Summary
两栖生物的研究为驱动许多类群生物体的生殖、生理、胚胎和发育过程提供了宝贵的信息。在这里,我们提出了一个全面的指导,不同的方法,可用于研究卵巢控制和监测在两栖动物。
Abstract
两栖动物的卵巢控制和监测需要多方面的方法。有几个应用,可以成功地诱导生殖行为和获取配子和胚胎的生理或分子研究。两栖动物对脊椎动物研究的贡献占四分之一,在这方面,他们感兴趣的是它们对科学界生殖过程和胚胎发育知识的贡献。然而,这些知识大多来自少数物种。近来,全球两栖动物的灭绝需要环保人士加大干预力度。因面临灭绝风险而继续出现的圈养恢复和保证殖民地,使得现有的研究和临床应用对于人类护理下两栖动物的生存和繁殖具有宝贵价值。任何圈养种群的成功都取决于其健康和繁殖能力,以及培育能够延续其物种最多样化的遗传表现的可行后代的能力。因此,对于研究人员和兽医来说,监测和控制卵巢发育和健康的能力势在必行。本文的重点是强调可用于监测并酌情控制两栖动物卵巢功能的不同辅助生殖技术。理想的情况是,任何生殖健康和健康问题都应通过适当的圈养减少,但与任何动物一样,健康和生殖病理问题是不可避免的。非侵入性技术包括行为评估、目视检查和触觉以及用于计算身体状况指数和超声波的形态测量。侵入性技术包括激素注射、血液采样和手术。卵巢控制可以通过多种方式执行,具体取决于所需的应用和感兴趣的种类。
Introduction
长期以来,两栖动物被广泛的研究学科所认可为重要的生物学和医学模型。通过研究特定物种获得的数据,如Xenopus laevis和X.热带,豹蛙(原拉纳)和阿索洛特尔(墨西哥阿姆比托马)已应用于许多其他脊椎动物物种,包括人类。研究这些两栖动物和其他两栖动物后产生的兽医、畜牧业和辅助生殖技术,为那些负责成功照顾、维持和维持圈养中稀有种群的人提供援助1,2,3,4.
兴趣正在增加,同时使用基于原地保护的方法,以扭转许多处于危险中的两栖物种1、2的灭绝潮。本文提供了目前可用于监测和控制阿努兰和考特斯模型物种中的两栖卵巢功能的方法。此外,还介绍了解决卵子保留常见生殖病理学的现有技术。
与许多分类组一样,两栖卵巢控制涉及环境和生理学之间的一系列紧密同步的相互作用。温度和光周期(称为近视信号)被眼睛和大脑解码,它们被迅速转换成遗传、荷尔蒙和昼夜过程(最终信号)3,4。本文介绍的监测和控制卵巢功能的方法包括侵入性和非侵入性技术。机构动物护理和使用委员会(IACUC)的研究和教学要求定义非侵入性技术,那些将造成最小至无身体疼痛或精神痛苦,不需要止痛药5。在这里,非侵入性技术包括目视检查和触觉、行为观察、形态测量和超声波。相反,采血、激素管理、手术(卵子切除术和取出保留的卵子)的技术被归类为侵入性,因为它们可能导致一些疼痛或不适,需要麻醉或手术后药物治疗。
非侵入性卵巢监测技术可以很容易地纳入大多数圈养两栖动物的日常护理程序。根据物种的不同,卵巢的重力通常可以通过简单的目视检查(玻璃青蛙)来确定。在其他情况下,触觉可能表明女性是否具有肉汁。各种身体状况指数(BCI),如体重,鼻孔型长度(SUL),鼻孔-通风长度(SVL)和标准质量指数(SMI)可用于预测卵子的存在或不存在4,6,7, 8,9.然而,应该注意解释结果,因为大多数人不考虑年龄,体形或组成(例如,水保留与卵巢质量或脂肪)6 。明确的生殖诊断可以通过超声波获得关于卵子发育和卵巢周期4,7的分期更深入的知识。超声波也提供了一种确认和监测生殖病理和相关生理状况的手段4,8。
除了提供有关健康状况的信息外,血液取样还可用于测量生殖激素。如果激素分析是最终目标, 重要的是要避免压力相关的影响, 可能会混淆系统类固醇数据.虽然一个潜在的强大的监测工具, 尚未有一项研究证明先天内分泌反应外源激素给任在任何两栖物种.血液可以从几个地点安全地取出;在青蛙中,这包括腹腔静脉、语言丛、股骨静脉和心脏9、10。在Caudates中,血液是从腹腔尾静脉采集的。在为两栖患者选择采集技术时,侵入性程度、所需的约束量、麻醉剂的需要、被攻击器官的美味度以及动物的大小都是需要考虑的因素。本文将介绍从青蛙的面部上颌或肌肉皮静脉采集血液的技术,如Forzan等人最初描述的。
卵巢控制是特定于物种的,因此,激素协议应进行测试和优化。除了季节性和相关循环激素环境,卵巢控制也可能与年龄、被囚禁时间以及反复服用激素密切相关,文献中的信息很少11,12,13.实施激素疗法,以引起生殖行为、药物产生、成熟和排卵已成为广泛报道的解决与圈养有关的常见生殖问题的方法4 8,14,15,16.由于控制脊椎动物繁殖的机制是高度保守的,有一些激素,神经肽和商用药物用于治疗其他分类组,也可以可靠地用于一些两栖动物物种(表1)。腺激素释放激素 (GnRH) 和人类胆囊性促性腺激素 (hCG) (或其变体, 即 PMSG 和 eCG)17,18,单独或组合, 已广泛用于两栖俘虏繁殖计划包括:南落基山(阿纳西鲁斯-罗塔斯)4、19、20;蛤, 杜斯基戈弗青蛙,拉纳塞沃萨(朗霍恩等人, 未出版)7;墨西哥湾沿岸水狗,内图鲁斯贝耶里20;怀俄明州蛤,阿纳西鲁斯巴克蒂18;牛蛙,拉娜卡茨比亚纳21;美国蛤,阿纳克斯鲁斯美国22;草蛙,林诺迪亚斯特塔斯马尼西斯23;科基,埃莱乌德·罗科伊图斯·科基24;异欧普,西诺普西莱维25;冈瑟的蛤蛤,普塞多夫林·甘特里26;北方豹青蛙,利托贝特皮皮恩;阿根廷角蛙,陶瓷华丽;克兰威尔的角蛙,C.克兰韦利;美国地面蛙,奥多托夫里努斯美国27;和火蜥蜴(萨拉曼德拉)228。类固醇激素,如孕酮(P4),是较少报道,但已表现出良好的疗效,在引排排和排卵在某些物种的阿努兰16,18,29.前列腺素(特别是前列腺素2-α(PGF2+)与皮质类固醇30、31、32、34一起参与排卵,并在排卵阶段31。
在体外研究中,PGF2+是排卵31的有力诱导剂,而在体内,它可以诱导拉纳肌肉4、30、32的保留卵子的排卵。纤维提取物也是排卵的有效诱导剂15,16,34;然而,在考虑这种方法时,对生物安全和疾病传播可能性的担忧往往对圈养繁殖地的阻碍。
本文的最后一节详细介绍了外科手术,并提供了其他方法来扩大卵巢研究或帮助解决生殖病理。在两栖动物中最常进行卵子切除术,以获得卵母细胞用于胚胎学研究。但是,当其他选项失败时,它还可以为保留的鸡蛋提供补救措施。虽然这个程序是侵入性的,需要完全麻醉和切口来暴露卵子质量,但它不需要安乐死。此外,在部分卵巢切除术后,动物可以完全恢复,并在手术后继续繁殖活跃。
下面描述的协议概述了在阿努兰和考斯进行卵巢控制和监测的侵入性和非侵入性方法。选择在阿努兰人中说明技术的特定物种包括粘胶和X.拉维瓦。Necturus maculosus、 N. Beyeri、 N. 阿拉巴门斯和A. 墨西哥构成用于类似描述考达特技术的物种.
Protocol
萨拉曼德程序由辛辛那提动物园和植物园 (CZBG) 机构护理和使用委员会 (IACUC) 协议 11-106、 13-110、 14-133 和 15-138 批准。所有青蛙和蛤类程序都通过了圣地亚哥动物园全球(SDZG),机构护理和使用委员会(IACUC)协议:15-001,16-005和18-003。
国家自然历史博物馆(巴黎)伦理委员会根据《国家自然史博物馆》和《植物保护》原则批准了动物的护理和治疗。(Génie Génétique委员会,《服务服务方向》,欧洲联盟第2010/63/欧盟指令,协议第20号决定。C75-05-01-2,用于实验和其他科学目的的脊椎动物欧洲公约。本研究中使用的所有协议均以参考号68-037获得批准。
1. 非侵入性卵巢监测技术
- 目视检查和触觉
- 用下面描述的三种方式之一握住女性阿努兰。
- 用戒指和小手指固定青蛙或蛤的腿,用食指和中指支撑青蛙身体的背侧(腹部),用拇指支撑腹腔侧(图1A)。
- 用拇指在腹部抓住青蛙或蛤蛤,其余手指固定动物的背部。使用非主导手来触手可及动物的腹部,感觉是否有皮下凸起(图1B)。
- 把青蛙或蛤的腹部放在手掌上,前臂覆盖在食指上,拇指放在上背部。
- 由于牛科特在自然界中是完全水生的,因此通过下面描述的两种方法之一进行目视检查。
- 将动物移到一个单独的 4 L 容器,其中包含水箱水。举起容器(盖固定),将手电筒照射在底面,以可视化鸡蛋的存在/不存在。
- 在 MS222 中麻醉 (0.5 g/L;三甲甲甲酸酯,缓冲0.5M NaHCO3。感应后,将动物旋转到背部并检查腹部。
- 用下面描述的三种方式之一握住女性阿努兰。
- 形态评估
- 阿努兰斯
注:无需麻醉。- 使用卡钳,测量动物从嘴尖,沿着身体的中心到尾巴的尖端,以获得SUL和SVL(图2A,B)。
- 以数字精密尺度处理塑料容器。将动物放入柏油容器并称重(图2C)。
- 对于较大的动物,如牛蛙,或在野外获得重量时,请使用悬挂秤(图2D)。
- 与许多阿努兰物种一样,根据体型较大和手上缺乏婚礼(拇指)垫来区分R.Muscosa成年雌性(图3)。
- 计算身体状况,作为对整体健康状况的基本评估,公式如下:
富尔顿的索引:K = 质量 = 长度3
注: 富尔顿索引使用与质量和长度相关的体积的维度平衡,其中3是以等轴测方式关联质量和长度的缩放指数。
- 考蒂
- 在将非麻醉动物放入内之前,用空袋子进行量表。注意不要引入多余的水(图2D),并迅速采取行动,因为动物分泌粘液作为被抑制的压力反应。
- 通过在可重新密封的塑料袋底部或可以容纳膨胀卡钳的单独塑料容器中固定个人,获得成人测量。
- 使用卡钳测量车身长度 (图 2E)。
- 测量从鼻尖到尾端 (SVL) 的翘尾,以监测生长。
- 阿努兰斯
- 行为观察
- 实时物理观察动物或使用摄像机记录行为。
- 记录动物观察对行为进行分类并构造一个内造图(图4)。
- 对生殖行为进行分类
注:图4举例说明了在阿努伦观察到的一种生殖行为。
- 超声
注:选择的超声传感器,在这种情况下,7.5 mHz线性或多频(10-6千赫)微凸,建议用于Necturus和10 MHz探头和水溶性,无盐凝胶R.mussa。 对蜥蜴进行超声波检查可能需要麻醉(有关说明,请参阅第 1.5 节)。- 阿努兰斯
- 使用两个人对R.Muscosa执行超声波检查(图5A)。
- 第一人称:用主导手握住动物,将水溶性、无盐凝胶涂在动物腹部。
- 第二人称(超超声学家):将10 MHz探头放在主导手上,并将其涂抹在腹部,确保探头与凝胶之间保持良好的接触。
- 从手臂坑下方向内滑动,朝动物腹部中线中心滑动,以可视化整个卵巢。
- 超超声学家:使用非主导手冻结帧,并在超声波上捕捉所需的图像。
- 根据为属4建立的分级系统对卵巢周期的阶段进行分类(表2,图5B-F)。
- 在手术结束时冲洗动物的任何凝胶。
- 考蒂
- 将非麻醉的Necturus转移到4L矩形容器中,里面装满了2L的水箱水。
- 通过关闭房间灯和/或将一只手托在动物头上,尽量减少动物运动。
- 将传感器放置在距车身壁 1-2 厘米的距离处。
- 找到心脏在腹腔中线水平到前肢,然后移动传感器出,并检查卵巢组织7。
- 根据为属4建立的分级制度对女性进行分类(图6A、B、C)。
- 当动物的身体与传感器成一定角度时(即,不是线性的,而是轻微的弧形的)时,通过捕捉图像,在中后期的重力阶段获得精确的卵子测量;图 6B.否则,重叠的卵泡使得很难区分单个卵子的大小。
- 阿努兰斯
- 麻醉诱导和恢复
- 阿努兰斯
- 在 MS222 中麻醉 (0.5 g/L;如前所述,三氧化二甲酸酯缓冲(0.5M NaHCO3)。
- 使用正确的反射作为动物麻醉程度的主要指标。完全反射损失表明深度麻醉状态。
- 一旦正确的反射丢失,将动物从水浴-基于麻醉(MS-222)中取出。
- 将动物放在湿毛巾上(用无麻醉剂脱氯水)。
- 在整个外科手术过程中,确保保持动物的湿润。
- 用红色橡胶导管、未铐住的管子或经典袖口内切管插入小型两栖动物,而不会使袖口膨胀。
- 提供低流量的氧气(0.5-0.75 升/分钟),含0.5-1%的非氧。
- 手术后停止共和体,但保持氧气流动1分钟。
- 给动物排泄,用无麻醉的脱氯水彻底冲洗动物2分钟。
- 将动物放入浅量的去氯化水中或湿毛巾上。
- 通过轻轻拉动后肢以拉长,评估动物的恢复情况。肢体的任何反应收缩都表示戒断反射。
- 监测其他恢复指标,如肺气囊呼吸(咽喉运动)和右反射。
- 考虑当所有反射都恢复的两栖动物,心脏和呼吸速率已恢复到麻醉前值。
- 考蒂
- 在MS222(0.5克/升三甲甲酸酯)中麻醉Necturus和Ambystoma,在4L矩形罐中用0.5M NaHCO3(MS222)缓冲。
- 将空气石(1 英寸)和空气泵放入油箱,并将其打开至恒定的流量,以提供足够的氧合。
- 当肢体功能和右反射丧失时,将动物从水浴-基于麻醉(MS-222)中取出,并将动物放在湿毛巾上(无麻醉脱氯水)。
- 用一瓶罐水挤压保持皮肤和刺的水分。
- 为了找回动物,小心地将其放在一个4L的塑料容器中,里面装满了2L的水箱水,里面装有空气石。
注:恢复从刺闪烁开始,然后是移动尾巴和向前推进,最后四肢功能运动的能力。 - 在接下来的 24 小时内,将动物返回到其原始外壳水箱并密切监控。
注:两栖动物的其他麻醉方法存在,这些方法在赖特和惠特克8中描述。
- 阿努兰斯
2. 侵入性卵巢监测和控制技术
注:这个程序已经适应了Forzón等人10。
- 抓住青蛙在占主导地位的手,用无菌抹布或纱布擦干青蛙脸上的静脉穿刺侧。
- 擦干面部,避免血液过多地分散在皮肤上。
- 插入针头(26 G 1/2"和 27 G 1/2"),斜面朝上,穿过眼部周围凸起的皮肤和上颌脊相接的皮肤,形成三角形的点(黄色轮廓)(图7A),接近面额面部护理维纳轨道后。
- 刺穿右眼下方和上颌脊上方的面部静脉,从眼睛中线回到1-2毫米之间(图7A)。
注:对于较小的青蛙(低于 20 g),将插入点移近于眼睛中线正下方的位置。 - 将微造血球管向下倾斜,使重力帮助血液流入管中。穿刺后血液应立即流动(图7B,C)。
- 在血流的第一个迹象,将微血球菌管的尖端放在穿刺部位,收集1-2个满的微血球管,并将管子放入适当的贮器中进行收集(图7B,C)。
- 如果血液不能轻易流动,或体积非常低,则稍微移动插入针头或将针头插入面部的另一侧。
- 将纱布牢固地压到穿刺部位至少 20 秒,从而停止出血。
- 将青蛙从水中离开10分钟,以确认穿刺部位不重新开放。
- 对取样的每个青蛙使用新的针头和新的微血红管。
3. 激素诱导
- 激素制剂
- 在使用前立即准备激素注射,以确保最大效果。
- 从表1中列出的选择中选择一种激素。
- 使用体重16的μL或mL/g确定要注射的激素的浓度。
- 稀释激素在以下之一:水,磷酸盐缓冲盐水(PBS),盐水两栖环线溶液(SARS)或盐水。
- 对于体重为 30-70 g 的青蛙,不要超过 200 μL 的注射体积,对于体重为 80-110 g 的青蛙,不要超过 200 μL 的注射体积(个人观察)16。
- 为了在激素给养过程中正确持有10-100克的任何动物,请使用第1.1节所述的任何适当方法进行饲养。
- 阿努兰斯
- 使用每体重计算一克(g/体重),计算每人所需的浓度。
- 就在管理之前,在无菌稀释物的选择中重新组织。
- 在注射前,确保注射器中未留有气泡。
- 将动物牢牢地握在非主导手上,用主导手进行注射。
- 根据激素规格进行注射。最常见的注射在阿努兰是下皮,腹内或肌肉内(图8)。
- 在腹部下部或靠近后腿的身体部位或下部进行IP注射(图9)。
- 最好在后腿上进行肌肉内注射。
- 考蒂斯 (内图斯)
- 根据上述每个体重的克法,在无菌水中重组选择的激素。
- 在Necturus的情况下,使用1.7-2.3 μg GnRH/g体重的剂量。
- 从麻醉室中取出Necturus,放在45°表面上,上面覆盖着手术窗帘。
- 用头朝下放置动物。
- 以 15-20° 角度接近腹部的后象限(后腿的尾部)。小心不要将空气引入注射器。
- 使用胰岛素注射器和 27-30 G 针头注射 (IP)。
- 使用胰岛素注射器和27-30G针头注射激素。
4. 外科
- 一般手术准备和程序
- 要维持无菌程序,请使用透明无菌塑料窗帘隔离手术部位。通过保持周围皮肤湿润来减少蒸发。
- 用无菌水润湿任何会接触动物皮肤的材料。使用 15 号或 11 号手术刀进行皮肤切口。
注:冷钢、放射外科或二极管激光的组合。轻度出血手术中的止血可以通过电烧机或二极管激光来实现。 - 使用棉尖矛或施用器,允许对小血管施加局部压力,以跟踪失血情况。
- 使用棉尖长矛或施用器管理小密闭空间,而不是标准纱布方块。
- 对体重小于1公斤的动物进行手术时,使用微型仪器,如眼科仪器,用细小的提示。
- 使用塑料、自固定式缩回器(例如,孤星缩回器)来安装不同尺寸的切口。
- 使用眼睑缩回器缩回眼缩切口。
- 必要时使用放大仪器对小患者进行手术。
注:两栖动物的任何外科手术都需要麻醉。在手术期间未能给予适当的麻醉,与正常功能的延迟恢复有关。此外,麻醉剂可有效麻醉药物的作用(表3)34。
- 阿努兰斯
- 一旦X.laevis被麻醉,如步骤1.5.1所述,将动物置于背退性(图10A,C)。
- 在手术现场用稀化波维酮碘溶液(1/10)在手术部位用10-15s或0.75%氯西丁溶液在手术现场至少10分钟进行无菌处理。
- 在中圆锥体(肩部和氯卡之间)进行 3 mm 的副中位皮肤切口,用一条大胆的笔触留下一个干净的切口,使用 15 号或 11 号手术刀。
注:可以使用二极管激光也用于皮肤切口。 - 抬起腹膜,制作和切口,并使用15号或11号手术刀仔细解剖。(图10B,D.
- 用眼睑缩回器(或任何适当的设备)缩回眼缩切口。
- 去除一部分蛋质量,而不沾上任何血管。
- 对于完整的卵巢切除术,通过电烧或激光二极管烧灼周围血管(图11)。
- 使用单丝缝合线,关闭切口与中断,不断缝合模式。
- 考蒂
- 一次墨西哥已经麻醉,把它放在右侧复位,左骨盆肢体简单地放在对尾基。
- 将湿润无菌纱布与稀化的化比酮碘溶液(1:10)放在现场10-15秒,无菌地准备手术现场。 或者,使用浸泡在0.75%氯西丁溶液中的无菌纱布,并在手术现场放置至少10分钟手术前(图12A)36,37。
- 在肩部和后肢之间画一条线,将身体分成三个相等的部分(图12B)。
- 在第二和第三部分之间制作切口点。
- 抓住底层肌肉,从神经质上提升。
- 轻轻地用力通过粘膜将小血小气囊进入腔腔。
- 用眼睑缩回器(或任何适当的材料)缩回眼缩切口(图12C)。
- 对于完整的卵巢切除术,通过电烧或激光二极管烧灼周围血管(图12D)。
- 使用单丝缝合线,关闭切口与中断,不断缝合模式。
Representative Results
形态测量和复制
两栖动物雌性生殖状况的可视化因物种而异。最有效的方法是超声波;然而,有些物种的皮肤可能表现出不同程度的透明度(图13A,B,C)。目视检查通常可以清楚地说明,当皮肤是半半透明的皮肤时,肉质和非肉质女性之间的差异,如在N.alabamensis和N. maculosus中观察到的(图13A,B);或半透明,如玻璃青蛙所示(图13C)。N. beyeri腹部的深色斑点皮肤着色禁止进行这种评估。在R.mussa中,皮肤不是半透明的,但与最近因皮肤松弛而排卵的雌性相比,可以检测到明显的差异,而且动物看起来比女性是重力(蓝线) (图 13D).根据经验,处理者可以熟悉大女性和重力阶段之间的差异,但确认重力阶段将需要超声波。两栖动物的身体质量指数可以用多种公式计算,但它们作为生殖预测工具的应用是有争议的。在R.Muscosa的案例中,富尔顿的指数、健康和生殖状况之间的相关性仍然不清楚。
生殖行为和超声波
我们的结果表明,如何描述R.Muscosa的生殖行为,以预测排卵(图4)。几个阶段持续几个小时到几个星期,包括,求求其中,男性积极追逐一个女性(图4A),男性的坐骑和紧紧地扣在女性的背部,称为丰满(图4B)。一旦充分,配对可以保持充足1-5周,配对将显示其他行为,除了丰满。Amplexus是一种非常活跃的行为,包括男性以软抽水方式挤压女性(图4C);女性移动,并开始间歇性地显示手站行为(图4D,E);和接近排卵的时间,女性,在手站,将俯身表面,她可以粘鸡蛋,而男性泵她的腹部大力(在这种情况下,也可以观察女性摩擦她的腹部向下从下面她的手臂坑对马卡。这可能是一种机械的方式,用推鸡蛋下来的卵形(图4F,G)。
这项研究说明了超声波如何提供信息,以确定女性R.Mussa和Necturus的生殖状态。四个发展阶段在R.muscosa(图5C,D,E,F)中表示,在Necturus4中具有类似的特征(图6A,B,C)。此外,残留的卵子不能排出,导致卵子保留(图5G,图15A,B)。阶段 1 直接显示卵泡在卵泡难以可视化的卵泡后(图5C)。阶段 2 由分散在卵巢中的回声点(白色斑点)的外观表示(图 5D)。阶段 2 和 3 由较大的圆形回显点表示,其暗中心表示带锁的中到大卵泡(图 5E,F)。从2013-2017年,被俘女性Necturus每月接受超声检查。在每次考试中,根据为属建立的生殖标准,为个人分配一个分数(表2)。女性每年发育新蛋的比例平均为88.2 ~3.01%(表5)。虽然卵子发育较高,但卵子的排位没有得到保证(图16)。大多数接受卵子的雌性沉积了全部卵子,而有些人只沉积了发育的卵子的一小部分。那些留存卵子与体腔中液体增益相伴的R.mussa和Necturus雌性在视觉上被外在视觉上放大,皮肤上的红色斑块与破裂的血管一致(图14A,B) .流体滞留程度可通过超声波进一步评估(图15B)。在这两个物种中,保留的卵子都经历了闭塞或出现更回声的外观(图14C,D,图15A)。
激素管理
根据注射的深度,针的角度和深度会有所不同。对于大多数注射,针的深度不必超过1-2毫米深,当与物种,如R.muscosa,但会因穿透角度而变化。前列腺素注射需要肌肉内(im)针插入角度在90°,到R.Muscosa的后腿,而腹膜内(ip)注射,与肌肉内注射相似的深度,在区域施用45°的腔腔(图10)。与对照组相比,Amphiplex的给给增加激素处理女性沉积的卵子数量没有显著效果(P = 0.547),也没有任何差异,在胚胎数量上,被分块(P = 0.673)或存活到小白(P = 0.673)的胚胎数量也没有任何差异。0.629 ) (表 4.一般来说,女性排卵率从2011年的80%下降到2014年的28%。2015年排卵的女性人数明显高于2013年(P = 0.0002)、2013年(P = 0.0001)和2014年(P = 0.0026),但2011年没有(P = 0.0885),这再次表明该物种的雌性不得每年繁殖,激素协议需要重新繁殖内门特。对于有卵子保留迹象的R.Muscosa女性,在肌肉内注射PGF2+在诱导排出退化卵子方面有60%的成功率。然而,在注射的5只雌性中,有1只PGF2+不足以引起完全驱逐,有些卵子一直留在雌性体内,直到下一个繁殖季节。十七名内风机女性接受LHRH/(GnRH),13人接受假注射无菌水作为对照(表5)。总共,七个雌性Necturus(n = 4个雪花气,n= 2贝耶里,n = 1个马丘洛苏)去oviposit1个全离合器,这归因于GnRH处理(n = 6)和控制(n = 5)个人。三个雌性 (n = 2贝耶里,n = 1 maculosus) 排卵五个部分离合器 (图 13)。这种现象似乎与外源激素治疗无关,因为三个对照女性同样沉积部分离合器(表5)。在5年的37天(3/31-5/7)时间范围内发生(表5)。LHRH/GnRH 处理的排位率(41 ± 13.08%,范围 17-67%)之间没有差异(P = 0.194)和控制 (66.75 × 11.79%, 范围 50-100%)女性。LHRH/GnRH治疗女性在注射后平均沉积7.44~1.41天(范围3-13)。鉴于该物种完全水生性质,且无法在没有麻醉的情况下手动抑制,有必要在进行IP激素注射之前确保适当的镇液水平(有关麻醉的说明,见第3.2节)。
采血、麻醉和手术
本文中的血液取样技术取自Forzan等人2013年10,并证明是一种有效的方法,从R.Mussa采集血液,具有最小的侵入性和压力。使用微血球菌管,每70μL全血可采集约35-45μl的血浆或血清(图7)。R. muscosa的最大收集量为每 10 克青蛙 1 个全微血肉管,青蛙 40 克及更大,每只青蛙最多 4 管。这是一个保守的收集量0.7 mL每100克,70%的最大建议1.0 mL每100克(改编自Allender和Fry,2008年)13。
两栖麻醉和手术很少报道,但需要注意的是,剂量和疗效将以物种特定的方式变化。例如,在波比纳东方,MS222具有非常低的效果,即使在高剂量(1克/升),而在博雷亚尔蛤,阿纳西鲁斯孔萨,1克/L是快速(分钟)和长期(3+小时)(卡拉塔尤德,个人观察)。在R.Muscosa中,麻醉需要报告A.sandas的剂量,并且具有类似的效果和恢复时间。麻醉前的禁食两栖动物通常不需要,因为他们的喉部即使在一般麻醉下仍然紧密闭合。然而,如果认为有必要,特别是如果麻醉程序是包括子宫手术,动物可以在麻醉前24小时禁食。
在手术过程中,正确的反射是动物被麻醉的主要指标。正确的反射是动物在背上被放置后可以回到直立位置的能力和程度。反射的丧失表明麻醉的轻阶段。手术平面指示的退出反射的损失,包括轻轻拉肢拉直它和动物不再能够收回它7。生殖手术没有压倒性的障碍,两栖动物主要愈合良好,容忍失血多于高脊椎动物。手术应该迅速进行,从开始到结束持续约15分钟。步骤的定时时间应大致如下:初始切口为<1 分钟,用于切除和伸缩器插入,<2-3 分钟用于每个卵巢的隔离,<1 分钟用于血管缝合或缝合和皮肤缝合 <4 分钟。MS222协议手术后的总恢复时间约为45分钟,但这可能是物种特定的。在A. 孔罗萨和R. 肌肉的恢复时间可以更长, 长达 1 – 2 小时.做手术时,必须小心避免刺穿肺部、胃肠道或扩张的膀胱,不要损坏大腺、淋巴心脏和血管,尤其是中腹静脉。根据季节的不同,大脂肪体的存在会使其他器官的可视化变得困难。一旦明显清醒,动物对肢体刺激的反应,如对后肢的轻微伸展的抵抗力,或在眼睛周围区域受到刺激时眨眼(个人观察),被归类为戒断反应。正确的反射以及其他恢复指标,包括,戒断反射和球状运动,是恢复的重要指标。
| 管理 | ||||||||||
| 通用名称 | 物种 | 激素 | 程序 | 起刺激化合物 | 报告起药剂量 | 注油剂量数 | 定时(排卵剂量前的时间) | 用于最终排卵/排卵的化合物 | 剂量 | 参考 |
| 波多黎各的尖头蛤 | 佩尔托夫兰狐猴 | GnRH 和 hCG | Ip | Hcg | 1.5 IU/g | 2 | hCG - 48 | GnRH;hCG;格恩哈 = hCG | 0.2 μg;4 IU;0.5 μg = 4 IU | 卡拉塔尤德等人未发表 |
| 山黄腿蛙 | 拉纳·穆斯科萨 | 脱皮, 卢特 | Ip | GnRHa (d-Gly10, D- 阿拉6, 亲 NHEt9-GnRH) | 0.4 微克/克 | 1 | 24 | GnRH = MET | 1 x 0.4 μg/g = 10 μg/g | 卡拉塔尤德等人,2018 |
| PGF2| | 我 | PGF2* | 5 纳克/克 | 1 | 48 | PGF2* | 5 纳克/克 | |||
| 南落基山北方蛤 | 阿纳西鲁斯·博塔斯 | hCG, GnRH | Ip | Hcg | 3.7 IU/g | 2 | 96, 24 | hCG = 格恩哈 | 13.5 IU/g = 0.4 μg/g | 卡拉塔尤德等人,2015年 |
| 北方板球青蛙 | 阿克里斯·克雷比坦 | 安菲普斯 | 加到水中 (10 mL) | 没有 | 没有 | 0 | 那 | GnRH = MET | 0.17 μg = 0.42 μg / μl | 斯奈德等人,2012年 |
| 北方豹蛙 | 利托贝茨·皮皮恩斯 | 安菲普斯 | Ip | 没有 | 没有 | 0 | 24 | GnRH = MET | 1 x 0.4 μg/g = 10 μg/g | 特鲁多等人,2010年 |
| 阿根廷角蛙 | 陶瓷奥纳塔 | 安菲普斯 | Ip | 没有 | 没有 | 0 | 24 | GnRH = MET | 1 x 0.4 μg/g = 10 μg/g | |
| 克兰威尔的角蛙 | 塞拉托瑞斯·克拉韦利 | 安菲普斯 | Ip | 没有 | 没有 | 0 | 24 | GnRH = MET | 1 x 0.4 μg/g = 10 μg/g | |
| 美国地面青蛙 | 奥多夫里纳斯美国人 | 安菲普斯 | Ip | 没有 | 没有 | 0 | 24 | GnRH = MET | 1 x 0.4 μg/g = 10 μg/g | |
| 杜斯基·戈弗青蛙 | 拉纳·塞沃萨 | hCG, GnRH | Ip | Hcg | 3.7 IU/g | 2 | 96 , 24 | GnRH = hCG | 1 x 0.4 μg/g = 13.5 IU/g | 格雷厄姆等人,2018 |
| 普通科基 | 埃利乌塞罗科伊鲁斯·科基 | 鱼、禽、哺乳动物和GnRH(D-阿拉,德格利,eth LHRH),hCG | Sc | mLHRH; aLHR;fLHRH;格恩哈;Hcg | 没有 | 0 | 那 | mLHRH; aLHR;fLHRH;格恩哈;Hcg | 7μg, 33μg;28μg;7μg,20μg;5, 10, 15, 20 μg;165 IU | Michael等人2004年 |
| 冈瑟的蛤蛤 | 伪弗林·甘特里 | Gnrh | 格内哈 | 0.4 微克/克 | 1 | 26 | GnRHa 带或不带质数 | 0.4 微克/克 | 西拉 2010 | |
| 科罗博里青蛙 | 伪复印佐罗布 | 卢吕林 | Sc | 卢吕林 | 1 μg | 1 | 26 | 卢吕林 | 5 μg | 拜恩和西拉,2010 |
| 北科罗博里青蛙 | 伪弗伦·彭吉莱伊 | GnRHa GnRH (D-阿拉, 德格利, eth LHRH) | 塔 | 没有 | 没有 | 0 | 那 | 格内哈 | 0.5 -2.0 μg/g | Silla等人,2017 |
| 海湾海岸水狗 | 内图鲁斯·贝耶里 | [d-Gly10, D-Ala6]-LhRH-RH 乙酰胺醋酸盐水合物 | Ip | 没有 | 没有 | 0 | 那 | 人权 | 100 μg / 500 μL | 斯托普斯等人,2014年 |
| 南方钟蛙 / 咆哮草蛙 | 利托里亚·拉尼皮斯 | 德格利10, D-阿拉6-[LHRH] | Sc | 没有 | 没有 | 0 | 那 | 德格利10, D-阿拉6-[LHRH] | 50 μg | 曼恩等人,2010年 |
| 福勒的蛤蛤 | 阿纳克斯鲁斯·福勒尼 | GnRH, hCG, P4 | Ip | Hcg | 3.7 IU/g | Browne等人,2006年 | ||||
| 阿索洛特尔(墨西哥蜥蜴) | 安比托马墨西哥 | 卵泡刺激激素 | 我 | 没有 | 没有 | 0 | 那 | Fsh | 400IU | 特罗蒂埃和阿姆斯特朗,1974年 |
| 非洲爪蛙 | 西诺普·莱维斯 | hCG 和 P4 | 加水;Ip | PMSG, hCG | 马切克 , 2016 | |||||
| 老虎蜥蜴 | 安比托马·蒂格林姆 | hCG, LH | ||||||||
| 怀俄明州蛤 | 阿纳西鲁斯·巴克蒂 | hCG, GnRHa, P4 | Ip | hCG = 格恩哈 | 100 IU = 0.8 μg | 1 | 72 | hCG = 格恩哈 | 100 IU = 0.8 μg | Browne等人,2006年 |
| 北方豹蛙 | 利托贝茨·皮皮恩斯 | 皮尿提取物 (PE), P4, 睾酮 (T), 皮质酮 [C], 复方, 多佩里酮 (D) | SC, 知识产权 | 没有 | 没有 | 0 | 那 | PE、PE+T、PE+P4、PE+C;杂物, GnRH = D | ±100 IU (LHRH) 在 1 mL;PE=0.002μg/μL;PE=0.01毫克/50mL;PE=0.1mg/50mL;0.4 μg/g = 10 μg/g; 0.4 μg/g = D | 赖特,1961年;堡,2000年;特鲁多等人,2013年 |
| 地面青蛙 | 林诺迪纳特斯塔斯梅尼西斯 | 皮命提取物,hCG,GnRHa,PZ | Ip | 格内哈 | 0.9-1.2μg/g = PZ 10 μg/g | 1 | 20 | PE;PE = hCG;GnRH = PZ | PE 卷;PE vol = 100 IU hCG;GnRH (0.9-1.2μg/g) = PZ (10μg/g) | Clulow等人,2018 |
| 绿色和金钟青蛙 | 利托亚·奥雷亚 | Gnrh | Ip | 格内哈 | 10 μg | 1 | 72 | 格恩哈 = hCG | 20 μg = 300 IU | Clulow等人,2018 |
| 大禁区青蛙 | 混合法西奥拉图斯 | hCG 和 PMSG | Sc | PMSG, hCG | 50 IU 和 25 IU;1x100 IU | 2;2 | PMSG-144 & 96; hCG-24 | Hcg | 100IU | Clulow等人,2012年 |
| 有关更多激素协议和物种,请参阅赖特和惠特克,2001 | ||||||||||
表1:两栖动物物种和一些外源性激素测试他们如文献报告。人类胆囊性促性腺激素(hCG);腺激素释放激素 (GnRH);润滑激素释放激素 (LHRH);字母m、a和f表示"哺乳动物","鸟"和"鱼";怀孕的马血清促性腺激素(PMSG);孕酮(P4);卵泡刺激激素FSH);垂体提取物;睾丸激素 (T);皮质酮(C)。列出的多巴胺拮抗剂包括:多佩里酮(D);皮莫齐德(P);甲氯酰胺(MET)。二甲苯是一种由GnRH和甲酰胺27组成的化合物的名称。Lucrin 是一种市售的 GnRH 激动剂,其活性成分是醋酸露素。4,7,17,18,19,20,26,27,38,39,40,41,42,43,44,45
| 年级 | 生殖状况 | 描述 |
| 0 | 非重力 | 看不到鸡蛋。 |
| 1 | 早期重力 | 可见的鸡蛋(1-2毫米大小)没有与卵子相关的明显回显线。 |
| 2 | 中凹 | 鸡蛋大小2-3毫米,与每个卵子相关的明显的回声线。 |
| 3 | 晚期重力 | 鸡蛋大小4-5毫米,回波线仍然可见,鸡蛋的异音外观明显增加。 |
| 4 | 保留的鸡蛋 | 内部蛋结构中存在的不同程度的回波材料,呈非形态。有些可能变得非常回声,并与体腔中的液体保留相关。 |
表2:用于对被俘女性内图鲁斯的生殖状态进行评分的分级系统拉纳·穆斯科萨通过超声摄影。
| 药物 | 剂量和路线 | 注释 - 参考 |
| 布雷诺芬 | 50毫克/千克(前体) | 在东部红斑纽特(诺托塔尔穆斯维里森)的实验研究。手术前应给予麻醉。(科勒,2009) |
| 布特利诺尔 | 1 = 10 毫克/千克(IM 或回溯) | 有各种具体责任。建议从1毫克/千克开始。 |
| 布特利诺尔 | 0.5毫克/升(浴) | 在东部红斑纽特(诺托塔尔穆斯维里森)的实验研究。(科勒,2009) |
| 芬太尼 | 1毫克/千克 | 麻醉 [gt; 4 h,由纳曲酮对抗 (史蒂文斯, 1997) |
| 梅洛西坎 | 0.1 至 0.2 毫克/千克(IM) | (2011年,Minter) |
表3:两栖动物麻醉食症议定书。
| 拉纳·穆斯科萨 | ||
| 年 | 2014年 | 2015年 |
| ♀号 | 18 | 18 |
| 鸡蛋发育 | 61% | 94% |
| 控制♀ | 4 | 6 |
| 安菲♀ | 4 | 7 |
| 平均日后两栖到奥皮西特 | 10.5 | 10.9 |
| 排位率(杂波) | 22.20% | 33.33% |
| 排位速率(控制) | 22.20% | 38.88% |
表4:两栖治疗与对照圈养女性生殖参数的比较拉纳·穆斯科萨2014 年和 2015 年。
| 内图鲁斯sp. | |||||
| 年 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| ♀号 | 6° | 7 | 7° | 7° | 7° |
| 鸡蛋发育 | 83% | 100% | 86% | 86% | 86% |
| LHRH ♀ | 3 | 5 | 3 | 6 | 0 |
| 控制♀ | 2 | 2 | 3 | 0 | 6 |
| LHRH 到 奥波西特的一天 | 5 | 7 | 5.5 (范围 3 - 8) | 13 | 不适用 |
| 排位率 (LHRH) | 60% | 20% | 67% | 17% | 不适用 |
| 排位速率(控制) | 50% | 50% | 100% | 不适用 | 67% |
| • n=1 ♀无卵子发育 | |||||
表5:LHRH的生殖参数比较(GnRH)-处理和控制(无菌水)俘虏女性内图鲁斯在5年内从三个物种(2012-2017.
图1:三种抱青蛙的方法。(A) 程序 1.(B) 程序2.(C) 程序 3.请点击此处查看此图的较大版本。
图2:形态评估。(A, B)SVL/SUL (C, D) .重量,在R.Muscosa和D.Necturus。(E. 使用卡钳测量尺寸.请点击此处查看此图的较大版本。
图3:与女性相比,成年R.Mussa男性的婚式拇指垫以性别二态性而著称。(A)女性(B)男性.下面板显示男性与女性的长度。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:描述导致R.Muscosa排卵的生殖行为(A) 求求.(B) 安普尔苏斯.(C) 男性挤压女性,而在丰满的。(D, E)在手架上,有丰满的女性。(F, G)腹部收缩和排卵。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:根据发育阶段4,对具有生殖状态的R.Muscosa A-B进行超声波检查。 (A, B) 对拉纳肌肉进行超声波检查.(C) 0级.(D) 一年级.(E) 二年级.(F) 三年级.(G) 4级(卵子和保留的鸡蛋)请点击这里查看这个数字的较大版本。
图6:Necturus的超声图像。(A) 一年级.(B) 二年级.(C) 3级鸡蛋.请点击此处查看此图的较大版本。
图7:在R.Muscosa中采集血液。(A) 通过刺穿轨道,在轨道中间的下颌线上方面部静脉的后部进行血液采集。(B, C)血液被释放到皮肤表面,用肝素毛细管收集。请点击此处查看此图的较大版本。
图8:两栖动物的注射方法。根据注射的深度,针的角度和深度会有所不同。请点击此处查看此图的较大版本。
图9:R.Muscosa中的激素注射。在拉纳肌肉雌性注射腹膜内两栖细胞内通过激素治疗诱导排卵。卵巢可以在腔腔中找到请点击这里查看此图的较大版本。
图10:手术前的准备。(A) 使用稀波维酮-碘溶液(1/10),甲脑大体树脂的无菌制备手术区域。(B) 清洁手术刀切口在Xenopus laevis或 (C) 激光二极管皮肤切口,利托贝特分类。(D) 避免损坏中腹静脉,即颅内树脂。请点击此处查看此图的较大版本。
图11:异种病毒切除术。(A) 暴露和移动大脂肪体以发现蛋体.(B) 切除一部分蛋团,而不沾上任何血管。(C) 通过电灼热对周围血管进行烧灼,以进行完整的卵巢切除术。请点击此处查看此图的较大版本。
图12:A.墨西哥的手术前准备和卵巢切除术。(A) 无菌纱布浸泡在,0.75% 氯西丁溶液应用于手术部位 (B).肩部和后肢之间的一条线将动物分成三个相等的部分,蓝色斑点在切口上标记地点。(C) 用眼睑缩回器缩回眼缩切口。(D) 进行完全的卵巢切除术,用电灼热烧灼周围血管。请点击此处查看此图的较大版本。
图13:生殖阶段的视觉评估。(A, B)通过半透明皮肤,Necturus对生殖阶段进行视觉评估。(C) 半透明皮肤,紫杉醇(玻璃青蛙).(D) 在(右、蓝线)和排卵后(左- 黄线)对R.mussa进行目视评估。请点击此处查看此图的较大版本。
图14:鸡蛋保留。(A, B)女性拉纳肌肉与严重的鸡蛋保留病例。(C) 超声波显示老退化,鸡蛋(上)和更大的鸡蛋(中和底部面板)排卵和被困在球状。(D) 人工剥去取回的留存蛋。请点击此处查看此图的较大版本。
图15:在Necturus中保留的卵子的超声图像,a在外观(圆形)上变得回波,并且与(B)体腔(箭头)中的液体保留有关。请点击此处查看此图的较大版本。
图16:与未排卵的被俘女性Necturus相比,可切除全部或部分离合器的百分比(2013-2017年)。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
直接处理、目视观察和形态测量提供了非侵入性技术,是确定女性生殖阶段的首要评估标准。然而,这项研究表明,肉体卵巢并不总是通过触觉可靠地识别。根据物种的不同,重力卵巢有时可以通过动物腹侧半透明(图13A,B)或完全半透明的皮肤进行目视检测(图13C)。完成排卵的女性与肉体女性相比,其外观可能有明显变化(例如,皮肤松弛,身体质量损失高达30%,图13D)。在繁殖过程中,雄性和雌性将表现出某些行为,这些行为提供有关接近排卵和排卵的信息。在R.muscosa的情况下,表明女性接近排卵开始与女性进入手架。
超声波技术在阿努兰和考斯的影响下应用,可以诊断卵子是否存在,以及排卵是否与发育的卵子的完全或部分释放有关。因此,这种方法提供了更完整和准确的生殖状态评估,而不局限于通过可视化技术确定肉体/非肉体状态,这种可视化技术因腹部皮肤透明度或表皮一致性而变化。不同的两栖动物物种。超声波可以相对容易地进行,对动物几乎没有压力(图5和图13),并可用于描述生殖周期和确定生殖状态4。熟悉物种至关重要;然而,这项研究显示,Necturus和R.Muscosa在其生殖模式中有着共同的发育迹象,允许对生殖阶段进行类似的分类(图5)。通过这项技术,现在有证据表明,在圈养的Necturus和R.Muscosa中,卵子发育高度,而且这两种物种都遵循季节性模式。虽然这些现象的原因不明,需要进一步调查,如果不使用超声波,卵巢功能障碍的几个领域,如卵子保留和部分排卵,将不被发现。今后应用这项技术将用来确定是否应选择雌性在任何特定年份繁殖,以及是否完成排卵。
血液收集协议,如在R.Muscosa中提出的,它既有效,对动物造成最小的痛苦,是研究圈养和野生捕获的阿努兰人(Calatayud,未发表的)激素的最佳状态。迄今为止,没有关于圈养R.Mussa的年度激素概况的信息,因此,没有关于激素如何影响其健康和繁殖的知识。此外,随着证据表明,该物种的雌性可能不是年度育种者,荷尔蒙分析将是跟踪卵巢周期的另一种方法。与超声波一起, 激素分析可能导致更好的预测什么女性将准备排卵.此外,在过去一年里,有两例圈养的R.Mussa种群的两例性间病例记录在案。此外,拇指垫的发展已经注意到一些较老的创始女性。原因目前正在调查之中,但初步结果显示,这可能与睾丸激素水平的变化(卡拉塔尤德,未发表)。不同年龄的女性的荷尔蒙周期将帮助我们理解为什么女性可能发展男性相关的继发性特征,以及这是否是预期在老龄化人群中。
外源激素疗法已用于克服在圈养两栖动物中经常遇到的生殖功能障碍。然而,在这项研究中,对于R.mussa和Necturus种群,分别在2年和5年的时间里,在激素治疗和对照女性之间的排卵位没有显著差异。这可能表明激素给药协议, 剂量, 启动和激素组合使用是不够的物种.对个体女性生殖史的更仔细分析表明,R.Mussa可能没有每年繁殖,这也可能导致治疗女性缺乏荷尔蒙效应。因为每年有一定比例的雌性不断跳过繁殖,了解该物种的自然历史有助于确定是否需要外源性激素以及何时可能最有效。本文中概述的程序可适用于若干物种(表1),适用于5g至150g的阿努兰;较大的动物可能需要不同的注射器和针片。注射的位置因一些需要肌肉内、腹内、下皮或内皮注射的激素而异(图7)。
以卵巢切除术为目的的手术是各种两栖动物获取卵母细胞用于胚胎学研究的常用方法。卵子切除术也可能用于人口控制和医疗问题,如卵子保留。在部分卵巢切除术的情况下,为研究目的进行卵母细胞收获,手术必须确保动物保持繁殖。PGF2+的管理在解决女性R.Muscosa的卵子保留方面显示出一些希望。在几个个体中,PGF2=导致先前保留的卵子完全沉积,但在其他个体中,只有部分沉积需要手动剥离才能去除所有卵子。虽然PGF2+可以替代在R.Mussa中保留卵子的手术,但其治疗其他两栖动物类似病理条件的能力需要特定物种的验证。当手术干预被授权给阿努兰或考达病人时,有必要在切口之前确保适当的麻醉平面。需要敏锐的观察技能来评估和监测本研究对每个分类的规范诱导和恢复反应。一旦熟悉特定的解剖学,适当的手术方法,血相变,温和的组织操作和适当的术后管理,生殖手术不会构成压倒性的障碍。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
娜塔莉·卡拉塔尤德感谢芭芭拉·达兰特博士在超声波方面给予的培训和帮助,并感谢S.A.(EISA)的Exploradora de Immuebles,感谢她为我在SDZG的副研究员职位提供财政援助。感谢Kylie Cane博士对手稿的评论,以及官方评论者(无论他们是谁)。感谢乔纳森·戴因我们的2018年夏季研究员,圣地亚哥动物园保护研究所提供的照片(图1A,B)。莫妮卡·斯图普斯感谢动物园和水族馆保护捐赠基金协会和迪斯尼世界保护基金为建立圈养的Necturus种群提供财政支持。此外,还通过两栖动物倡导者Iris de la Motte女士的私人捐款获得支助。感谢克里斯托弗·德坎特先生和马克·坎贝尔博士对这项研究的重大贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems | GE medical systems | GE logiq Book XP | Ultrasound |
| Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex | GE medical systems | 8C-RS (10 MHz) | Ultrasound probe |
| BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle) | Mettler Electronics Corp CA | Sonigel | Ultrasound gel (water soluble, salt-free) |
| Hormone | |||
| Gonadotropin releasing hormone | BACHEM | 4012028 | synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate abbreviation: GnRH |
| Lutenizing hormone releasing hormone | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4033013; L1898 | synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt; [D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate abbreviation: LHRH |
| Human chorionic gonadotropin | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 | synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU) abbreviation: hCG |
| Prostaglandin 2α | Sigma-Aldrich | P40424; | synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris; abbreviation: PGF2α |
| Follicle-stimulating hormone | Sigma-Aldrich | F4021, F8174 | synonym: porcine, sheep abbreviation: FSH |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | 46665; P7556 | synonym: Vetranal; P4 water soluble abbreviation: P4 |
| Pituitary extract | na | synonym: Check papers for amphibian species derivation abbreviation: PE |
|
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec; Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich | HOR-272; 493-10; 9002-70-4 | synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin abbreviation: PMSG |
| Metaclopromide | Sigma-Aldrich | M0763 | synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide abbreviation: MET |
| Lucrin | BACHEM; Sigma-Aldrich | 4033014; L0399 | synonym: Leuprorelin acetate abbreviation: Lucrin |
| Lutalyse | Pfizer | synonym: PGF2α - Dinoprost tromethamine abbreviation: Lut |
|
| Pimozide | Sigma-Aldrich | P1793 | synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one abbreviation: PZ |
| Amphiplex | see above | synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide abbreviation: GnRH + MET |
|
| Ovopel | Ovopel | na | synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg) abbreviation: Ovo |
| Ovaprim | Pentair aquatic eco-systems | Ova10 | synonym: Salmon gonadotropin + domperidone abbreviation: Ova |
| Domperidone | Sigma-Aldrich | D122 | synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine abbreviation: DOM |
References
- Conde, D. A., Flesness, N., Colchero, F., Jones, O. R., Scheuerlein, A. An emerging role of zoos to conserve biodiversity. Science. 331 (6023), 1390-1391 (2011).
- Conde, D. A., et al. Zoos through the Lens of the IUCN Red List: A Global Metapopulation Approach to Support Conservation Breeding Programs. PLoS ONE. 8 (12), e80311 (2013).
- Morrison, C., Hero, J. -M. Geographic variation in life-history characteristics of amphibians: a review. Journal of Animal Ecology. 72 (2), 270-279 (2003).
- Calatayud, N. E., Stoops, M., Durrant, B. S. Ovarian control and monitoring in amphibians. Theriogenology. , 70-81 (2018).
- National Research Council. Institutional Animal Care and Use Committee Guidebook. , (2010).
- Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
- Graham, K. M., Langhorne, C. J., Vance, C. K., Willard, S. T., Kouba, A. J. Ultrasound imaging improves hormone therapy strategies for induction of ovulation and in vitro fertilization in the endangered dusky gopher frog (Lithobates sevosa). Conservation Physiology. 6 (1), coy020 (2018).
- Wright, K. M., Whitaker, B. R. Amphibian Medicine and Captive Husbandry. , Krieger Publishing Company. (2001).
- Forzán, M. J., Vanderstichel, R. V., Ogbuah, C. T., Barta, J. R., Smith, T. G. Blood collection from the facial (maxillary)/musculo-cutaneous vein in true frogs (family Ranidae). Journal of Wildlife Diseases. 48 (1), 176-180 (2012).
- Allender, M. C., Fry, M. M. Amphibian hematology. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 11 (3), 463-480 (2008).
- Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (3), 64-67 (2007).
- Jorgensen, C. B. External and internal control of patterns of feeding, growth and gonadal function in a temperate zone anuran, the toad Bufo bufo. Journal of Zoology. 210 (2), 211-241 (1986).
- Jørgensen, C. B. Growth and reproduction. Environmental Physiology of the Amphibians. , 439-466 (1992).
- Vu, M., Trudeau, V. L. Neuroendocrine control of spawning in amphibians and its practical applications. General and Comparative Endocrinology. 234, 28-39 (2016).
- Clulow, J., Trudeau, V. L., Kouba, A. J. Amphibian declines in the twenty-first century: why we need assisted reproductive technologies. Reproductive Sciences in Animal Conservation. , 275-316 (2014).
- Kouba, A., et al. Assisted reproductive technologies (ART) for amphibians. Amphibian Husbandry Resource Guide. 2, 60-118 (2012).
- Clulow, J., et al. Optimisation of an oviposition protocol employing human chorionic and pregnant mare serum gonadotropins in the Barred Frog Mixophyes fasciolatus (Myobatrachidae). Reproductive Biology and Endocrinology. 10 (1), 60 (2012).
- Browne, R. K., Seratt, J., Vance, C., Kouba, A. Hormonal priming, induction of ovulation and in-vitro fertilization of the endangered Wyoming toad (Bufo baxteri). Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 34 (2006).
- Calatayud, N. E., et al. A hormone priming regimen and hibernation affect oviposition in the boreal toad (Anaxyrus boreas boreas). Theriogenology. 84 (4), 600-607 (2015).
- Stoops, M. A., Campbell, M. K., Dechant, C. J. Successful captive breeding of Necturus beyeri through manipulation of environmental cues and exogenous hormone administration: a model for endangered Necturus. Herpetological Review. 45 (2), 251-256 (2014).
- Mc Creery, B. R., Licht, P. Induced ovulation and changes in pituitary responsiveness to continuous infusion of gonadotropin-releasing hormone during the ovarian cycle in the bullfrog, Rana catesbeiana. Biology of Reproduction. 29 (4), 863-871 (1983).
- Johnson, C. J., Vance, C. K., Roth, T. L., Kouba, A. J. Oviposition and ultrasound monitoring of American toads (Bufo americanus) treated with exogenous hormones. Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 299, 301 (2002).
- Herbert, D. Studies of assisted reproduction in the spotted grass frog Limnodynastes tasmaniensis: ovulation, early development and microinjection (ICSI). , (2004).
- Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2, 6 (2004).
- Ogawa, A., Dake, J., Iwashina, Y., Tokumoto, T. Induction of ovulation in Xenopus without hCG injection: the effect of adding steroids into the aquatic environment. Reproductive Biology and Endocrinology. 9 (1), 11 (2011).
- Silla, A. J. Effects of luteinizing hormone-releasing hormone and arginine-vasotocin on the sperm-release response of Günther’s Toadlet, Pseudophryne guentheri. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 139 (2010).
- Trudeau, V. L., et al. Hormonal induction of spawning in 4 species of frogs by coinjection with a gonadotropin-releasing hormone agonist and a dopamine antagonist. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 36 (2010).
- Krause, E. T., von Engelhardt, N., Steinfartz, S., Trosien, R., Caspers, B. A. Ultrasonography as a minimally invasive method to assess pregnancy in the fire salamanders (Salamandra salamandra). Salamandra. 49, 211-214 (2013).
- Browne, R. K., Li, H., Seratt, J., Kouba, A. Progesterone improves the number and quality of hormone induced Fowler toad (Bufo fowleri) oocytes. Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 3 (2006).
- Bramucci, M., et al. Different modulation of steroidogenesis and prostaglandin production in frog ovary in vitro by ACE and ANG II. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 273 (6), R2089-R2096 (1997).
- Gobbetti, A., Zerani, M. Possible roles for prostaglandins E2 and F2α in seasonal changes in ovarian steroidogenesis in the frog (Rana esculenta). Journal of Reproduction and Fertility. 98 (1), 27-32 (1993).
- Gobbetti, A., Zerani, M., Carnevali, O., Botte, V. Prostaglandin F2α in female water frog, Rana esculenta: Plasma levels during the annual cycle and effects of exogenous PGF2α on circulating sex hormones. General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 175-180 (1990).
- Guillette, L. J. Jr, Dubois, D. H., Cree, A. Prostaglandins, oviducal function, and parturient behavior in nonmammalian vertebrates. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 260 (5), R854-R861 (1991).
- Clulow, J., Mahony, M., Browne, R., Pomering, M., Clark, A. Applications of assisted reproductive technologies (ART) to endangered anuran amphibians. Declines and Disappearances of Australian Frogs'. Campbell, A. , 219-225 (1999).
- Browne, R. K., Wolfram, K., García, G., Bagaturov, M. F., Pereboom, Z. Zoo-based amphibian research and conservation breeding programs. Amphibian and Reptile Conservation. 5 (3), 1-14 (2011).
- Chai, N. Surgery in amphibians. Veterinary Clinics: Exotic Animal Practice. 19 (1), 77-95 (2016).
- Gentz, E. J. Medicine and surgery of amphibians. Ilar Journal. 48 (3), 255-259 (2007).
- Snyder, W. E., Trudeau, V. L., Loskutoff, N. M. 168 a noninvasive, transdermal absorption approach for exogenous hormone induction of spawning in the northern cricket frog, Acris crepitans: a model for small, endangered amphibians. Reproduction, Fertility and Development. 25 (1), 232-233 (2012).
- Kouba, A. J., et al. Emerging trends for biobanking amphibian genetic resources: the hope, reality and challenges for the next decade. Biological Conservation. 164, 10-21 (2013).
- Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2 (1), 6 (2004).
- Fort, D. J. Frog reproduction and development study 2000 rana pipiens reproduction and development study. , Environmental Protection Agency. (2003).
- Clulow, J., et al. Differential success in obtaining gametes between male and female Australian temperate frogs by hormonal review: A Review. General and Comparative Endocrinology. 265, 141-148 (2018).
- Trottier, T. M., Armstrong, J. B. Diploid gynogenesis in the Mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
- Marcec, R. M. Development of assisted reproductive technologies for endangered North American salamanders. , Mississippi State University. (2016).
- Wright, M. L. Melatonin, diel rhythms, and metamorphosis in anuran amphibians. General and Comparative Endocrinology. 4, (2002).
