Summary
수륙 양용 생물학의 연구는 많은 분류학 그룹의 유기체를 구동 하는 생식, 생리, 배아 및 개발 프로세스에 대 한 귀중 한 정보를 제공 합니다. 여기에서, 우리는 양서류에 있는 난소 통제 그리고 감시를 공부하기 위하여 이용될 수 있는 다른 방법론에 포괄적인 가이드를 제출합니다.
Abstract
양서류에서 난소 제어 및 모니터링은 다각적인 접근이 필요합니다. 성공적으로 생식 행동과 생리 적 또는 분자 연구를위한 gametes및 배아의 취득을 유도 할 수있는 몇 가지 응용 프로그램이 있습니다. 양서류는 척추동물 연구의 1/3에 1/4에 기여하고, 이 맥락에서 관심은 생식 과정과 배아 발달의 과학 계의 지식에 그들의 기여입니다. 그러나, 이 지식의 대부분은 종의 소수에서 파생됩니다. 최근, 전 세계적으로 양서류의 감소는 보존 주의자에 의해 증가 개입을 요구하고있다. 멸종 위험에 대한 응답으로 계속 등장하는 포로 회복 및 보증 식민지는 기존의 연구 및 임상 응용 프로그램이 인간의 치료하에 보유 된 양서류의 생존과 번식에 매우 중요합니다. 어떤 포로 인구의 성공은 건강과 재생산과 자신의 종의 가장 다양한 유전 적 표현을 앞으로 수행 실행 가능한 자손을 개발하는 능력에 설립된다. 연구원과 수의사에게 난소 발달과 건강을 모니터링하고 제어하는 능력은 필수적입니다. 이 문서의 초점은 모니터링하는 데 사용할 수있는 다른 보조 생식 기술을 강조하고, 적절하거나 필요한 경우, 양서류에서 난소 기능을 제어하는 것입니다. 이상적으로, 어떤 생식 및 건강 문제는 적절한 포로 축산을 통해 감소되어야한다, 하지만, 어떤 동물과 마찬가지로, 건강과 생식 병리의 문제는 피할 수 없다. 비침습적 기술에는 행동 평가, 육안 검사 및 촉진 및 신체 상태 지수 및 초음파 계산을 위한 형태 측정이 포함됩니다. 침습적 기술은 호르몬 주사, 혈액 샘플링 및 수술을 포함합니다. 난소 조절은 필요한 적용 및 관심 종에 따라 여러 가지 방법으로 행사될 수 있다.
Introduction
양서류는 오랫동안 연구 분야의 넓은 범위에 의해 중요한 생물학적 및 의료 모델로 인식되었습니다. 제노푸스 래비스와 X. 열대성, 레오파드 개구리(구 라나) 피피엔스및 액소로틀(Ambystomamexicanum)과같은 특정 종을 연구하여 얻은 데이터가 적용되었습니다. 인간을 포함한 여러 가지 척추동물 종. 이들과 다른 양서류를 연구에서 나온 수의학, 축산 및 보조 생식 기술은 포로에서 희귀 한 인구의 성공적인 치료, 유지 보수 및 지속 가능성을 개발하는 임무를 맡은 사람들에게 도움을 제공합니다. 1개 , 2개 , 3개 , 4.
위험 수륙 양용 종1,2에많은 멸종의 조류를 반전하기 위해 전 시투 보존 기반 접근법의 동시 사용에 대한 관심이 얻고있다. 이 문서는 현재 아누란과 카우다테의 모델 종에서 수륙 양용 난소 기능을 모니터링하고 제어하는 데 사용할 수있는 방법론을 제공합니다. 추가적으로, 계란 보유의 일반적인 생식 병리학을 다루기 위하여 기존 기술이 제출됩니다.
많은 분류학 단에서와 같이, 양서류 난소 통제는 환경과 생리학 사이 단단히 동기화된 상호 작용의 시리즈를 관련시킵니다. 온도와 포토기간(근접 신호라고 함)은 눈과 뇌에 의해 디코딩되어 유전적, 호르몬 및 일주기 적 과정(궁극적인 신호)으로 빠르게 변환됩니다3,4. 이 문서에서 다루는 난소 기능을 모니터링하고 제어하는 방법은 침습적 및 비침습적 기술을 포함합니다. 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 연구 및 교육 요구 사항은 비 침습적 인 기술을 신체적 고통이나 정신적 고통을 최소화하지 않고 통증 완화 약물을 필요로하지 않는 것으로 정의합니다5. 여기에서, 비침범성 기술은 육안 검사 및 촉진, 행동 관측, 형태 측정 평가 및 초음파를 포함합니다. 반대로, 혈액 수집, 호르몬 관리 및 수술 (난소 절제술 및 유지 된 계란의 제거)의 기술은 약간의 통증이나 불편 을 초래할 수 있으며 마취 또는 절차 후 약물 치료가 필요할 수 있기 때문에 침습적인 것으로 분류됩니다.
비침습적 난소 모니터링 기술은 대부분의 포로 양서류에 대한 일일 치료 루틴에 쉽게 통합될 수 있습니다. 종에 따라 난소 중력은 종종 간단한 육안 검사 (유리 개구리)에 의해 결정될 수 있습니다. 다른 경우에, 촉진은 여성이 gravid인지 여부를 나타낼 수 있습니다. 체중, 주전자 우로스타일 길이(SUL), 주전자 통풍구 길이(SVL) 및 표준 질량 지수(SMI)와 같은 다양한 신체 상태 지수(BCI)는 계란4,6,7의유무를 예측하는 데 사용할 수있습니다. 8,9. 그러나, 대부분의 나이 고려하지 않기 때문에 결과의 해석과 함께주의해야한다, 체형 또는 조성물 (예를 들어,물 유지 대 난소 질량 또는 지방) 6. 확실한 생식 진단은 난소 주기4,7의난자 발달 및 준비에 관하여 얻은 더 깊이 있는 지식을 가진 초음파를 통해 달성될 수 있습니다. 초음파는 또한 생식 병리 및 관련 생리 적 상태를확인하고 모니터링 할 수있는 수단을 제공합니다 4,8.
건강 상태에 관한 정보를 제공하는 것 외에도 혈액 샘플링을 사용하여 생식 호르몬을 측정할 수 있습니다. 호르몬 프로파일링이 최종 목표인 경우, 전신 스테로이드 데이터를 혼동할 수 있는 스트레스 관련 영향을 피하는 것이 중요합니다. 잠재적으로 강력한 모니터링 도구 하는 동안, 아직 어떤 수륙 양용 종에서 외 인 호르몬 관리에 타고난 내분비 학적 반응을 보여주는 연구. 혈액은 여러 사이트에서 안전하게 채취할 수 있습니다. 개구리에서 이것은 복부 복부 정맥, 언어 신경총, 대퇴 정맥 및심장 9,10을포함합니다. 카우다테에서는 복부 꼬리 정맥에서 혈액이 수집됩니다. 침략의 정도, 필요한 구속의 양, 마취제의 필요성, 표적화되는 장기의 섬세함 및 동물의 크기는 수륙 양 환자를위한 수집 기술을 선택할 때 고려해야 할 요소입니다. 이 기사는 원래 Forzan et al. 9에 의해 설명 된 대로 개구리의 안면 상악또는 근육혈관에서 혈액 수집 기술을 발표 할 예정이다.
난소 대조군은 종에 따라 다르며, 따라서 호르몬 프로토콜을 테스트하고 최적화해야 합니다. 계절성 및 관련 순환 호르몬 milieu 이외에, 난소 통제는 또한 문헌에 있는 작은 정보가 있는 반복한 호르몬 행정에 포로에 소요된 시간 및 노출에 있는 나이, 소요된 시간 및 에 단단히 연결될 수 있습니다11 , 12세 , 13. 생식 행동, 게임 생산, 성숙 및 난투를 유도하는 호르몬 요법의 구현은 포로와 관련된 일반적인 생식 문제를 해결하기위한 널리 보고 된 접근 방식이되었습니다4, 8,14,15,16. 척추동물에서 재생을 제어하는 메커니즘은 매우 보존되어 있기 때문에, 다수의 호르몬, 뉴로펩타이드 및 시판되는 약물이 다른 분류학 그룹에서 치료적으로 사용되고 있으며, 이는 또한 다수의 여러 가지에서 안정적으로 사용될 수 있다. 수륙 양용종 (표 1). 생식샘 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH) 그리고 인간 융모 성 생식샘 자극 호르몬 (hCG) (또는 이의 변화, 즉, PMSG 및 eCG)17,18,개별적으로 또는 조합, 수륙 양용 포로에 광범위하게 사용되었습니다 포함 사육 프로그램 : 남부 로키 마운틴 보리얼(아낙시루스 보레아스 보레아스)4,19,20; 두드, 더스키 고퍼 개구리, 라나 세보사 (랑혼 외, 미공개)7; 걸프 코스트 워터독, 넥터스 베이에리20; 와이오밍 두드, 아낙시루스 박스터리18; 황소 개구리, 라나 카테스비아나21; 미국 두드개, 아낙시루스 아메리칸러스22; 잔디 개구리, Lymnodyaster 타스 마니엔시스23; 코퀴, 엘류테로다이실루스 코퀴24; 제노푸스, 제노푸스 라에비스25; 건터의 두드리고, 프세듀오프린 겐테리26; 북부 표범 개구리, 리토바테스 피피엔스; 아르헨티나 뿔개구리, 세라토프리스 화려한; 크랜웰의 뿔개구리, C. 크랜웰리; 미국의 지상 개구리, 오돈토프레누스 아메리카누스27; 그리고 소방관(살라만드라)228. 스테로이드 호르몬, 프로게스테론 (P4)과 같은 덜 일반적으로보고되지만, 아뇨란의 일부 종에서 배란과 배란을 유도에 좋은 효능을 입증했다16,18,29. 프로스타글란딘 (특히 프로스타글란딘 2-알파 (PGF 2α))은 코르티코 스테로이드30,31,32,34와 함께 배란에 관여하고 동안 높은 수준에 도달합니다. 배란 단계31.
시험관내 연구에서, PGF2α는 배란(31)의 강력한 유도제이며, 생체 내에서는 라나 무스코사4,30,32에서보존된 난자의 oviposition을 유도할 수 있다. 뇌하수체 추출물은 또한 배란 유도제15,16,34; 그러나, 생물 안전 및 질병 전송을 위한 잠재력을 둘러싼 관심사는 이 접근을 고려할 때 포로 사육 식민지를 위한 수시로 억지력35.
이 문서의 마지막 섹션은 외과 적 수술을 자세히 설명하며 난소 연구를 확장하거나 생식 병리의 해결을 돕기위한 대체 접근 법을 제공합니다. 난소 절제술은 배아 연구를 위한 난모세포를 얻기 위하여 양서류에서 일반적으로 행해냅니다. 그러나 다른 옵션이 실패할 때 보존 된 계란에 대한 해결책을 제공 할 수도 있습니다. 이 절차는 침략적이지만, 완전한 마취와 절개를 요구하여 계란 덩어리를 노출시키지만 안락사를 요구하지는 않습니다. 또한, 부분 난소 절제술 후, 동물은 완전한 회복을 할 수 있으며 수술 후 생식 활성을 계속 할 수있습니다8,36.
아래에 기술된 프로토콜은 아누란과 카우다테에서 난소 제어 및 모니터링의 침습적 및 비침습적 방법을 설명합니다. 아누란의 기술을 설명하기 위해 선택된 특정 종은 R. 점막과 X. laevis를포함한다. 넥터루스 마쿨로서스, N. 베이에리, N. 알라바메시스,및 A. 멕시카눔은 카우다테에서 유사하게 기술을 설명하는 데 사용되는 종을 포함한다.
Protocol
살라만더 절차는 신시내티 동물원 & 식물원 (CZBG) 기관 관리 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜 11-106, 13-110, 14-133 및 15-138에 의해 승인되었습니다. 모든 개구리와 두드리고 절차는 샌디에고 동물원 글로벌 (SDZG), 기관 관리 및 사용위원회 (IACUC) 프로토콜에 의해 승인되었다 : 15-001, 16-005 및 18-003.
동물의 치료와 치료는 국립 자연사 박물관 (파리)의 윤리위원회에 의해 승인되었다 (박물관 국립 d'Histoire Naturelle-메나제리 뒤 자르댕 데 플랜테스 (MNHN)), 기관 및 국가 지침에 따라 (위원회 드 제니 제네티크, 방향 데파르테멘탈 데 서비스 베테리네르, 유럽 연합 지침 2010/63/EU, 계약 결정 번호. 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 척추 동물에 대한 유럽 협약에 대한 C75-05-01-2. 본 연구에 사용된 모든 프로토콜은 기준 번호 68-037에 따라 승인되었다.
1. 비침습적 난소 모니터링 기술
- 육안 검사 및 촉진
- 아래에 설명된 세 가지 방법 중 하나에서 여성 아누란을 잡으하십시오.
- 개구리 또는 두드의 다리를 반지와 새끼 손가락으로 고정하고, 개구리 몸의 등쪽(복부)을 검지와 가운데 손가락, 그리고 엄지손가락으로 복부쪽을 지지합니다(그림 1A).
- 개구리 나 두드리고 그것의 복부에 엄지 손가락과 동물의 뒷면을 고정 손가락의 나머지와 함께 지배적 인 손에 두드리고. 동물의 복부를 촉지하기 위해 비 지배적 인 손을 사용하여, 피하 범색이있는 경우 느낌 (그림1B).
- 개구리 나 두드의 복부를 손바닥에 놓고, 앞팔은 검지 손가락에 드리워지고 엄지 손가락은 뒤쪽상단에 있습니다.
- Caudates는 본질적으로 완전히 수생이기 때문에 아래에 설명 된 두 가지 방법 중 하나에 의해 육안으로 검사를 수행하십시오.
- 동물을 탱크 물이 들어있는 별도의 4L 용기로 옮김. 용기(뚜껑을 고정)를 위로 잡고 아래쪽에 손전등을 비추어 계란의 존재/부재를 시각화합니다.
- MS222에서 마취 (0.5 g /L; 트리카인 메탄설포네이트, 0.5 M NaHCO3로 완충하였다. 유도 후, 뒷면에 동물을 회전하 고 복 부 검사.
- 아래에 설명된 세 가지 방법 중 하나에서 여성 아누란을 잡으하십시오.
- 형태 측정 평가
- 아누란스 (주)
참고: 마취는 필요하지 않습니다.- 캘리퍼스를 사용하여, 입끝에서, 몸의 중심을 따라 꼬리의 끝까지 동물을 측정하여 SUL 및 SVL (그림2A,B)을 얻습니다.
- 디지털 정밀 도금 스케일의 플라스틱 용기를 타어. 동물을 타르 용기에 넣고 무게를측정합니다(그림2C).
- 큰 동물의 경우, 황소 개구리처럼, 또는 필드에 가중치를 얻을 때, 매달려 눈금을 사용 (그림2D).
- 많은 아누란 종에서와 같이, 그들의 더 큰 크기와 손에 nuptial (엄지 손가락) 패드의 부족에 의해 남성에서 R. muscosa 성인 여성을 구별 (그림 3).
- 다음 수식에 의한 전반적인 건강의 기본 평가로 신체 상태를 계산합니다.
풀턴 지수: K = 질량 길이3
주: Fulton의 인덱스는 질량 및 길이와 관련된 체적의 치수 균형을 사용하며, 여기서 3은 질량과 길이를 등각적으로 연관시키는 배율 지수입니다.
- 카우다에이스 (주)
- 무미마취 동물을 안에 넣기 전에 빈 봉투와 함께 주석을 배율. 과잉 물을 도입하지 않도록주의 (그림2D)동물이 억제되는 스트레스 응답으로 점액을 분비으로 신속하게 행동.
- 재밀봉 가능한 비닐 봉지 의 바닥에 있는 직선 위치에 개인을 고정하거나 확장된 캘리퍼를 수용할 수 있는 별도의 플라스틱 용기에 고정하여 성인대책을 구하십시오.
- 캘리퍼스로 본체 길이를측정합니다(그림 2E).
- 주전자 끝에서 꼬리 끝(SVL)까지 카우데이트를 측정하여 성장을 모니터링합니다.
- 아누란스 (주)
- 행동 관찰
- 동물을 실시간으로 물리적으로 관찰하거나 비디오 카메라를 사용하여 동작을 기록합니다.
- 동물의 관찰을 기록하고 행동을 분류하고 정신을 구성합니다(그림4).
- 생식 행동 분류
참고: 그림 4는 아누란에서 관찰된 한 가지 유형의 생식 행동을 예로 들 수 있습니다.
- 초음파
참고 : 선택의 초음파 트랜스듀서는,이 경우, 7.5 mHz 선형 또는 다중 주파수 (10-6 mHz) 마이크로 볼록, Necturus 및 10 MHz 프로브 및 수용성, R. muscosa에대한 무염 젤에 권장됩니다. 도롱뇽에서 초음파를 수행하려면 마취가 필요할 수 있습니다 (지침은 섹션 1.5 참조).- 아누란스 (주)
- 두 사람을 사용하여 R. muscosa에 초음파를 수행합니다 (그림5A).
- 첫 번째 사람: 지배적인 손으로 동물을 잡고 동물의 복부에 수용성, 소금이없는 젤을 적용합니다.
- 두 번째 사람 (초음파 검사기): 지배적 인 손에 10 MHz의 프로브를 가지고 프로브와 젤 사이에 좋은 접촉을 확인 복부에 적용합니다.
- 완구 바로 아래에서 동물의 복부 중간선 중앙을 향해 안쪽으로 밀어 전체 난소를 시각화합니다.
- 초음파 검사기 : 비 지배적 인 손을 사용하여 프레임을 고정하고 초음파에서 원하는 이미지를 캡처하십시오.
- 속 4에 대해 확립된 채점 시스템에 의해 난소 주기의 단계를 분류한다(표2, 도 5B-F).
- 시술이 끝나면 동물을 젤로 헹네주세요.
- 카우다에이스 (주)
- 2L의 탱크 물로 채워진 4 L 직사각형 용기에 마취되지 않은 넥튜러스를 옮김을 옮김.
- 방의 불빛을 끄거나 한 손으로 동물의 머리 위로 컵으로 동물의 움직임을 최소화하십시오.
- 트랜스듀서를 본체 벽에서 1-2cm 떨어진 거리에 배치합니다.
- 앞다리에 복부 중간선 수준에서 심장을 찾아 다음 트랜스듀서를 비등하게 이동하고 난소조직을 검사7.
- 속 4에 대해 확립된 채점 시스템에 따라 암컷을 분류한다(그림6A,B,C).
- 동물의 몸이 트랜스듀서에 비스듬히 있을 때 이미지를 캡처하여 중간에서 후반 중력 단계에서 계란의 정확한 측정값을 얻을 수 있습니다(즉, 선형이 아니라 약간의 호; 그림6B)를 참조하십시오. 그렇지 않으면, 여포가 겹치는 것은 개별 계란 크기를 구별하는 것을 어렵게 만듭니다.
- 아누란스 (주)
- 마취 유도 및 회복
- 아누란스 (주)
- MS222에서 마취 (0.5 g /L; 앞서 설명한 바와 같이 트리카인 메탄설포네이트완충제(0.5 M NaHCO 3).
- 동물이 마취된 정도의 기본 지표로 올바른 반사를 사용하십시오. 반사의 완전한 손실은 깊은 마취의 상태를 보여줍니다.
- 올바른 반사가 손실되면 수조 기반 마취 (MS-222)에서 동물을 제거하십시오.
- 젖은 동물 (마취되지 않은 염소 처리 된 물) 수건에 동물을 놓습니다.
- 전체 수술 중에 동물을 촉촉하게 유지하십시오.
- 붉은 고무 카테터, 커프를 팽창하지 않고 고전적인 커프스 endotracheal 튜브와 작은 양서류 삽관.
- 0.5-1% 이소플루란으로 낮은 산소 흐름(0.5-0.75 L/min)을 제공합니다.
- 시술 후 이소플루란을 멈추고 산소의 흐름을 1 분 동안 유지하십시오.
- 동물을 배출하고 마취되지 않은 탈염수로 동물을 2 분 동안 철저히 헹구십시오.
- 동물을 염소 처리된 물의 얕은 양이나 젖은 수건에 넣습니다.
- 뒷다리를 부드럽게 잡아당겨 동물의 회복을 평가합니다. 사지의 반응 수축은 철수 반사를 나타냅니다.
- 굴러 호흡(인후 운동) 및 올바른 반사와 같은 회복의 다른 지표를 모니터링합니다.
- 모든 반사 신경이 돌아왔을 때 회복 된 수륙 양용 을 고려하고 심장과 호흡 률이 마취 전 값으로 돌아왔습니다.
- 카우다에이스 (주)
- MS222 (트리카인 메탄설포네이트 0.5 g /L)에서 넥튜러스와 암비스토마를 마취시키고 4 L 직사각형 탱크에서 0.5 M NaHCO3, (MS222)로 완충했습니다.
- 공기 석 (1 인치)와 공기 펌프를 탱크에 넣고 적절한 산소를 제공하기 위해 일정한 흐름으로 켭니다.
- 사지 기능과 올바른 반사가 손실되면 수조 기반 마취 (MS-222)에서 동물을 제거하고 동물을 젖은 (마취가없는 염소 처리 된 물) 수건에 놓습니다.
- 탱크 워터를 짜서 피부와 아가미 수분을 유지하십시오.
- 동물을 회수하려면 공기 석재가 있는 탱크 물 2L로 채워진 4L 플라스틱 용기에 조심스럽게 방반면을 놓습니다.
참고 : 회복은 아가미 깜박임으로 시작하고 꼬리를 움직이고 사지의 기능적 움직임을 앞당겨 서움직일 수 있습니다. - 동물을 원래 하우징 탱크로 되돌리고 다음 24시간 동안 자세히 모니터링하십시오.
참고 : 양서류에 대한 마취의 다른 방법이 존재하고 이들은 라이트와휘태커 8에 설명되어 있습니다 .
- 아누란스 (주)
2. 침략적인 난소 모니터 및 통제 기술
참고 : 이 절차는 Forzán 외10에서적응되었습니다.
- 지배적 인 손에 개구리를 잡고, 멸균 닦아 또는 거즈로 개구리의 얼굴의 venipuncture 측면을 건조.
- 혈액이 피부에 너무 많이 분산되는 것을 피하기 위해 얼굴을 건조시십시오.
- 바늘 (26 G 1/2"및 27 G 1/2")을 삽입하고, 경사가 위쪽을 향하고, 눈 주위의 제기 된 피부와 윗턱 능선이 만나는 피부를 통해 삼각형 (노란색 윤곽)의 지점을 형성합니다 (그림7A)근처의 베나 페이셜리스에 액세스 정맥 궤도 후방.
- 오른쪽 눈 아래와 윗턱 능선 위, 눈의 중간선에서 1-2mm 부터 시작하여 안면 정맥을 뚫습니다(그림7A).
참고: 작은 개구리(20g 미만)의 경우 삽입 점을 눈의 중간선 바로 아래 위치에 더 가깝게 이동합니다. - 미세 hematocrit 튜브를 아래쪽으로 각도로 중력을 활성화하여 튜브로 혈액이 흐르도록 돕습니다. 혈액은 천공 직후에 흐르게됩니다 (그림7B,C).
- 혈류의 첫 징후에서, 펑크 부위에 미세 hematocrit 튜브의 끝을 놓고 혈액의 1-2 전체 미세 hehematocrit 튜브를 수집하고 수집을위한 적절한 리셉터클에 튜브를 배치합니다 (그림7B,C).
- 혈액이 쉽게 흐르지 않거나 부피가 매우 낮은 경우 바늘 삽입을 약간 이동하거나 바늘을 얼굴의 다른 쪽으로 삽입하십시오.
- 적어도 20 s에 대 한 천자 사이트에 단단히 거 즈를 눌러 출혈을 중지 합니다.
- 구멍 부위가 다시 열리지 않는지 확인하기 위해 10 분 동안 물에서 개구리를 둡니다.
- 샘플링 된 각 개구리에 대한 새로운 바늘과 새로운 미세 hehematocrit 튜브를 사용합니다.
3. 호르몬 유도
- 호르몬 준비
- 최대의 효과를 보장하기 위해 사용 직전에 호르몬 주사를 준비하십시오.
- 표1에 나열된 선택 항목에서 호르몬을 선택합니다.
- 체중의 μL 또는 mL/g를 사용하여 주입할 호르몬의 농도를 결정합니다16.
- 다음 중 하나에 호르몬을 희석: 물, 인산 완충 식염수 (PBS), 식염수 링거의 용액 (SARS) 또는 식염수.
- 80-110 g (개인 관찰)16무게 개구리에 대 한 30-70 g 와 300 μL 무게 개구리에 대 한 200 μL의 주입 볼륨을 초과 하지 마십시오.
- 10-100 g에 이르는 모든 동물의 호르몬 투여 중에 동물을 올바르게 보유하기 위해 섹션 1.1에 기재된 보유에 적합한 방법 중 어느 것을 사용하십시오.
- 아누란스 (주)
- 체중 계산당 그램(g/체중)을 사용하여 개인당 필요한 농도를 계산합니다.
- 투여 직전에, 선택의 멸균 희석제에서 재구성.
- 주입 하기 전에 주사기에 거품이 남아 있지 않은지 확인 합니다.
- 동물을 지배적이지 않은 손에 단단히 잡고 지배적 인 손으로 주사를 투여하십시오.
- 호르몬 사양에 따라 주입을 관리. 아우란에서 가장 흔한 주사는 복막 내 또는 근육 내(그림8)입니다.
- 복부의 하부 또는 등다리 근처의 등쪽 의 하부에 IP 주사를 투여합니다(그림 9).
- 근육 내 주사를 뒷다리로 투여하는 것이 바람직합니다.
- 카우다에이스(강관)
- 위에서 설명한 체중 당 그램 에 따라 멸균수에서 선택한 호르몬을 재구성합니다.
- Necturus의 경우, 1.7-2.3 μg GnRH/g 체중의 복용량을 사용 하십시오.
- 마취실에서 넥튜러스를 제거하고 수술용 드레이프로 덮인 45° 표면에 놓습니다.
- 머리를 아래로 향하여 동물을 배치합니다.
- 15-20 ° 각도로 복부 (뒷다리의 꼬리)의 후방 사분면에 접근하십시오. 주사기에 공기를 유입시키지 않도록 주의하십시오.
- 인슐린 주사기와 27-30 G 바늘을 사용하여 (IP)를 주입하십시오.
- 인슐린 주사기와 27-30 G 바늘을 사용 하 여 호르몬을 주입.
4. 수술
- 일반 외과 준비 및 절차
- 무균 절차를 유지하려면 투명 멸균 플라스틱 커튼을 사용하여 수술 부위를 분리하십시오. 주변 피부를 촉촉하게 유지하여 증발을 줄입니다.
- 동물의 피부에 닿을 물질을 멸균수로 적시다. 숫자 15 또는 숫자 11 메스 블레이드로 피부 절개를 합니다.
참고 : 냉철, 방사선 수술 또는 다이오드 레이저의 조합. 온화한 출혈성 절차에서 지혈은 전기 소작 또는 다이오드 레이저에 의해 달성 될 수있다. - 면으로 기울어진 창이나 어플리케이터를 사용하여 혈액 손실을 추적하는 작은 혈관에 국지적인 압력을 가할 수 있습니다.
- 면으로 된 창이나 어플리케이터를 사용하여 표준 거즈 사각형 대신 작은 밀폐된 공간을 관리하십시오.
- 1kg 미만의 동물에 대한 수술을 할 때, 미세하고 작은 팁과 함께 안과 기구와 같은 마이크로 기기를 사용하십시오.
- 다양한 크기의 절개에 맞게 플라스틱 자체 고정 리트랙터(예: 론 스타 리트랙터)를 사용합니다.
- 눈꺼풀 리트랙터를 사용하여 coelomic 절개를 철회하십시오.
- 더 작은 환자에 수술을 수행하기 위해 필요한 경우 배율 계측을 사용합니다.
참고 : 진통은 양서류의 모든 외과 적 절차에 필요합니다. 수술 중 적절한 진통을 투여하지 못하는 것은 정상적인 기능의 지연된 복귀와 관련이 있습니다. 더욱이, 마취는 마취약의 효력을 강력하게 합니다 (표3)34.
- 아누란스 (주)
- 일단 X. laevis는 단계 1.5.1에 설명된 대로 마취되면, 등도 침착성에서 동물을 위치시키게 한다(그림10A,C).
- 수술 부위에 10-15s 또는 0.75% 클로르헨시딘 용액을 수술 부위에 10-15s 또는 0.75% 클로르헨시딘 용액을 위한 부위에 희석된 포비동-요오드 용액(1/10)으로 촉촉한 멸균 거즈를 닦아 수술 부위를 무균적으로제조한다(35).
- 15 번 또는 11 번 메스를 사용하여 깨끗한 절개를 남기고 한 번의 대담한 스트로크로 중간 coelom (어깨와 cloaca 사이)에서 3mm 파라 메디아 피부 절개를 합니다.
참고 : 하나는 피부 절개도 다이오드 레이저를 사용할 수 있습니다. - 복부 막을 높이고 절개를 하고 No. 15 또는 no. 11 메스를 사용하여 조심스럽게 해부하십시오. (그림10B,D).
- 눈꺼풀 리트랙터 (또는 적절한 장비)로 coelomic 절개를 철회하십시오.
- 혈관을 결부하지 않고 계란 덩어리의 일부를 소비하십시오.
- 완전한 난소 절제술을 위해, 전기 소작 또는 레이저 다이오드로주변 혈관을 소작 (그림 11).
- monofilament 봉합사를 사용하여, 중단된, 에버팅 봉합사 패턴으로 셀리오토미 절개를 닫습니다.
- 카우다에이스 (주)
- 한 번 A. mexicanum은 마취되었습니다, 왼쪽 골반 사지는 단순히 꼬리 기지에 배치와, 오른쪽 측면 recumbency에 배치.
- 10-15 초에 희석 된 포비도 요오드 용액 (1 :10)을 둔 살균 거즈로 적신 살균 거즈를 10-15 초에 배치하여 수술 부위를 무균 적으로 준비하고 0.75 % 클로르헨시딘 용액에 담근 멸균 거즈를 사용하고 수술 부위에 적어도 10 분 동안 배치하십시오. 수술 전 (그림12A)36,37 .
- 어깨와 뒷다리 사이에 선을 그려 몸을 세 개의 동등한 부분으로 나눕니다(그림12B).
- 두 번째 부분과 세 번째 부분 사이에 절개 부위를 만듭니다.
- 기본 근육을 잡고 coelomic 내장에서 멀리 상승.
- 작은 지혈대를 coelomic 근육을 통해 서 coelomic 구멍으로 부드럽게 밀어 넣습니다.
- 눈꺼풀 리트랙터 (또는 적절한 물질)로 coelomic 절개를 철회하십시오 (그림12C).
- 완전한 난소 절제술을 위해, 전기 소작 또는 레이저 다이오드로 주변 혈관을 소작하십시오 (그림12D).
- monofilament 봉합사를 사용하여, 중단된, 에버팅 봉합사 패턴으로 셀리오토미 절개를 닫습니다.
Representative Results
형태 및 복제
양서류에서 여성의 생식 상태의 시각화는 종에 따라 다릅니다. 가장 효과적인 방법은 초음파입니다. 그러나, 일부 종은 그들의 피부의 투명도의 다양한 정도를 나타낼 수 있습니다 (그림13A,B,C). 육안 검사는 피부가 N. alabamensis 및 N. maculosus에서 관찰된 바와 같이 반투명일 때 그라비드와 비중력 암컷 사이의 차이를 명확하게 설명할 수 있다(도13A,B); 또는 유리 개구리에 의해 도시 된 바와 같이 반투명 (그림13C). N. beyeri의 복부에 어두운 점박이 피부 착색은 이 평가를 하는 것을 금지합니다. R. muscosa에서,피부는 반투명하지 않습니다 그러나 눈에 띄는 다름은 피부가 flaccid 때문에 최근에 oviposited 그들에 비해 gravid인 암컷 사이에서 검출될 수 있고, 동물은 더 얇게 보입니다 (노란 선) 그라비드(파란색 선)(그림13D)입니다. 경험으로 처리기는 큰 여성과 gravid 하나 사이의 차이에 익숙해 질 수 있지만 gravid 단계의 확인은 초음파가 필요합니다. 양서류의 체질량 지수는 여러 수식을 사용하여 계산할 수 있지만 재생을 위한 예측 도구로서의 적용은 논쟁의 여지가 없습니다. R. muscosa의경우, 풀턴의 지수, 건강 및 생식 상태 사이의 상관 관계는 불분명 남아있다.
생식 행동 및 초음파
우리의 결과는 oviposition의 예측을 위한 R. muscosa에 있는 생식 행동을 특성화하는 방법을 보여줍니다 (그림 4). 몇 시간에서 몇 주에 지속되는 여러 단계가 포함, 남성이 적극적으로 여성을 쫓아 구애 (그림4A),남성 마운트와 단단히 여성의 등에 걸쇠, 라는 amplexus (그림4B). 일단 충분히, 쌍에 대 한 앰플xus에 남아 있을 수 있습니다 1 – 5 주 그리고 쌍 은 amplexus 이외에 다른 행동을 표시 합니다. Amplexus는 부드러운 펌핑 방식으로 여성을 압박하는 남성을 포함하는 매우 활동적인 행동이다 (도4C); 여성이 움직이며 간헐적으로 손스탠드 동작을 표시하기 시작한다(그림4D,E); 그리고 oviposition의 시간에 가까운, 여성, 손 스탠드에, 그녀는 수컷이 적극적으로 그녀의 복부를 펌핑하는 동안 에 계란을 붙일 수있는 표면에 기대어 (이 경우 는 또한 여성이 아래에서 아래그녀의 복부를 문질러 관찰 할 수있다 그녀의 팔은 클로아카를 향해 구덩이에 있다. 이것은 난관을 아래로 계란을 밀어하는 기계적인 방법일지도 모릅니다(그림4F,G).
이 연구는 초음파가 여성 R. muscosa 및 Necturus에서 생식 상태를 확인하는 정보를 제공 할 수있는 방법을 보여줍니다. 개발의 네 단계는 R. muscosa (그림5C,D, E,F)로 표현되며, 마찬가지로 Necturus4 (그림6A,B, C)에서특징지어진다. 또한, 잔류 계란은 난자 보존으로 이어지는 추방되지 않을 수 있습니다 (도5G, 도 15A,B). 1단계는 모낭이 가시화하기 어려운 난소 직후를나타낸다(도 5C). 단계 2는 난소 전체에 분산된 에코게닉 도트(흰색 반점)의출현으로 나타난다(도 5D). 2 단계와 3단계는 더 크고 둥근 반향 점과 큰 여포를 나타내는 어두운 중심으로 표현됩니다(그림5E,F). 2013-2017년, 포로여성 괴상은 월단위로 초음파 검사를 받았습니다. 각 시험 동안 개인은 속에 대해 확립된 생식 기준에따라 성적 점수를 배정하였다(표 2). 매년 새로운 계란을 개발 하는 여성의 비율 평균 88.2 ±3.01% (표 5). 난자 발달이 높았지만, 난소가보장되지 않았다(그림 16). oviposition를 겪은 여성의 대다수는 계란의 완전한 보충을 예금하고, 몇몇 개별은 개발한 계란의 단지 일부를 기탁하는 동안. 그 R. muscosa와 체강에 유체 이득과 수반 되는 유지 계란 을 가진 Necturus 암컷은 파열 된 혈관과 일치하는 피부에 빨간 패치로 외적으로 시각적으로 확대되었습니다 (그림14A,B ) . 유체 보존의 정도는 초음파를 통해 추가로 평가 될 수있다 (그림15B). 두 종 모두에서, 유지 된 계란은 inresia를 겪었거나 더 반향적인 외관을 취했습니다 (그림14C,D, 그림 15A).
호르몬 관리
주사 의 종류 깊이에 따라 바늘의 각도와 깊이가 다를 수 있습니다. 대부분의 주사의 경우 바늘의 깊이는 R. muscosa와 같은 종으로 작업 할 때 1 -2mm 깊이가 될 필요가 없지만 침투 각이 다를 수 있습니다. 프로스타글란딘 주사는 근육 내 (im) 바늘 삽입이 필요 90°에서 각진, R. muscosa의 뒷다리에 동안 복막 (ip) 주사, 근육 내 주사와 유사한 깊이와, 근육 주사의 영역에서 투여되었다 45 °에서 coelomic 공동 (그림10). Amphiplex의 투여는 대조군 (P = 0.547)에 비해 호르몬 처리 된 여성에 의해 증착 된 난자의 수를 증가에 유의한 영향을 미치지 않았으며, 갈기 (P = 0.673) 또는 올챙이로 살아남은 배아의 수에 차이가 없었다 (P = = 0.629)(표4). 일반적으로 여성의 배란율은 2011년 80%에서 2014년 28%로 감소했습니다. 2015년에 난모의 수는 2013년(P = 0.0002), 2013년(P = 0.0001) 및 2014년(P = 0.0026)보다 월등하게 높았지만 2011년(P = 0.0885)은 아니지만, 이 종의 암컷은 매년 사육되지 않을 수 있다는 생각을 재확인하였습니다. 네멘트. 계란 보존의 징후를 가진 R. muscosa 암컷의 경우, PGF2α의 근육 내 주사는 퇴행성 계란의 추방을 유도하는 데 60 %의 성공률을 보였습니다. 그러나, 주입된 5마리의 암컷 중 1마리에서, PGF2α는 완전한 퇴학을 일으키기에 충분하지 않았고, 일부 알은 다음 번식기까지 암컷 내부에 남아 있었다. 17명의 강넥튜러스 암컷은 LHRH/(GnRH)을 받았고, 13명은 대조군역할을하기 위해 멸균수를 가짜 로 주입하였다(표 5). 총 7개의 암컷 강령증(n=4 alabamensis,n=2 beyeri,n=1 마쿨로소)은GnRH 처리(n=6) 및 대조군(n=5) 개인 모두에 기인한 11개의 풀 클러치를 ovipoiposit에 갔다. 3마리의 암컷(n=2 베이에리,n=1 마쿨로서스)은5개의 부분 클러치(도13)를oviposited한다. 이러한 현상은 3명의 대조군 암컷이 유사하게 부분 클러치를 증착함에따라 외인성 호르몬 치료와 연관된 것으로 나타나지 않았다(표 5). 5년 동안 37일(3/31-5/7) 기간 동안 Oviposition이 발생했습니다(표 5). LHRH/GnRH 처리(41±13.08%, 범위 17-67%) 사이의 배반 비율에는 차이가 없었습니다(P = 0.194). 및 제어 (66.75 ± 11.79 %, 범위 50-100 %) 여성. LHRH/GnRH 처리된 암컷은 주사 후 평균 7.44±1.41(범위 3-13)의 계란을 증착하였다. 종의 완전 수생 특성과 마취없이 수동으로 억제 할 수없는 능력을 감안할 때 IP 호르몬 주사를 수행하기 전에 적절한 수준의 신분을 보장할 필요가 있었습니다 (마취에 대한 지침은 섹션 3.2 참조).
혈액 수집, 마취 및 수술
이 문서의 혈액 샘플링 기술은 Forzan 등 에서 찍은 201310 최소한의 침략과 스트레스와 R. muscosa에서 혈액을 수집 하는 효과적인 방법을 입증 했다. 미세헤마토크릿 튜브를 사용하여, 혈장 또는 혈청의 약 35-45μl은 전혈의70 μL당 수집될 수 있다(그림 7). R. muscosa의 최대 수집 량은 개구리 10g당 1 개의 전체 미세 hehematocrit 튜브였으며, 개구리 40g 이상은 개구리 당 최대 4 개의 튜브였습니다. 이는 100 g당 0.7 mL의 보수적인 수집부량으로, 100 g당 1.0 mL의 최대 권장량의 70%(2008년 알렌더및 프라이에서 적응)13이었다.
양서류에 있는 마취 그리고 수술은 드물게 보고되지 않습니다 그러나 복용량 및 효험은 종 특정 방식으로 변화할 것이라는 점을 주의하는 것이 중요합니다. 예를 들어 봄비나 오리엔탈리스의 경우 MS222는 고용량(1 g/L)에도 효과가 매우 낮은 반면, 보리얼 두꺼비, 아낙시루스 보레아스보레아스, 1 g/L은 빠르고(분별) 오래 지속(3+ h)(칼라타유드, 개인 관찰). R. muscosa에서, 마 취는 A. boreas boreas에 대 한 보고 복용량을 필요로 하 고 비슷한 효과 및 복구 시간. 마취 전에 금식 양서류는 일반적으로 그들의 후두가 전신 마취의 밑에 단단히 닫혀 있기 때문에 요구되지 않습니다. 그러나, 필요하다고 판단되는 경우에, 특히 마취 절차가 celomic 수술을 포함하는 경우에, 동물은 마취의 앞에 24 시간 단식될 수 있습니다.
수술 중, 오른쪽 반사는 동물이 마취되었다는 주요 지표입니다. 올바른 반사는 동물이 등에 배치 된 후 똑바로 자리 로 돌아갈 수있는 능력과 용이성 정도입니다. 반사의 손실은 마취의 가벼운 단계를 제안합니다. 수술 평면은 그것을 곧게하기 위해 팔다리를 가볍게 당기는 것을 포함하는 철수 반사의 손실로 표시되며 동물은더 이상 그것을 철회 할 수 없습니다 7. 생식 수술은 압도적 인 장애물이 없으며 양서류 환자는 주로 높은 척추 동물보다 더 많은 혈액 손실을 용인잘 치유합니다. 수술은 처음부터 끝까지 약 15 분 동안 신속하게 진행되어야합니다. 단계는 다음과 같이 대략 적으로 시간 초과되어야합니다 : 초기 절개 및 뇌절제술 및 리트랙터 삽입을위한 <2 분, 난소 당 격리를위한 2-3 분 및 혈관 봉합또는 소작 및 피부 봉합사 및 피부 봉합사 4 분 . MS222 프로토콜로 수술 후 총 회복 시간은 약 45분이지만 종에 따라 다를 수 있습니다. A. 보레아스 보레아스와 R. muscosa 복구 시간은 1 - 2 시간까지 더 길 수 있습니다. 수술을 수행 할 때, 주의폐, 위장관 또는 부진 방광을 천공하지 않도록주의해야하며, 거시 땀샘, 림프심, 혈관, 특히 중간 복부 정맥을 손상시키지 않도록해야합니다. 계절에 따라 큰 지방 체가 있으면 다른 장기의 시각화가 어려워질 수 있습니다. 일단 눈에 띄게 깨어나면, 눈 주위의 영역이 자극될 때 등사지의 완만한 스트레칭에 대한 저항이나 깜박임과 같은 사지 자극에 대한 동물의 반응(개인적인 관찰)은 철수 반응으로 분류됩니다. 철수 반사 및 경형 운동을 포함한 다른 회복 지표와 함께 올바른 반사는 회복의 중요한 지표입니다.
| 관리 | ||||||||||
| 일반 이름 | 종 | 호르몬 | 절차 | 프라이밍 컴파운드 | 프라이밍 복용량 보고 | 프라이밍 복용량의 수 | 타이밍 (배란 용량 전에 시간) | 최종 배란/배란을 위해 투여된 화합물 | 복용량 | 참조 |
| 푸에르토리코 크레스티드 두다 | 펠토프린 여우원숭이 | GnRH 및 hCG | Ip | Hcg | 1.5 IU/g | 2개 | hCG - 48 | GnRH; hCG; GnRHa + hCG | 0.2 μg; 4 IU; 0.5 μg + 4 IU | 칼라타유드 외. 미공개 |
| 산 노란 다리 개구리 | 라나 무스코사 | 암피클렉스, 루트 | Ip | GnRHa (데 글리10, D-알라6, 프로 NHEt9-GnRH) | 0.4 μg/g | 1개 | 24세 | GnRH + MET | 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g | 칼라타유드 외, 2018 |
| PGF2α | Im | PGF2α | 5 ng/g | 1개 | 48세 | PGF2α | 5 ng/g | |||
| 서던 로키 마운틴 보리얼 두타 | 아낙시루스 보레아스 보레아스 | hCG, GnRH | Ip | Hcg | 3.7 IU/g | 2개 | 96, 24 | hCG + GnRHa | 13.5 IU/g + 0.4 μg/g | 칼라타유드 외, 2015 |
| 북부 크리켓 개구리 | 아크리스 크레피탄 | 암피클렉스 | 물에 추가 (10 mL) | 없음 | 없음 | 0 | Na | GnRH + MET | 0.17 μg + 0.42 μg / μl | 스나이더 외, 2012 |
| 북부 표범 개구리 | 리토바테스 피피엔스 | 암피클렉스 | Ip | 없음 | 없음 | 0 | 24세 | GnRH + MET | 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g | 트뤼도 외, 2010 |
| 아르헨티나 뿔 개구리 | 세라토피르 오르나타 | 암피클렉스 | Ip | 없음 | 없음 | 0 | 24세 | GnRH + MET | 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g | |
| 크랜웰의 뿔개구리 | 세라토프리스 크란웰리 | 암피클렉스 | Ip | 없음 | 없음 | 0 | 24세 | GnRH + MET | 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g | |
| 미국 지상 개구리 | 오돈토프리누스 아메리카누스 | 암피클렉스 | Ip | 없음 | 없음 | 0 | 24세 | GnRH + MET | 1 x 0.4 μg/g + 10 μg/g | |
| 더스키 고퍼 개구리 | 라나 세보사 | hCG, GnRH | Ip | Hcg | 3.7 IU/g | 2개 | 96 , 24 | GnRH + hCG | 1 x 0.4 μg/g + 13.5 IU/g | 그레이엄 외, 2018 |
| 일반적인 코퀴 | 엘류테로다실루스 코퀴 | 물고기, 조류, 포유류 및 GnRH (D-Ala, 데 글리, 에스 LHRH), hCG | 사우스 캐롤라이나 | mLHRH; ALHR; fLHRH; GnRHa; Hcg | 없음 | 0 | Na | mLHRH; ALHR; fLHRH; GnRHa; Hcg | 7μg, 33μg; 28μg; 7μg, 20μg; 5, 10, 15, 20 μg; 165 IU | 마이클 외 2004 |
| 건터의 두드리고 | 슈도프린 겐테리 | GnRH | 그너하 | 0.4 μg/g | 1개 | 26세 | 소수 유무에 관계없이 GnRHa | 0.4 μg/g | 신라 2010 | |
| 코로보리 개구리 | 슈도프린 코로보리 | 루크린 (미국) | 사우스 캐롤라이나 | 루크린 (미국) | 1 μg | 1개 | 26세 | 루크린 (미국) | 5 μg | 바인 & 신라, 2010 |
| 북부 코로보리 개구리 | 슈도프린 펜길레이 | GnRHa GnRH (D-Ala, 데 글리, 에스 LHRH) | 따 | 없음 | 없음 | 0 | Na | 그너하 | 0.5 -2.0 μg/g | 신라 외, 2017 |
| 걸프 코스트 워터독 | 넥터스 베이에리 | [des-Gly10, D-Ala6]-LhRH-RH 에틸라미드 아세테이트 소금 수화물 | Ip | 없음 | 없음 | 0 | Na | LHRH | 100 μg / 500 μL | Stoops 외, 2014 |
| 남부 종 개구리 / 으르렁 거리는 잔디 개구리 | 리토리아 라니포르니스 | 데스 글리10, D- 알라6-[LHRH] | 사우스 캐롤라이나 | 없음 | 없음 | 0 | Na | 데스 글리10, D- 알라6-[LHRH] | 50 μg | Mann 외, 2010 |
| 파울러의 두다 | 아낙시루스 파울레리 | GnRH, hCG, P4 | Ip | Hcg | 3.7 IU/g | 브라운 외, 2006 | ||||
| 악소틀 (멕시코 도롱뇽) | 암비스토마 멕시카눔 | 여포 자극 호르몬 | Im | 없음 | 없음 | 0 | Na | Fsh | 400IU | 트로티에와 암스트롱, 1974년 |
| 아프리카 발톱 개구리 | 제노푸스 라에비스 | hCG 및 P4 | 추가 물; Ip | PMSG, hCG | 마르세크 , 2016 | |||||
| 호랑이 도롱뇽 | 암비스토마 티그리넘 | hCG, LH | ||||||||
| 와이오밍 두타 | 아낙시루스 박스터리 | hCG, GnRHa, P4 | Ip | hCG + GnRHa | 100 IU + 0.8 μg | 1개 | 72세 | hCG + GnRHa | 100 IU + 0.8 μg | 브라운 외, 2006 |
| 북부 표범 개구리 | 리토바테스 피피엔스 | 뇌 하 수 체 추출 물 (PE), P4, 남성 호르몬 (T), 코르 티 코 스테론 [C], Amphiplex, 돔 페리돈 (D) | SC, IP | 없음 | 없음 | 0 | Na | PE, PE +T, PE + P4, PE + C; 암피클렉스, GnRH + D | ~100 IU (LHRH) 1 mL; PE + 0.002μg / μL; PE + 0.01mg / 50mL; PE + 0.1mg / 50mL; 0.4 μg/g + 10 μg/g; 0.4 μg/g + D | 라이트, 1961년; 포트, 2000; 트뤼도 외, 2013 |
| 지상 개구리 | 림프디나스테스 타스메니엔시스 | 뇌 하 수 체 추출 물, hCG, GnRHa, PZ | Ip | 그너하 | 0.9-1.2μg/g + PZ 10 μg/g | 1개 | 20개 | PE; PE + hCG; GnRH + PZ | PE vol; PE vol + 100 IU hCG; GnRH (0.9-1.2μg/g) + PZ (10μg/g) | 클루로우 외, 2018 |
| 녹색과 황금 종 개구리 | 리토이아 아우레아 | GnRH | Ip | 그너하 | 10 μg | 1개 | 72세 | GnRHa + hCG | 20 μg + 300 IU | 클루로우 외, 2018 |
| 그레이트 금지 개구리 | 믹스옵혜에스 파시올라투스 | hCG 및 PMSG | 사우스 캐롤라이나 | PMSG, hCG | 50 IU 및 25 IU; 1x100 IU | 2; 2개 | PMSG-144 및 96; hCG-24 | Hcg | 100IU | 클루로우 외, 2012 |
| 더 많은 호르몬 프로토콜 및 종에 대 한 참조 라이트와 휘태커, 2001 | ||||||||||
표 1: 수륙 양용 종 및 일부 외인성 호르몬이 문헌에 보고된 바와 같이 그(것)들에 시험되었습니다. 인간 융모성 생식샘 자극 호르몬 (hCG); 생식 샘 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH); 호르몬 방출 호르몬을 루텐화 (LHRH); 문자 m, a 와 f는 '포유동물', '조류'와 '물고기'를 나타냅니다. 임신 한 마레 혈청 생식샘 자극 호르몬 (PMSG); 프로게스테론 (P4); 여포 자극 호르몬 FSH); 뇌 하 수 체 추출 물 (PE); 테스토스테론 (T); 코르티코스테론 (C). 나열 된 도파민 길 항 제 포함: domperidone (D); 피모지드 (P); 메토클로프라미드 (MET). 암피클렉스는 GnRH와 메토클로프라미드27로 구성된 화합물에 주어진 이름입니다. 루크린은 활성 성분이 류프로렐린 아세테이트인 GnRH 아고니스트입니다. 4개 , 7명 , 17세 , 18세 , 19세 , 20개 , 26세 , 27세 , 38세 , 39세 , 40 , 41세 , 42세 , 43세 , 44세 , 45세
| 학년 | 생식 상태 | 설명 |
| 0 | 비 중력 | 알이 보이지 않습니다. |
| 1개 | 초기 중력 | 알수 있는 계란 (1-2mm 크기) 계란과 관련 된 뚜렷한 반향 라인. |
| 2개 | 미드 그레이비드 | 계란 크기 2-3mm, 각 계란과 관련 된 뚜렷한 반향 라인 (들). |
| 3개 | 늦은 그레이비드 | 계란 크기 4-5mm, 에코 라인은 여전히 볼, 계란의 무반향 외관의 증가를 표시. |
| 4개 | 보유 계란 | 내부 계란 구조에 존재하는 반향 물질의 다양한 정도, 무정형 모양에 걸릴. 몇몇은 바디 구멍에 있는 액체 보유와 아주 반향되고 연관될 수 있습니다. |
표 2: 포로 여성 괴수의 생식 상태를 채점하는 데 사용되는 채점 시스템 및 라나 무스코사 초음파에 의해.
| 약물 | 복용량 및 경로 | 댓글 - 참조 |
| 부프레노르핀 | 50 mg/Kg (인트레이슬로믹) | 동부 붉은 점박이 뉴트(노토프탈무스 비라이드센스)에서실험 연구. 진통제는 수술 전에 주어져야합니다. (쾰러, 2009년) |
| 부판파놀 | 1 – 10 mg/Kg (IM 또는 인트레이슬로믹) | 다양한 특정 레스폰이 있습니다. 1 mg/kg부터 시작하는 것이 좋습니다. |
| 부판파놀 | 0.5 mg/L (목욕) | 동부 붉은 점박이 뉴트(노토프탈무스 비라이드센스)에서실험 연구. (쾰러, 2009년) |
| 펜타닐 (동음이의) | 1 mg/kg | 진통 > 4 시간, 날트렉손에 의해 길항 (스티븐스, 1997) |
| 멜록시캄 | 0.1 ~ 0.2 mg/kg (IM) | (민터, 2011) |
표 3: 양서류의 진통에 대한 프로토콜.
| 라나 무스코사 | ||
| 년 | 2014년 | 2015년 |
| 아니오 ♀ | 18세 | 18세 |
| 계란 개발 | 61% | 94% |
| 제어 ♀ | 4개 | 6개 |
| 암피클스 ♀ | 4개 | 7명 |
| 평균 일 게시물 Amphiplex oviposit | 10.5 | 10.9 |
| 오비포지션 레이트(암피플렉스) | 22.20% | 33.33% |
| 배반속도(제어) | 22.20% | 38.88% |
표 4: 대조군 포로 여성에 비해 암페플렉스 처리 사이의 생식 매개 변수의 비교 라나 무스코사 2014년과 2015년에
| 괴관 (있는 ) sp. | |||||
| 년 | 1개 | 2개 | 3개 | 4개 | 5개 |
| 아니오 ♀ | 6* | 7명 | 7* | 7* | 7* |
| 계란 개발 | 83% | 100% | 86% | 86% | 86% |
| LHRH ♀ | 3개 | 5개 | 3개 | 6개 | 0 |
| 제어 ♀ | 2개 | 2개 | 3개 | 0 | 6개 |
| 일 후 LHRH 오비포시트 | 5개 | 7명 | 5.5 (범위 3 - 8) | 13세 | 해당 /a |
| 배반율(LHRH) | 60% | 20% | 67% | 17% | 해당 /a |
| 배반속도(제어) | 50% | 50% | 100% | 해당 /a | 67% |
| * n =1 ♀ 계란 개발 없음 | |||||
표 5: LHRH 간의 생식 매개변수 비교 (GnRH) - 처리 및 제어 (멸균수) 포로 여성 괴관 (있는 ) 5년 동안 3종에서 (2012-2017).
그림 1: 개구리를 잡는 세 가지방법. (A) 절차 1. (B) 절차 2. (C) 절차 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 형태 측정 평가. (A,B) SVL/SUL(C,D). 무게, R. muscosa와 D. Necturus에서. (E). 캘리퍼가 있는 크기 측정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 성적인 이형성은 여성에 비해 성인 R. muscosa 남성에 nuptial 엄지 패드에 의해 구별된다. (A) 여성 (B) 남성. 아래쪽 패널은 남성 대 여성의 길이를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: R. muscosa에서 oviposition로 이어지는 생식 행동을 특성화 (A) 구애. (B) 앰플렉서스. (C) 남성 압착 여성 동안 앰플xus. (D,E) 손 받침에 충분한 여성. (F,G) 복부 수축 및 oviposition. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 발달 단계4에따라 생식 상태를 가진 R. muscosa A-B에서 수행 된 초음파 . (A,B) 라나 무스코사에서 초음파 를 수행. (C) 0 등급. (D) 1 학년. (E) 2 학년. (F) 3 학년. (G) 4 학년 (배란 및 유지 계란) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 강관의 초음파 이미지. (A) 1학년. (B) 2 학년. (C) 3 학년 계란. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: R. 무스코사에서 혈액 수집. (A) 궤도 중앙의 턱선 바로 위에 있는 안면 정맥을 정맥 궤도 후방에 구멍을 뚫어 혈액을 채취한다. (B,C) 혈액은 피부 표면에 풀어 놓이고 헤파린화된 모세관으로 집합됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 양서류의 주입 방법. 주사 의 종류 깊이에 따라 바늘의 각도와 깊이가 다를 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 9: R. muscosa에서 호르몬 주입. 암피플렉스 복막 내 주사 라나 무스코사 여성의 호르몬 치료에 의한 배란 유도. 난소는 coelomic 구멍에서 찾아낼 수 있습니다 이 그림의 더 큰 버전을 보기 위하여 여기를 클릭하십시오.
그림 10: 수술 전 준비. (A) 희석 포비동 요오드 용액 (1/10), Trachycephalus 수지 색릭스를 사용하여 수술 영역의 무균 제제. (B) 제노푸스 라에비스또는(C) 레이저 다이오드 피부 절개, 리토바테스 카테비아누스에메스 절개를 깨끗하게 한다. (D) 중복부 정맥, Trachycephalus 수지 조직국을손상시키지 않도록하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 11: 제노푸스 라에비스의 난소 절제술. (A) 큰 지방체를 노출하고 움직이면 달걀 덩어리가 발견됩니다. (B) 혈관을 결부하지 않고 달걀 덩어리의 일부를 소비한다. (C) 완전한 난소 절제술을 위해 전기 소작으로 주변 혈관을 소작시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 12: A. 멕시코에서 수술 전 준비 및 난소 절제술. (A) 멸균 거즈를 적신, 0.75% 클로르헨시딘 용액을 수술 부위에 도포(B). 어깨와 뒷다리 사이의 선은 동물을 세 개의 동등한 부분으로 나누고 파란색 반점이 절개 부위를 표시합니다. (C) 눈꺼풀 리트랙터로 coelomic 절개를 철회합니다. (D) 완전한 난소 절제술을 위해, 전기 소작으로 주변 혈관을 소작시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 13: 생식 단계의 시각적 평가. (A,B) 반투명 피부를 통한 생식 단계의 시각적 평가, Necturus. (C) 반투명 피부, 히알리노바트라치움 (유리 개구리). (D) R. muscosa 전 (오른쪽, 파란색 선) 및 oviposition 후 (왼쪽 - 노란색 선)의 시각적 평가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 14: 계란 보존. (A,B) 계란 보존의 심각한 경우 여성 라나 muscosa. (C) 초음파는 오래된 퇴행성, 계란 (상단) 및 더 큰 계란 (중간 및 하단 패널)을 배란하고 coelom에 갇혀 보여줍니다. (D) 수동 스트리핑으로 회수된 계란을 보존합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 15: (A) 외형(원)에서 반향이 되고 체내 공동(arrow)에서의유체 보유와 연관된 Necturus에서 보유된 난자의 초음파 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 16: oviposited 전체 또는 부분 클러치 (2013-2017)를 oviposit하지 않은 것과 비교하여 포로 여성 Necturus의 백분율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
직접 취급, 육안 관찰 및 형태 측정은 비침습적 기술을 제공하며 여성 생식 단계를 결정하기위한 첫 번째 평가 기준입니다. 그러나, 이 연구 결과는 gravid 난소가 항상 촉진에 의해 확실하게 확인될 수 없다는 것을 보여줍니다. 종에 따라, 그라비드 난소는 때때로 반투명 (그림13A,B) 또는 동물의 복부 측에 완전히 반투명 한 피부를 통해 시각적으로 검출 될 수있다 (그림13C). oviposition를 완료한 암컷은 중력 여성에 비해 그들의 외관에 명백한 변경을 보여줄 수 있습니다 (예를 들면, 느슨한 피부 및 그들의 바디 질량의 30%까지의 손실, 그림 13D). 번식 하는 동안, 남성과 여성 배 란 및 배 란에 근접에 대 한 정보를 제공 하는 특정 행동을 표시 합니다. R. muscosa 표시의 경우에 암컷은 oviposition에 가깝다는 것을 여자는 손잡이를 입력하는 여성으로 시작합니다.
Anurans와 Caudates에 초음파 기술을 적용하면 계란의 유무및 oviposition가 개발 된 계란의 완전 또는 부분 방출과 관련이 있는지 여부를 진단 할 수 있습니다. 따라서, 이 방법은 복부 피부 투명성, 또는 표피 일관성에 의해 변화하는 시각화 기술을 통해 gravid/비 gravid 상태를 결정하는 데 국한되지 않고 생식 상태의 보다 완전하고 정확한 평가를 제공합니다. 다른 수륙 양용 종. 초음파는 동물에 대한 비교적 용이하고 적은 스트레스로 수행 될 수 있으며 (도5 및 도 13)생식 주기를 특성화하고 생식 상태를 결정하는 데 사용할 수 있습니다4. 종에 익숙해지는 것이 중요합니다. 그러나, 이 연구 결과는 Necturus와 R. muscosa가 생식 단계의 유사한 분류를 허용하는 그들의 생식 패턴에 있는 일반적인 발달 표시를 공유한다는 것을 보여주었습니다 (그림 5). 이 기술을 통해 이제 계란 개발포로 Necturus와 R. muscosa에서 높은 이며 이 두 종 계절 패턴을 따릅니다 증거가 있다. 이러한 현상에 대한 이유는 알려지지 않았고 추가 조사가 필요하지만 초음파를 사용하지 않으면 난소 보존 및 부분 배란과 같은 난소 기능 장애의 여러 영역이 발견되지 않았을 것입니다. 이 기술에 대한 미래의 응용 프로그램은 여성이 어떤 주어진 년에서 번식을 위해 선택되어야하는지 여부와 oviposition이 완료되었는지 여부를 결정하는 데 사용됩니다.
R. muscosa에제시 된 혈액 수집 프로토콜, 효과적 이며 동물에 게 최소한의 고통을 일으키는, 포로와 야생 잡힌 된 Anurans에서 호르몬 프로필을 공부 하는 최적 (Calatayud, 게시 되지 않은). 날짜를, 포로 R. muscosa의 연간 호르몬 프로필에 관한 아무 정보 존재 하 고, 따라서, 호르몬그들의 건강 및 재생에 영향을 미치는 방법에 대 한 지식. 더욱이, 이 종의 암컷이 연례 브리더가 아닐 수도 있다는 증거와 함께, 호르몬 프로파일링은 난소 주기를 추적하는 또 다른 방법이 될 것입니다. 초음파와 함께, 호르몬 분석은 여성이 oviposition에 대한 준비가 될 것입니다 무엇의 더 나은 예측으로 이어질 수 있습니다. 게다가, 작년에, 포로 R. muscosa 인구에 있는 성교의 2개의 케이스는 문서화되었습니다. 또한, 엄지 패드의 개발은 오래된 창립 여성의 일부에 주목하고있다. 이 대 한 이유는 현재 조사 하지만 초기 결과 남성 호르몬 수준에 변화에 관련 될 수 있습니다 제안 (Calatayud, 게시 되지 않은). 다른 나이의 여성에 있는 분별 있는 호르몬 주기는 왜 여성이 남성 관련 이차 성적인 특성을 개발할 수 있고 이것이 노후화 인구에서 예상될 수 있는지 여부를 이해하는 것을 도울 것입니다.
외인성 호르몬 치료는 포로 양서류에서 자주 발생하는 생식 기능 장애를 극복하기 위해 사용되었습니다. 그러나, 이 연구에서 R. muscosa와 Necturus 인구에 대 한, 호르몬 치료 및 제어 여성 사이의 oviposition에 유의 한 차이 2 그리고 5 년의 기간 동안 각각 발견 되었다. 이 호르몬 관리 프로토콜을 나타낼 수 있습니다., 복용량, 프라이밍 및 호르몬 조합 사용 종에 대 한 적절 한 되지 않았습니다. 개별 적인 여성 생식 역사의 가까운 분석은 R. muscosa는 또한 취급한 여성에서 관찰된 호르몬 효력의 부족을 설명할 수 있던 연례 사육을 경험하지 않을 수 있다는 것을 건의합니다. 여성의 일정 비율이 지속적으로 매년 번식을 건너 뛰었기 때문에, 종의 자연사를 이해하는 것은 외인성 호르몬에 대한 필요성이 있는지 여부와 가장 효과적 일 수 있습니다 때 를 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 문서에 설명 된 절차는 종의 숫자에 적용 할수 있습니다, (표 1) 5g에서 150g에 이르기까지 아누란입니다; 큰 동물은 다른 주사기와 바늘 게이지를 요구할 수 있습니다. 주사의 위치는 근육 내, 복막 내, 하위 절단 또는 상하 주사를 필요로하는 일부 호르몬에 따라다릅니다 (그림 7).
난소 절제술의 목적을 위한 수술은 배아학 연구를 위한 난모세포를 얻기 위하여 각종 양서류 종에서 이용된 일반적인 방법입니다. 난소 절제술은 또한 인구 통제 및 계란 보유와 같은 의학 문제점을 위해 표시될 수 있습니다. 연구 목적으로 난모세포 수확이 수행되는 부분 난소절제술의 경우, 수술은 동물이 생식상태로 남아 있는지 확인해야 합니다. PGF2α의 투여는 여성 R. muscosa에서계란 보존을 해결하는 몇 가지 약속을 보여 주었다. 몇몇 개별에서, PGF2α는 이전에 보유한 계란의 완전한 증착을 유도했습니다 그러나 그 외에서는 모든 계란을 제거하기 위하여 수동 스트리핑을 요구하는 부분적인 증착만 발생했습니다. PGF2α는 R. muscosa에서난자 보존을 위한 수술의 대안으로 작용할 수 있지만, 다른 양서류에서 유사한 병리학적 상태를 치료하는 능력은 종별 유효성 검사를 필요로 합니다. 외과 적 개입이 Anuran 또는 Caudate 환자를 위해 위임될 때, 절개가 이루어지기 전에 마취의 적당한 비행기를 보장할 필요가 있습니다. 각 taxa에 대한 이 연구에 설명된 규범적 유도 및 복구 응답을 평가하고 모니터링하기 위해 예리한 관찰 기술이 필요합니다. 일단 특정 해부학, 적절한 외과 적 접근법, 지혈, 부드러운 조직 조작 및 적절한 수술 후 관리에 익숙해지면 생식 수술은 압도적 인 장애물을 제기하지 않습니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
Natalie Calatayud는 바바라 듀란트 박사에게 초음파 교육 및 지원에 감사드리며, SDZG의 연구 동료 직책에 재정 지원을 수여한 S.A.(EISA)의 익스플로라도라도라 드 임무에블스(EISA)에 감사드립니다. 원고에 대한 의견뿐만 아니라 공식 검토자에 대한 의견 카일리 지팡이 박사에게 감사드립니다 (누구든지 될 수 있습니다). 조나단 Dain 덕분에 우리의 2018 여름 펠로우, 사진을 제공하기위한 보존 연구를위한 샌디에고 동물원 연구소 (그림1A,B). 모니카 스눕스는 동물원 및 수족관 보존 기금 협회와 디즈니 월드와이드 보존 기금에 감사를 표하며 포로가 된 강인인구를 확립하기 위한 재정적 지원을 제공하고 있습니다. 또한, 수륙 양용 옹호자 인 아이리스 드 라 모테 (Iris de la Motte)의 개인 기부를 통해 지원도 받았습니다. 감사합니다, 씨 크리스토퍼 DeChant와 박사 마크 캠벨 연구에 중요한 기여를 주어집니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems | GE medical systems | GE logiq Book XP | Ultrasound |
| Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex | GE medical systems | 8C-RS (10 MHz) | Ultrasound probe |
| BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle) | Mettler Electronics Corp CA | Sonigel | Ultrasound gel (water soluble, salt-free) |
| Hormone | |||
| Gonadotropin releasing hormone | BACHEM | 4012028 | synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate abbreviation: GnRH |
| Lutenizing hormone releasing hormone | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4033013; L1898 | synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt; [D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate abbreviation: LHRH |
| Human chorionic gonadotropin | BACHEM, Sigma-Aldrich | 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 | synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU) abbreviation: hCG |
| Prostaglandin 2α | Sigma-Aldrich | P40424; | synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris; abbreviation: PGF2α |
| Follicle-stimulating hormone | Sigma-Aldrich | F4021, F8174 | synonym: porcine, sheep abbreviation: FSH |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | 46665; P7556 | synonym: Vetranal; P4 water soluble abbreviation: P4 |
| Pituitary extract | na | synonym: Check papers for amphibian species derivation abbreviation: PE |
|
| Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec; Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich | HOR-272; 493-10; 9002-70-4 | synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin abbreviation: PMSG |
| Metaclopromide | Sigma-Aldrich | M0763 | synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide abbreviation: MET |
| Lucrin | BACHEM; Sigma-Aldrich | 4033014; L0399 | synonym: Leuprorelin acetate abbreviation: Lucrin |
| Lutalyse | Pfizer | synonym: PGF2α - Dinoprost tromethamine abbreviation: Lut |
|
| Pimozide | Sigma-Aldrich | P1793 | synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one abbreviation: PZ |
| Amphiplex | see above | synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide abbreviation: GnRH + MET |
|
| Ovopel | Ovopel | na | synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg) abbreviation: Ovo |
| Ovaprim | Pentair aquatic eco-systems | Ova10 | synonym: Salmon gonadotropin + domperidone abbreviation: Ova |
| Domperidone | Sigma-Aldrich | D122 | synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine abbreviation: DOM |
References
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