lång (se Tabell för material). Det krävs en bit per låda.
- Vik varje bit på mitten längs långsidan att bilda en 47,5 cm × 69 cm ärm. Använder en symaskin needle utformad för denim, tunga quiltning tråd och en smal söm, sy längs botten och ¾ av långt upp på sidan av varje ärm. Fästa de övre hörnen tillsammans med en säkerhetsnål.
6. beredning av 1:1 (V/V) jord: Sand substrat för att fylla Rhizoboxes
- Samla in cirka 1000 cm3 i fältet jord (från platsen av intresse) per låda. Torr mark till konstant vikt i grunt tråg vid 60 ° C.
Obs: Jord för detta experiment samlades omedelbart efter skörden i ett ekologiskt hanterad majsfält från 0\u201210 cm djup. - Mala jorden med en mortel och stöt att passera genom ett 2 mm såll. Mäta skrymdensitet av marken genom vägning en känd volym av jord.
- Få sand (till exempel spela sand, som kan köpas billigt från en järnaffär, se Tabell av material) och mät bulkdensitet.
- Mät ut lika stora mängder sand och jord i en hink och blanda väl. Använd en tratt för att fylla rutan långsamt och jämnt till 2,5 cm från toppen, utan skakningar rutan för att orsaka substratet sedimentera. Mäta denna volym av substratet; Det bör vara cirka 1 272 cm3.
- Multiplicera skrymdensitet av sand med halva denna volym att få massa sand behövs för varje ruta. Gör samma sak med bulkdensitet jord att få massa jord behövs för varje ruta.
Obs: För fältet jord och sand som används i detta experiment, detta var 976 g sand och 774 g jord, men dessa belopp kommer att variera beroende på bulk tätheten av den jord som används. - Märka en stor plastpåse zip-top per rhizobox, väga lämpliga massorna av sand och jord i påsen och homogenisera grundligt.
- Analysera detta 1:1 jord- och substrat för innehållet av näringsämne och det naturliga överflödet av 15N (δ15N).
7. substrat förberedelse för behandling och kontroll patchar
- Märk två små zip-top plastpåsar per rhizobox, en för behandling lappen och en för kontroll lappen. Väger 30 g av smutsa: sand substrat från varje stor väska (steg 6,6) i de två motsvarande små påsarna.
- Blanda substratet med en 15N-märkt kväve källa för behandling lappen. För detta, väg upp 1 g 15N-märkt växt rester eller andra N-source (beloppet kan justeras efter önskemål) i varje behandling väska (små zip-top väska), och blanda väl.
Obs: För detta experiment användes en blandning av 15N-märkt klöver och vicker rester. Klöver och vicker frön var planterade i en 1:1 blandning av vermikulit och sand, och odlas under växthus förhållanden. Plantorna var vattnas dagligen med avjoniserat vatten och två gånger i veckan med 1/100 styrka av lång-Ashton lösning13 innehållande 15N-märkt kväve källor. Alla aboveground biomassa skördades på fyra veckor efter plantering, torkade och malda för att passera genom ett 2 mm såll. Om ett annat näringsämne är valt, särskilt om elementet är rörlig i markytan, uppmuntras pilot experiment att testa för urlakning. Långsam frisättning former av näringsämnen kan användas eller en annan rhizobox design kunde väljas att begränsa utlakning (t.ex. genom separata fack10) vid behov.
8. laddar Rhizobox med substrat och inrättande av behandling och kontroll patchar
- Väga varje tom rhizobox och spela in vikterna för senare användning.
- Infoga två patch distanser (se steg 3,2) i en rhizobox tills skruven hindrar dem från att gå vidare. Markera djupet på den nedre kanten ljus på sidan av rhizobox (figur 3) och ta bort distanserna.
- Hjälp av en tratt med en stam-öppning som är så smala som rhizobox öppningen, Fyll rhizobox från motsvarande stora påsen med substrat till det markerade djupet. Flytta tratten och tillbaka långsamt och jämnt så att underlaget fyller jämnt och skapar inte preferentiella flöden kanaler.
- När substratet nivån når markerade djupet, sätta distanserna tillbaka i 5 cm från varje sida av rutan. Fortsätt att fylla rutan tills substratet är ca 5 cm från toppen av rutan (det bör vara substrat kvar i påsen).
- Blöt ordentligt runt varje spacer.
Obs: I detta experiment, detta uppnåddes genom att leverera 50 mL vatten genom dropp sändare införas mellan den yttre kanten av varje spacer och sidan av rhizobox och hälla 50 mL vatten jämnt mellan de två distanserna. Långsam bevattning är nödvändigt för enhetlig vätning. - Ta bort distanserna medan marken är blöt, lämnar en tom hålighet för plåster.
- Tejpa en OH-film på utsidan av varje rhizobox (se Tabell för material). Markera ena sidan som behandling och en som kontroll och fyll patchar från lämpliga påsar använda tratten. Spåra gränserna för varje plåster om insyn med permanenta märkpenna.
- Fyll i rhizobox jämnt med kvarvarande substratet. Spåra upp i substratet om insyn.
- Upprepa för den återstående rhizoboxes. Spara alla väskor för skörd.
9. även vattning till 60% vatten kapacitet att hålla
Obs: Denna mängd markfuktighet befanns förebygga växter drabbas av torkstress samtidigt förhindra utvecklingen av syrefria förhållanden eller algtillväxt.
- Mäta den vattenhållande förmågan (WHC) av substrat14.
- Beräkna den ideala kroppsvikten varje ruta; Här definieras som summan av vikten på den tomma rhizobox kombinerat med vikt på substratet på 60% vattenhållande förmåga.
- Multiplicera WHC (gram vatten / gram torr substrat) med 0,6 att få massa vatten hålls i substratet på 60% WHC. Lägga till denna massa massa torra substrat och massan av 15N källan.
- Lägga till tomma vikten på varje ruta nummer erhållits ovan.
- Väga rutorna när de har fyllts. Subtrahera vikten på varje ruta (i g) på denna punkt från dess idealvikt (i g) beräknades i steg 9,2. Vatten med denna volym (i mL) av de joniserade (DI) vatten långsamt och jämnt.
Obs: Detta steg kan göras med droppbevattning eller vattna för hand. Om vattning för hand, låta vattnet tränga helt innan du lägger till mer för att undvika fukt för heterogen markförhållanden och preferentiella flöden kanaler.
10. utsäde grobarhet och Transplantation
- Om du använder unplanted kontroller, Ställ dessa rhizoboxes åt sidan.
- Surface-sterilisera majsfrön genom omrörning för 1 min i 5% NaOCl och skölj noga i DI vatten.
Obs: I detta experiment, frön av sex olika majs genotyper användes för att undersöka genotypisk skillnader i roten plasticitet. - Gro steriliserade frön genom att placera dem på en våt laboratorium vävnad (t.ex. Kimwipe) inuti petriskålar och täcka med en annan fuktig vävnad. Det bör inte finnas någon stående vatten. Plats petriskålar i en mörk plats för 48\u201272 h tills rotanlaget bara börjar växa fram.
- Använd en smal spatel för att gräva ett hål till 2,5 cm djup i mitten av varje rhizobox. Transplantera ett grodda frö i hålet, för att säkerställa att rotanlaget är orienterad direkt nedåt.
Obs: Om rotanlaget är vinklad mot antingen patch, kommer jämförelsen av roten tillväxttakten vara partisk. - Spåra platsen för utsäde om insyn.
- Omfatta utsäde och vatten in med upp till 50 mL DI vatten.
11. växter tillväxt
- Odla växter i 25 dagar (eller så länge som önskas), upprätthålla 60% WHC under hela växtperioden. Övervaka rottillväxt genom att spåra rötterna.
- Väga varje ruta varje 3\u20124 dagar och vatten tills det är inom 5 g av sin idealvikt. Sluta vattna rhizoboxes fyra dagar före skörd att underlätta separering av panelerna. Ta bort ogräs för hand ofta så att endast växternas rötter av intresse är närvarande.
- Spåra synliga rötter var 3\u20124 dag med en permanent markörpenna med klart urskiljbara färger för varje spårning dag.
Obs: Olika diameter markörer kan användas för primära och laterala rötter, om så önskas. Det kan vara användbart att definiera kriterier för roten spårning i början eftersom en grad av subjektivitet är inblandade, särskilt om flera forskare kommer att vara spårning rötter eller om rötter olika order eller diameter är att vara distingerad med olika markörer. I detta experiment, riktigheten av spåra synliga rötter på endast ena sidan av rutan testades genom att spåra synliga rötterna på båda sidor och jämföra totala rot längd mätt på skannade oh till totala rot längd mäts genom tvättning och skanning rötter. Korrelationen mellan spåras och skannade rot längd var betydande oavsett om bara tillbaka insyn eller båda OH-film användes. Det är därför möjligt att bara spåra synliga rötter på baksidan.
12. skörd skott och erhålla rot och jordprov för analys
- Låg den första rhizobox platta och ta bort alla skruvar.
- Skörda de skjuta proverna. Klipp skott vid basen, skölja bort all jord med DI vatten och torka i 60 ° C. Grind skjuter med en mortel och stöt att passera genom ett såll med 2 mm och väga delprover i tenn kapslar för isotopen analys (se avsnitt 14).
- Med öppenheten som en guide, skär runt behandling och kontroll patchar med ett rakblad. Använd en sked eller spatel för att ösa rötterna och vidhängande odlingsbädden smutsa in i respektive behandling eller kontroll påsen.
Obs: Medan finns många metoder att separat odlingsbädden jord, marken under påverkan av växten rötter15och odlingsbädden kan anses vara en övertoning i stället för en strikt avgränsade zonen16, denna metod följer den utbredda definition av marken som följer om växters rötter efter omskakning17. - Scoop återstående rötter och jord till den tredje väskan.
- Passera behandling, kontroll, och bulk prover genom en 2 mm sikt att separera rötterna från substrat, ta bort alla synliga rötter eller fragment > 1 cm i längd med fin pincett. Hålla dessa prover som är skilda från varandra för sammanlagt tre rot och tre substrat prover.
13. validering av Tracings och uppskattning av relativa Root tillväxttakt
- Skanna behandling, kontroll, och bulk prover och beräkna roten längd.
- Arbetar med ett prov i taget, skölj rötterna noga med DI vatten för att avlägsna eventuella kvarvarande substratet. Ordna prover i en tydlig bricka så att rötterna inte överlappar.
- Skanna prover med en skanner som är kompatibel med roten analysprogramvara (t.ex. WinRhizo). Se till att programvaran är kalibrerad för att tillförlitligt skilja rötter från bilden bakgrunden.
- Använda programvaran för att mäta totalt rot längd och rot längd i klasserna diameter av intresse (t.ex. < 0,2 mm, 0.2\u20120.4 mm, 0.4\u20120.8 mm, 0.8\u20121.6 mm, > 1,6 mm).
- Beräkna roten längd täthet (RLD) för behandling och kontroll patchar och för varje rhizobox som helhet.
- Beräkna volymen av behandling och kontroll fläckar genom att multiplicera området spåras på varje insyn (se steg 8,1) 0,635 cm, djupet av rutan. Använda dessa volymer för att beräkna roten längd täthet i behandling och kontroll fläckar med totala rot längden i varje plåster (se steg 13.1.3).
- Beräkna volymen av substrat i varje rhizobox genom att multiplicera området spåras om insyn (se steg 8,1) av 0,635 cm. beräkna RLD när det gäller behandling och kontroll plåstren.
- Beräkna volymen av behandling och kontroll fläckar genom att multiplicera området spåras på varje insyn (se steg 8,1) 0,635 cm, djupet av rutan. Använda dessa volymer för att beräkna roten längd täthet i behandling och kontroll fläckar med totala rot längden i varje plåster (se steg 13.1.3).
- Validera roten spårning metod genom att jämföra skannade rotsystem och spåras bilder.
- Skanna varje öppenhet och beräkna totala rot längd med hjälp av programvaran. Spara den skannade bilden för tillväxt beräkningar.
- Summera de totala rot längd mätningarna av behandling, kontroll, och bulk prover för varje låda (se steg 13.1.3).
- Testa de skannade och spårade mätningarna av total root längd för att se om sambandet är statistiskt signifikant.
Obs: Om så är fallet, spårning metoden är validerad och relativ tillväxt kan beräknas vid varje tidpunkt. Om inte, endast skannade rotsystem data ger en exakt angivelse av rottillväxt. Detta kan vara fallet om spårning metodik var inkonsekvent eller om rötter inte var lika synliga för alla genotyper, t.ex.
- Om metoden spårning validerades, beräkna relativa rot tillväxttakter för varje rhizobox.
- Använd rot-analysprogrammet som kalibreras för att skilja mellan valt spårning färgerna att mäta total root längd i behandling, kontroll, och bulk prover vid varje tidpunkt. Beräkna kumulativa totala rot längd vid varje tidpunkt.
- Beräkna relativa rot tillväxttakter (RGRrot) för varje rhizobox samt när det gäller behandling och kontroll patchar för varje tidsintervall t1-t2 som följer.
Obs: Här L1 är totala rot längd i plåstret (kumulativa summan från 11,3) t1 dagar efter transplantation (DAT) och L2är totala rot längd i plåstret vid t2 DAT.
14. analys av 15N partitionering bland rot, skjuta och behandling jordprover
- Torra rötter vid 60 ° C, väger biomassa och slipa för att passera genom ett 2 mm såll.
- Torra delprover av behandling jord vid 60 ° C.
- Paketet rötter och behandling i tenn kapslar som med skotten.
Obs: Idealisk provets vikt per kapsel ska beräknas separat för skott, rötter och jord baserade på uppskattade C/N kvoten av materialet för att uppnå målbeloppet på totalkväve för analys. Kontakta stabil isotop anläggningen där proverna skall lämnas in för mer information. För detta experiment var de prov tillagningsanvisningar och prov vikt kalkylator som tillhandahålls av UC Davis stabil isotop anläggningen följt18.
Varning: Var särskilt försiktig att blanda prover jämnt innan förpackning i kapslar och förbereda flera kapslar per prov. Om proverna inte blandas jämnt, kan skenbar återvinning av 15N överstiga beloppet som ursprungligen närvarande. - Analysera totalkväve, δ15 och 15N innehållet i varje skott, rot och behandling jordprov.
Obs: I detta experiment, växtprover analyserades via förbränning med ett PDZ Europa ANCA-GSL elementärt analyzer kopplats ihop till en PDZ Europa 20-20 isotopen baserat masspektrometer vid UC Davis stabil isotop anläggningen (UCD SIF). Jordprover analyserades med en Elementar Vario EL kub elementärt analysator kopplats ihop till en PDZ Europa 20-20 isotopen baserat masspektrometer på den UCD SIF. - Beräkna beloppet 15N erhålls från etiketten i växten skjuta och rota prover.
- Först beräkna mängden 15N utöver atmosfäriska 15N i varje pool, 15P *:
där finns 15P 15N innehållet i Atom % av av intresse. - För det andra, beräkna mängden 15N utöver atmosfäriska 15N i etiketten, 15L *:
där finns 15L 15N innehållet i Atom % av den märkta N källan. - För det tredje, beräkna mängden totalkväve i varje pool, Np:
där mp är massan av poolen (t.ex. totala torr skjuta eller rot biomassa) och %p är procent av N av poolen. - Slutligen Använd resultaten av 14.5.1\u201214.5.3 i Ndff ekvation19 till beräkningen av N erhålls från etiketten Nl:
Obs: Ndff ekvationen används för att bestämma mängden av N från en märkt källa som återvinns av växter. Det förutsätts att ingen isotopiska diskriminering uppstår under N upptag av anläggningen och är allmänt giltig för N källor berikade ~1\u201210%19.
- Först beräkna mängden 15N utöver atmosfäriska 15N i varje pool, 15P *:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Rötter växte företrädesvis mot baksidan av rutan, som väntat. Totalt spåras rot längd på baksidan av rutan varierade från 400 till 1 956 cm, jämfört med 93-758 cm på framsidan av lådan. Parvisa Pearson korrelationskoefficienter beräknades mellan skannade rot längd och spårade rot längd på framsidan av lådan, baksidan av rutan och summan av fram- och baksidan användes för att avgöra huruvida spårning korrekt återspeglas totala rot längd (n = 23, som anläggningen i en låda dog under experimentet). Skannade totala rot var signifikant korrelerade med spårade rot längd på baksidan av rutan (figur 5A, p = 0.0059), främre av rutan (figur 5B, p = 0,022), och summan av rygg och främre (figur 5 c, p = 0,0036). därmed spåra endast baksidan av rutan verifieras som ger ett representativt mått på rottillväxt samtidigt halvera tidsåtgången till trace rötter. Det bör dock noteras att spårning fångar endast 21,6-54,6% av totala rot längd. Medan rötterna växer företrädesvis mot ytan av rhizobox, kanske fina laterala rötter i synnerhet inte syns för spårning. Spårning är väl lämpad att relativa jämförelser av roten längd över tiden, särskilt tidigt i utvecklingen, men skörd och skanning rotsystem är att föredra om målet är att exakt kvantifiera totala rot längd.
Figur 5: korrelationer mellan spåras och skannade rot längd data. A) genererad roten var signifikant korrelerade med skannade rot längd när endast framsidan på rutan spårades. B) spåra rötter på baksidan av rutan, där majoriteten av rötter var synlig, förbättrad R2 värdet av regression mot skannade rot längd över spårning framsidan av rutan. korrelationen var igen betydande. C) den mest exakta metoden är att spåra rötterna på båda sidor av lådan, vilket framgår av det högsta R2 värdet av tre metoder och betydande korrelationen med skannade rot längd. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Root tillväxten över tid var liknande bland rutorna som visas konsekvent sluttningar när plottning naturliga loggen av totala rot längd mot tiden (figur 6). Medan liten variabilitet kan förväntas, visar konsekvent tillväxt att experimentella förhållanden var enhetligt för alla rutor. Dramatiskt annorlunda backarna skulle tyda på att växter växer i olika takt, vilket tyder på behovet av att kontrollera för skillnader i variabler såsom temperatur eller fuktighet.
Figur 6: Root tillväxt över tiden. Liknande sluttningarna av roten längd vs. tid bland rhizoboxes indikerar att rötter växte lika priser. Icke-enhetlig backarna kan tyda på att experimentella förhållanden varierar bland rhizoboxes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Rötter av alla majs genotyper frodats i fläckar som innehåller skörderester för 15N-märkta luckan. Tvåvägs ANOVA med patch typ och genotyp som fasta faktorer (n = 23) avslöjade att roten längd täthet var högre i behandling än kontroll patchar med skannade root data (figur 7a, p = 0,013) samt spårade root data (figur 7b, p = 0,005). RLD skiljde sig inte signifikant mellan genotyperna i båda fallen.
Figur 7: Root längd täthet av genotyp och root data typ. en) Skannade root data visade att alla genotyper (A-F) frodats i behandling (T) patch och genotypiska skillnaderna var inte signifikant. b) skördas och skannade root data bekräftade signifikanta effekten av baljväxter rester, men inte genotyp (A-F), på root längd täthet i fläckar. Bokstäverna A-F som representerar sex olika genotyper och felstaplar standardfel. C: kontroll; T: behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Root diameter kan användas för att göra slutledningar om roten funktion och omsättning. Boten rotar är mer benägna att vara laterala rötter som snabbt utveckla och föröka svar på resurs hotspots, medan större grova rötter är mer sannolikt att vara långlivat, långsam-att-respond axiella rötter. Skannade rotsystem analyserades för andelen rötter i varje diameter klass: < 0,2 mm, 0,2-0,4 mm, 0,4-0,8 mm, 0,8-1,6 mm, och > 1,6 mm, och varje storleksklass testades för genotypisk skillnader. Genotyper med fler fina rötter i behandling fläckar kan tyda på en effektivare spridning svar. Envägs ANOVA med genotyp som en fast faktor (n = 23) avslöjade att genotyper inte skiljer sig i roten längd i varje storleksklass för rotsystemet övergripande (figur 8a), behandling patchar (figur 8b), eller styra patchar (figur 8 c). En majoritet av rötterna var fina rötter (< 0,2 mm).
Figur 8: proportioner av rötter i olika diameter klasser av genotyp och läge. en) i varje rhizobox (exklusive behandling och kontroll patchar), majoriteten av rötter var fina (< 0,2 mm i diameter). Genotyper skilde sig inte i proportioner av rötter i varje diameter klass. b) i behandling patchar, roten längd per storleksklass jämväl minskade med ökande diameter över genotyper. c) kontroll patchar präglades av samma mönster. Bokstäverna A-F som representerar sex olika genotyper och felstaplar standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Etiketten N var högre i skjuta än roten prover över genotyper enligt tvåvägs ANOVA med Provtyp och genotyp som fasta faktorer (n = 23, figur 9), visar att 77-81% av N tas upp från behandling plåstret var flyttad från rötter till skott under experimentet. Envägs ANOVA (n = 23) visade att δ15N i roten och skjuta prover inte varierar efter genotyp.
Figur 9: kväve erhållits från baljväxter rester i rötter och skott vid skörd. Alla genotyper var lika effektiva på att ta upp N från plåstret som innehåller 15N-märkt baljväxter rester. Majoriteten av N tas upp från plåstret var flyttad från rötter till skott. Bokstäverna A-F som representerar sex olika genotyper och felstaplar standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den rhizoboxes som beskrivs i detta protokoll kan användas för att besvara varierade frågor i rot och odlingsbädden vetenskap och har hittat olika använder någon annanstans10,20,21,22,23 , 24 , 25. andra forskare har fångat time-lapse bilder rhizoboxes21,25,26, vissa använder automatiserade system22,27. Dessa metoder kan användas för kvantitativa analyser av roten längd och arkitektur inte möjligt med spårning metoder. Rhizoboxes har också använts för att visualisera mikrobiella samhällen med tekniker såsom fluorescerande i situ hybridisering (FISH) och micro-autoradiografi (MAR)21,22, eller att fånga rumsligt explicit mönster av bevattna och den närande resurser med RGB-imaging24 eller extracellulära enzymaktivitet med zymography11,30. De rhizoboxes som presenteras här är unika från tidigare mönster i att de är relativt stora, vilket gör det möjligt att studera arter med omfattande rotsystem; har en enkel design för singel-fack; använda lättillgängliga, billiga material; och är speciellt utformade för att studera lokaliserade patchar. Mångsidigheten hos rhizobox protokollet kunde tillåta att anpassas för en rad andra program i roten plasticitet och odlingsbädden interaktioner. Andra näringsämnen kan ersätta kväve i fläckar. Orörliga näringsämnen såsom fosfor skulle utsätta för mindre läckage, vilket sannolikt gör dem en bra passform för detta tillvägagångssätt. Rhizoboxes är också väl lämpade för jämförelser av bulk och odlingsbädden jord, zonplanera av rot påverkan (en långvariga definition för odlingsbädden15) kan tydligare avgränsad än i potten studier och avskild från bulk jord med en rakhyvel vid skörd. Anpassa denna metod för att studera odlingsbädden processer öppnar upp nya mängder av sätt att utöka protokollet, inklusive studier av både abiotiska och biotiska interaktioner23.
Metoden rhizobox som presenteras här är väl lämpad att mäta relativa skillnader bland genotyper eller arter i rottillväxt tidigt i utvecklingen, karaktärisera relationer bland rot drag, och utforska effekterna av jordens egenskaper på rottillväxt . Vissa steg i protokollet är särskilt kritiskt eftersom de påverkar faktorer med oproportionerliga inflytande på rottillväxt: jord fukt, skrymdensitet och lutning. Vattning jämnt och lika över rutorna är kritisk med tanke på påverkan av markfuktighet på roten tillväxt mönster1,31. Pilotförsök visade att vatten som levereras genom dropp sändare blev jämnt fördelad efter 24-48 h på grund av kapillärkraften; variationsrikedomen bland utsläppsländerna i volymen vatten som levereras under en given bevattning var dock för högt för att rekommenderar den här metoden använder vårt arrangemang. Hand vattning långsamt och jämnt var bäst av de tekniker som testas, men andra bevattningsmetoder för är säkert möjligt. Vattning en tidigare beräknad vikt säkerställer att alla boxar har samma jord fukt innehåll, förhindra variabilitet i rottillväxt på grund av vatten stress32. Vikt tom rhizoboxes kan variera kraftigt, så beräkna idealisk vikter för enskilda rutor är viktigt.
Som med fukt, upprättandet av även skrymdensitet av substratet i hela rhizobox är kritiska att mäta rot spridning svaren. Rötter växer mer utförligt i mindre tät jord33 och packning kan skapa kanaler för förmånliga vattenflödet, ytterligare påverkar resurs distribution och rot tillväxt mönster34. Torkning och siktning fältet jord, grundligt blanda sand och jord och flytta tratten och tillbaka långsamt och jämnt bidra till att skapa en homogen matris för rottillväxt.
Ett antal komponenter inom detta experiment beror på forskningsfrågorna av intresse liksom de jord typ och växt arter utnyttjas inom studien. Förhållandet mellan sand till jord kan behöva justeras för smutsar av olika textur, att se till att substratet kissar jämnt utan klumpar. Pilotförsök visade att en 1:1 (v/v) jord: sand blandning var överlägsen 1:2 eller 1:3 blandningar för den jord som används i detta experiment, en mycket fin sandig lerjord. Mått på rhizoboxes och varaktigheten av experimentet kan justeras beroende på forskningsfråga, roten drag, och växtarter av intresse. Majs är en relativt snabb växande växtarter; vi därför valt större rhizobox dimensioner jämfört med andra rhizobox studier20,35 att tillhandahålla en tillräcklig volym jord som tillåter experimentet fortsätta för optimala varaktigheten som växter blivit alltmer rootbound över tid. Slutligen, montering av statistiska modeller för att synligt och spårade rottillväxt måste bestämmas för varje studie och arter av intresse, kanske med pilotförsök. Synliga rottillväxt kan följa en mättar kurva snarare än en linjär modell25,36, och lutningen av regression av synliga på skördade rötterna varierar beroende på växt arter21.
Rötter har en inneboende tendens att fullfölja gravitation och undvika ljus37, men försiktighet måste iakttas för att säkerställa att gravitropism och ljus undvikande inte bias rot tillväxtdata. Om växthus bänkar lutar något, till exempel att rötter växa ner lutningen i stället för att svara på näringsämnen patchar. Likaså kunde lätta toningar i växthuset orsaka Skift i skjuta tillväxt och rötter att växa företrädesvis på ena sidan om rhizoboxes inte hålls helt mörkt. De lätta deprivation fall presenteras i protokollet är ett effektivt sätt att minska infallande ljus, men andra metoder såsom inslagning rhizoboxes i aluminiumfolie kan också fungera.
Icke-förstörande rhizobox metoden presenteras här underlättar spårning av rötter i situ över tid38 och kan genomföras av en doktorand med grundläggande kunskap av elverktyg. Som sådan, erbjuder det fördelar över destruktiva skördemetoder såsom shovelomics6, som är bättre lämpade att studera mogna rot arkitekturen men inte tillåter upprepade mätningar av samma rot system över tid, och MRI eller röntgen beräknas tomografi39,40, som tillåter hög kvalitet avbildning av rot-substrat interaktioner men kräver dyr utrustning. Det är dock inte utan begränsningar. Byggandet av rhizoboxes kan vara tidskrävande, och att faktorer som fukt, skrymdensitet, lutning och ljus är så enhetliga som möjligt, som beskrivits ovan, är icke-trivial. Ändå ges tillräckligt med tid och uppmärksamhet på Detaljer, rhizoboxes leverera tillförlitliga resultat och kan återanvändas för många experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna anonym granskare för deras feedback, samt J.C. Cahill och Tan Bao för inledande vägledning på att utveckla rhizobox protokollet. Finansieringen tillhandahölls av Stiftelsen för livsmedel och jordbruk forskning, oss avdelning av jordbruk (USDA) nationella institutet för livsmedel och jordbruk, jordbruks Experiment Station projektet CA-D-PLS-2332-H, till A.G. och vid UC Davis institutionen av växten Vetenskaper genom ett stipendium till J.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.27 cm diameter PVC pipe | JM Eagle | 530048 | 305 cm per box, cut into lengths as specified in the protocol |
| PVC side elbows | Lasco | 315498 | 2 per box |
| PVC 90-degree elbows | Charlotte | PVC 02300 0600 | 4 per box |
| PVC T joints | Charlotte | PVC 02402 0600 | 4 per box |
| Extruded acrylic panes | TAP Plastics | N/A | 2 per box, 0.64 cm thick x 40.5 cm wide x 61 cm long |
| HDPE spacers (sides) | TAP Plastics | N/A | 2 per box, 0.64 cm thick x 2.5 cm wide x 57 cm long |
| HDPE spacers (bottom) | TAP Plastics | N/A | 1 per box, 0.64 cm thick x 2.5 cm wide x 40.5 cm long |
| HDPE spacers (patch) | TAP Plastics | N/A | 2 per box, 0.64 cm thick x 3.8 cm wide x 28 cm long |
| Polyester batting | Fairfield | #A-X90 | 2.5 cm x 40.5 cm strip per box |
| 20-thread screws | N/A | N/A | 3.2 cm long, 0.64 cm diameter |
| Washers | N/A | N/A | 0.64 cm internal diameter |
| Hex nuts | N/A | N/A | sized to fit the screws |
| Light deprivation fabric | Americover, Inc. | Bold 8WB26.5 | 1 piece 95 cm wide and 69 cm long per box |
| Sand | Quikrete | No. 1113 | |
| Field soil | N/A | N/A | |
| Transparencies for tracing | FXN | FXNT1319100S | One per side of the box to be traced |
References
- Hodge, A. Roots: The Acquisition of Water and Nutrients from the Heterogeneous Soil Environment. Progress in Botany 71. , 307-337 (2010).
- Grossman, J. D., Rice, K. J. Evolution of root plasticity responses to variation in soil nutrient distribution and concentration. Evolutionary Applications. 5 (8), 850-857 (2012).
- Melino, V. J., Fiene, G., Enju, A., Cai, J., Buchner, P., Heuer, S. Genetic diversity for root plasticity and nitrogen uptake in wheat seedlings. Functional plant biology. , Available from: http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201600101375 (2015).
- Zhang, H., Forde, B. G. An Arabidopsis MADS box gene that controls nutrient-induced changes in root architecture. Science. 279 (5349), 407-409 (1998).
- Hodge, A., Stewart, J., Robinson, D., Griffiths, B. S., Fitter, A. H. Competition between roots and soil micro-organisms for nutrients from nitrogen-rich patches of varying complexity. Journal of Ecology. 88 (1), 150-164 (2000).
- Trachsel, S., Kaeppler, S. M., Brown, K. M., Lynch, J. P. Shovelomics: high throughput phenotyping of maize (Zea mays L.) root architecture in the field. Plant and Soil. 341 (1-2), 75-87 (2011).
- Rogers, E. D., Monaenkova, D., Mijar, M., Nori, A., Goldman, D. I., Benfey, P. N. X-ray computed tomography reveals the response of root system architecture to soil texture. Plant Physiology. , (2016).
- Groleau-Renaud, V., Plantureux, S., Guckert, A. Effect of mechanical constraint on nodal and seminal root system of maize plants. Comptes Rendus De L Academie Des Sciences Serie Iii-Sciences De La Vie-Life Sciences. 321 (1), 63-71 (1998).
- Lin, Y., Allen, H. E., Di Toro, D. M. Barley root hair growth and morphology in soil, sand, and water solution media and relationship with nickel toxicity. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (8), 2125-2133 (2016).
- Wenzel, W. W., Wieshammer, G., Fitz, W. J., Puschenreiter, M. Novel rhizobox design to assess rhizosphere characteristics at high spatial resolution. Plant and Soil. 237 (1), 37-45 (2001).
- Spohn, M., Carminati, A., Kuzyakov, Y. Soil zymography - A novel in situ method for mapping distribution of enzyme activity in soil. Soil Biology and Biochemistry. 58, 275-280 (2013).
- Vollsnes, A. V., Futsaether, C. M., Bengough, A. G. Quantifying rhizosphere particle movement around mutant maize roots using time-lapse imaging and particle image velocimetry. European Journal of Soil Science. 61 (6), 926-939 (2010).
- Hewitt, E. J. Sand and Water Culture Methods Used in the Study of Plant Nutrition. , Commonwealth Bureau. London. (1966).
- Choudhary, M. I., Shalaby, A. A., Al-Omran, A. M. Water holding capacity and evaporation of calcareous soils as affected by four synthetic polymers. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 26 (13-14), 2205-2215 (1995).
- Bakker, P. A. H. M., Berendsen, R. L., Doornbos, R. F., Wintermans, P. C. A., Pieterse, C. M. J. The rhizosphere revisited: root microbiomics. Frontiers in Plant Science. 4, 2013 (2013).
- McNear, D. H. Jr The Rhizosphere - Roots, Soil, and Everything In Between. Nature Education Knowledge. 4 (3), 1 (2013).
- Ortas, I. Determination of the extent of rhizosphere soil. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 28 (19-20), 1767-1776 (1997).
- UC Davis Stable Isotope Facility. Carbon (13C) and Nitrogen (15N) Sample Preparation. , Available from: https://stableisotopefacility.ucdavis.edu/13cand15nsamplepreparation.html (2018).
- Barraclough, D. 15N isotope dilution techniques to study soil nitrogen transformations and plant uptake. Fertilizer research. 42 (1-3), 185-192 (1995).
- Belter, P. R., Cahill, J. F. Disentangling root system responses to neighbours: identification of novel root behavioural strategies. AoB PLANTS. 7, (2015).
- Nagel, K. A., et al. GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons. Functional Plant Biology. 39 (11), 891-904 (2012).
- Adu, M. O., Yawson, D. O., Bennett, M. J., Broadley, M. R., Dupuy, L. X., White, P. J. A scanner-based rhizobox system enabling the quantification of root system development and response of Brassica rapa seedlings to external P availability. Plant Root. 11, 16-32 (2017).
- Neumann, G., George, T. S., Plassard, C. Strategies and methods for studying the rhizosphere-the plant science toolbox. Plant and Soil. 321 (1-2), 431-456 (2009).
- Bodner, G., Alsalem, M., Nakhforoosh, A., Arnold, T., Leitner, D. RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (126), e56251-e56251 (2017).
- Kuchenbuch, R. O., Ingram, K. T. Image analysis for non-destructive and non-invasive quantification of root growth and soil water content in rhizotrons. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 165 (5), 573-581 (2002).
- Dresbøll, D. B., Thorup-Kristensen, K., McKenzie, B. M., Dupuy, L. X., Bengough, A. G. Timelapse scanning reveals spatial variation in tomato (Solanum lycopersicum L.) root elongation rates during partial waterlogging. Plant and Soil. 369 (1-2), 467-477 (2013).
- Wu, J., et al. RhizoChamber-Monitor: a robotic platform and software enabling characterization of root growth. Plant Methods. 14 (1), 44 (2018).
- Rogers, S. W., Moorman, T. B., Ong, S. K. Fluorescent In Situ Hybridization and Micro-autoradiography Applied to Ecophysiology in Soil. Soil Science Society of America Journal. 71 (2), 620-631 (2007).
- Eickhorst, T., Tippkötter, R. Detection of microorganisms in undisturbed soil by combining fluorescence in situ hybridization (FISH) and micropedological methods. Soil Biology and Biochemistry. 40 (6), 1284-1293 (2008).
- Spohn, M., Kuzyakov, Y. Distribution of microbial- and root-derived phosphatase activities in the rhizosphere depending on P availability and C allocation - Coupling soil zymography with 14C imaging. Soil Biology and Biochemistry. 67, 106-113 (2013).
- Lv, G., Kang, Y., Li, L., Wan, S. Effect of irrigation methods on root development and profile soil water uptake in winter wheat. Irrigation Science. 28 (5), 387-398 (2010).
- Asseng, S., Ritchie, J. T., Smucker, A. J. M., Robertson, M. J. Root growth and water uptake during water deficit and recovering in wheat. Plant and Soil. 201 (2), 265-273 (1998).
- Hernandez-Ramirez, G., et al. Root Responses to Alterations in Macroporosity and Penetrability in a Silt Loam Soil. Soil Science Society of America Journal. 78 (4), 1392-1403 (2014).
- Zhang, Y. L., Wang, Y. S. Soil enzyme activities with greenhouse subsurface irrigation. Pedosphere. 16 (4), 512-518 (2006).
- Robinson, D., Hodge, A., Griffiths, B. S., Fitter, A. H. Plant root proliferation in nitrogen-rich patches confers competitive advantage. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 266 (1418), 431-435 (1999).
- Lobet, G., Draye, X. Novel scanning procedure enabling the vectorization of entire rhizotron-grown root systems. Plant Methods. 9, 1 (2013).
- Swarup, R., Wells, D. M., Bennett, M. J. Root Gravitropism. Plant Roots: The Hidden Half. , (2013).
- Smit, A. L., Bengough, A. G., Engels, C., van Noordwijk, M., Pellerin, S., van de Geijn, S. C. Root Methods: A Handbook. , Springer Science & Business Media. (2000).
- van Dusschoten, D., et al. Quantitative 3D Analysis of Plant Roots Growing in Soil Using Magnetic Resonance Imaging1[OPEN]. Plant Physiology. 170 (3), 1176-1188 (2016).
- Metzner, R., et al. Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification. Plant Methods. 11, 17 (2015).
