Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Reproduktive teknikker for eggstokkene overvåking og kontroll i amfibier

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/58675
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 2, 4
1Reproductive Sciences, San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 2Recovery Ecology, San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 3Menagerie du Jardin des Plantes, Museum National d'Histoire Naturelle, 4Cincinnati Zoo & Botanical Garden, Center for Conservation and Research of Endangered Wildlife

Summary

Studiet av amfibier biologi gir verdifull informasjon om reproduktive, fysiologiske, embryological og utviklingsmessige prosesser som driver organismer av mange taksonomisk grupper. Her presenterer vi en omfattende guide på ulike metoder som kan brukes til å studere eggstokkene kontroll og overvåking i amfibier.

Abstract

Kontroll og overvåkning av eggstokkene i amfibier krever en mangesidig tilnærming. Det er flere programmer som kan lykkes indusere reproduktiv atferd og oppkjøp av kjønnscellene og embryo for fysiologisk eller molekylær forskning. Amfibier bidrar til en-12:45-tredjedel av virveldyr forskning, og av interesse i denne sammenhengen er deres bidrag til det vitenskapelige samfunnets kunnskap om reproduktive prosesser og embryological utvikling. Imidlertid er det meste av denne kunnskapen avledet fra et lite antall arter. I nyere tid har uttynning av amfibier over hele kloden krevde økende intervensjon av conservationists. Den fange utvinning og forsikring kolonier som fortsetter å dukke opp som svar på utryddelse risikoen gjøre eksisterende forskning og kliniske applikasjoner uvurderlig for overlevelse og reproduksjon av amfibier holdt under menneskelig omsorg. Suksessen til enhver fange befolkning er grunnlagt på sin helse og reproduksjon og evnen til å utvikle levedyktige avkom som viderefører den mest varierte genetiske representasjon av deres arter. For forskere og veterinærer, evnen til å overvåke og kontrollere eggstokkene utvikling og helse er derfor avgjørende. Fokuset i denne artikkelen er å fremheve de ulike assistert reproduktive teknikker som kan brukes til å overvåke og, der det er hensiktsmessig eller nødvendig, kontroll eggstokkene funksjon i amfibier. Ideelt sett bør eventuelle reproduktive og helsemessige problemer reduseres gjennom riktig fange husdyrhold, men som med alle dyr, spørsmål om helse og reproduktive patologi er uunngåelig. Ikke-invasive teknikker inkluderer atferdsdata vurderinger, visuell inspeksjon og palpasjon og morphometric målinger for beregning av kroppens tilstand indekser og ultralyd. Invasive teknikker inkluderer hormonelle injeksjoner, blod prøvetaking, og kirurgi. Eggstokkene kontroll kan utøves på en rekke måter, avhengig av søknaden som kreves og arter av interesse.

Introduction

Amfibier har lenge vært anerkjent som viktige biologiske og medisinske modeller av et bredt spekter av forsknings disipliner. Data innhentet ved å studere spesielle arter som Xenopus laevis og X. tropicalis, Leopard frosken (Lithobates (tidligere Rana) Pipiens) og Axolotl (Ambystoma mexicanum) har blitt brukt til en rekke andre virveldyr, inkludert mennesker. Den veterinær, husdyrhold og assistert reproduktive teknikker som har kommet fra å studere disse og andre amfibier gi bistand til de som oppgave med å utvikle vellykket omsorg, vedlikehold og bærekraft av sjeldnere populasjoner i fangenskap 1 den andre , 2 andre priser , 3 andre priser , firetil.

Interessen er økende for samtidig bruk av in og ex situ bevaring-baserte tilnærminger til å reversere tidevannet av utryddelse for mange i fare amfibier arter1,2. Denne artikkelen gir metoder for øyeblikket tilgjengelig for å overvåke og kontrollere amfibier eggstokkene funksjon i modellen arter av anurans og Caudates. I tillegg er eksisterende teknikker for å løse en vanlig reproduktiv patologi av egg oppbevaring presenteres.

Som i mange taksonomisk grupper, amfibier eggstokkene kontroll innebærer en rekke tett synkroniserte interaksjoner mellom miljø og fysiologi. Temperatur og photoperiod (kjent som proximate signaler) dekodes av øyet og hjernen der de omdannes raskt til genetiske, hormonelle og døgn prosesser (ultimate signaler)3,4. Metodene for å overvåke og kontrollere eggstokkene funksjon som dekkes i denne artikkelen inkluderer invasive og ikke-invasiv teknikker. Institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) forskning og undervisning krav definere ikke-invasiv teknikker som de som vil føre til minimal til ingen fysisk smerte eller mental nød, og krever ingen smertestillende medikamenter5. Her, ikke-invasiv teknikker inkluderer visuell inspeksjon og palpasjon, atferdsmessige observasjoner, morphometric vurderinger og ultralyd. Tvert imot, teknikkene av blod samling, hormon administrasjon og kirurgi (ovarieektomi og fjerning av beholdt egg) er klassifisert som invasiv siden de kan føre til noen smerte eller ubehag og krever anestesi eller post-prosessuelle narkotika terapi.

Ikke-invasiv eggstokkene overvåking teknikker kan enkelt innlemmes i den daglige pleie rutine for de fleste fange amfibier. Avhengig av arten, eggstokkene svangerskap kan ofte bestemmes av enkel visuell inspeksjon (glass frosk). I andre tilfeller kan palpasjon indikere om en kvinne er gravid. Ulike kroppen tilstand indekser (BCI) som vekt, snute urostyle lengde (SUL), snute-vent lengde (SVL) og standard Mass Index (SMI) er tilgjengelig for å forutsi tilstedeværelse eller fravær av egg4,6,7, 8,9. Imidlertid bør forsiktighet tas med tolkningen av resultatene som de fleste ikke vurdere alder, kroppsfasong eller sammensetning (f. eks vann beholdt versus eggstokkene masse eller fett)6. Definitive reproduktive diagnoser kan oppnås via ultralyd med mer inngående kunnskap om egg utvikling og Oppsamling av cyster på fire eggstokkene syklus4,7. Ultralyd gir også et middel for å bekrefte og overvåke reproduktive patologi og tilhørende fysiologiske forhold4,8.

I tillegg til å gi informasjon om helsetilstand, kan blod prøvetaking brukes til å måle reproduktive hormoner. Hvis hormon profilering er det endelige målet, det er viktig å unngå stress-relaterte påvirkninger som kan forvirre systemisk steroid data. Stund en muligheter kraftfull avlytting verktøyet, det er ennå å bli en studere demonstrasjon medfødt endocrinological Svar å eksogene hormon administrasjon dersom noe amfibier art. Blod kan trygt tas fra flere steder; i frosker dette inkluderer ventrale abdominal vene, flerspråklig plexus, lår blodåre og hjerte9,10. I Caudates, blod er samlet fra ventrale halen vene. Graden av invasiveness, mengden av tilbakeholdenhet nødvendig, behovet for bedøvelse, delikatesse av orgelet blir målrettet, og størrelsen på dyret er faktorer som skal vurderes når du velger en samling teknikk for amfibier pasienten. Denne artikkelen vil presentere teknikken av blod samling fra ansikts maksillære eller musculocutaneous vene av frosker som opprinnelig beskrevet av Forzan et al.9.

Eggstokkene kontroll er arter-spesifikke og, som sådan, hormon protokoller bør testes og optimalisert. Annet enn sesongavhengige og tilhørende sirkulerende hormon miljøet, kan eggstokkene kontroll også være tett knyttet til alder, tidsbruk i fangenskap og eksponering for gjentatte Hormone administrasjon, som det er lite informasjon i litteraturen11 , 12 flere , 13. gjennomføringen av Hormone terapi for å lokke fram reproduktive atferd, Kjønnscelle produksjon, modning og oviposition har blitt en utbredt rapportert tilnærming til å løse vanlige reproduktive problemer forbundet med fangenskap4, 8,14,15,16. Fordi mekanismene kontrollerende reproduksjon i virveldyr er svært bevart, er det en rekke hormoner, nevropeptider og kommersielt tilgjengelige legemidler som brukes terapeutisk i andre taksonomisk grupper som også kan brukes pålitelig i en rekke amfibier arter (tabell 1). Gonadotropin-lanserer Hormone (GnRH) og humant gonadotropin (HCG) (eller variasjoner av disse, dvs, PMSG og EKG)17,18, enten individuelt eller i kombinasjon, har blitt brukt mye i amfibier fange avl programmer inkludert: den sørlige Rocky Mountain Boreal (Anaxyrus Boreas Boreas)4,19,20; soppen, Dusky Gopher frosk, Rana sevosa (Langhorne et al., upublisert)7; Gulf kysten Waterdog, Necturus beyeri20; Wyoming padde, Anaxyrus baxteri18; Bullfrog, Rana catesbiana21; den amerikanske padde, Anaxyrus americanus22; gresset frosk, Lymnodyaster tasmaniensis23; Coqui, Eleutherodactylus coqui24; Xenopus, Xenopus laevis25; Gunther ' s toadlet, Pseduophryne guentheri26; den nordlige Leopard frosken, Lithobates Pipiens; den argentinske horn-frosk, Ceratophrys utsmykkede; Cranwell ' s horn-frosk, C. cranwelli; den amerikanske Ground-Frog, Odontophrynus americanus27; og ilden Salamander (Salamandra)228. Steroid hormoner, som progesteron (P4), er mindre vanlig rapportert, men har vist god effekt i fremlokkende eggløsning og oviposition i enkelte arter av anurans16,18,29. Prostaglandiner (spesielt prostaglandin 2-Alpha (PGF2α)) er involvert i ovulation sammen med kortikosteroider30,31,32,34 og nå høye nivåer under ovulatory fase31.

I in vitro studier, er PGF2α en potent induser av ovulation31, mens in vivo det kan indusere oviposition av beholdt egg i Rana muscosa4,30,32. Hypofysen ekstrakter er også effektiv induktorer av eggløsning15,16,34; men bekymringer rundt biosikkerhet og potensialet for sykdoms overføring er ofte en avskrekkende for fanger avl kolonier når du vurderer denne tilnærmingen35.

Den siste delen av denne artikkelen detaljer kirurgiske prosedyrer og gir alternative tilnærminger for å utvide eggstokkene studier eller hjelp med oppløsningen av reproduktive patologi. Ovariectomies er vanligst utført i amfibier for å få oocytter for embryological forskning. Men det kan også gi et middel for beholdt egg når en annen alternativer mislykkes. Selv om denne prosedyren er invasiv, krever full anestesi og snitt for å avdekke egg massene, krever det ikke døds aktiv. Videre, etter delvis ovarieektomi, dyrene kanne lage en i sin helhet det å bli frisk og fortsette å bli reproductively aktiv stolpe-kirurgi8,36.

Protokollene beskrevet nedenfor skisserer invasiv og ikke-invasiv metoder for eggstokkene kontroll og overvåking i anurans og Caudates. Den spesifikke arten valgt å illustrere teknikker i anurans inkluderer R. mucosa og X. laevis. Necturus maculosus, n. beyeri, n. alabamensis, og A. mexicanum omfatter arten som brukes til å beskrive teknikker i Caudates på samme måte.

Protocol

Salamander prosedyrer ble godkjent av Cincinnati Zoo & botanisk hage (CZBG) institusjonell pleie og bruk Committee (IACUC) protokoller 11-106, 13-110, 14-133, og 15-138. Alle frosk og padde prosedyrer ble godkjent av San Diego Zoo global (SDZG), institusjonell pleie og bruk Committee (IACUC) protokoller: 15-001, 16-005 og 18-003.

Pleie og behandling av dyr ble godkjent av etisk komité av National Museum of Natural History (Paris) (Museum National d'Histoire Naturelle-menangerie du Jardin des Plantes (MNHN)), i samsvar med institusjonelle og nasjonale retningslinjer (Commission de Génie Génétique, Direction Départementale des Services Vétérinaires, EU-direktiv 2010/63/EU, avtale vedtak nr. C75-05-01-2 for den europeiske konvensjonen for virveldyr dyr som brukes til eksperimentell og andre vitenskapelige formål. Alle protokollene som ble brukt i denne studien ble godkjent under referansenummeret 68-037.

1. ikke-invasiv eggstokkene overvåking teknikker

  1. Visuell inspeksjon og palpasjon
    1. Hold den kvinnelige Anuran på en av de tre måtene som er beskrevet nedenfor.
      1. Sikre frosken eller padde beina med ringen og lillefingeren, støtter rygg side (buk) av frosken kropp med indeksen og langfinger og ventrale side med tommelen (figur 1a).
      2. Hold frosken eller padde i den dominerende hånd med tommelen på magen og resten av fingrene sikring baksiden av dyret. Bruke den ikke-dominerende hånden til å palpate dyrets mage, føler hvis det er subdermal Teksturdybde (figur 1B).
      3. Hvil frosken eller padde magen på håndflaten av hånden, foran armene drapert over pekefingeren og en tommel på øvre del av ryggen.
    2. Siden Caudates er helt akvatiske i naturen, utføre visuell inspeksjon av en av to metoder som er beskrevet nedenfor.
      1. Flytt dyret til en separat 4 L beholder som inneholder tank vann. Hold beholderen (lokket sikret) opp og skinne lommelykt på undersiden for å visualisere tilstedeværelse/fravær av egg.
      2. Bedøve i MS222 (0,5 g/L; Tricaine methanesulfonate, bufret med 0,5 M NaHCO3). Etter induksjon, rotere dyr på ryggen og undersøke magen.
  2. Morphometric vurderinger
    1. Anurans
      Merk: anestesi er ikke nødvendig.
      1. Bruke markører, måle dyret fra spissen av munnen, langs midten av kroppen til spissen av halen for å få SUL og SVL (figur 2a, B).
      2. Tare en plastbeholder på en digital presisjons skala. Plasser dyret i en taraveies beholder og veie (figur 2C).
      3. For større dyr, som Bullfrogs, eller ved innhenting av vekter i felten, bruk en hengende skala (figur 2D).
      4. Som i mange anuran arter, skille R. muscosa voksne kvinner fra menn av deres større størrelse og mangelen på bryllups (tommel) pads på hendene (Figur 3).
      5. Beregn kroppen tilstand, som en grunnleggende vurdering av generelle helse ved følgende formel:
        Fulton ' s index: K = masse ÷ lengde3
        Merk: Fulton ' s index bruker en dimensjonal balanse mellom volum relatert til masse og lengde der 3 er skalering eksponent som relaterer masse og lengde isometrically.
    2. Caudates
      1. Tare skala med en tom veske før du plasserer det ikke-anesthetized dyret inni. Ta vare å ikke innføre overflødig vann (figur 2D) og handle raskt som dyr skiller Slim som et stress Svar å være behersket.
      2. Få voksen tiltak ved å immobilizing individer i en rett posisjon på bunnen av en re-sealable plastpose eller i en egen plastbeholder som kan romme utvidet markører.
      3. Mål kroppens lengde med markører (figur 2e).
      4. Mål nucleus caudatus fra tuppen av snute til tuppen av halen (SVL) for å overvåke vekst.
  3. Atferdsmessige observasjoner
    1. Fysisk observere dyr i sanntid, eller bruke et videokamera til posten oppførsel.
    2. Record observasjoner av dyr kategorisere atferd og konstruere en ethogram (Figur 4).
    3. Klassifisere reproduksjons atferd
      Merk: Figur 4 illustrerer en type reproduksjons atferd observert i anurans.
  4. Ultralyd
    Merk: ultralyd svingeren av valget, i dette tilfellet, 7,5 mHz lineær eller en multi-frekvens (10-6 mHz) mikro-konveks, er anbefalt for Necturus og en 10 MHz sonde og vannløselige, salt-fri gel for R. muscosa. Å utføre ultralyd på salamandere kan kreve anestesi (se avsnitt 1,5 for instruksjoner).
    1. Anurans
      1. Utfør ultralyd på R. muscosa med to personer (figur 5a).
      2. Første person: Hold dyret med den dominerende hånden og anvende vannløselige, salt fri gel til dyrets mage.
      3. Andre person (Ultra-sonograf): ta 10 MHz sonde i den dominerende hånden og bruke den til magen og pass på å gjøre god kontakt mellom sonden og gel.
      4. Skyv innover fra rett underarm gropen mot midten av dyrets abdominal midtlinjen for å visualisere hele eggstokken.
      5. Ultra-sonograf: Bruk ikke-dominerende hånd å fryse ramme og fange de ønskede bildene på ultralyd.
      6. Kategorisere stadiet av eggstokkene syklus av gradering systemet etablert for slekten4 (tabell 2, figur 5B-F).
      7. Skyll eventuell gel av dyret på slutten av prosedyren.
    2. Caudates
      1. Overfør ikke-anesthetized Necturus til 4 l rektangulær beholder fylt med 2 liter tank vann.
      2. Minimer dyret bevegelse ved å slå på rommet lysene av og/eller kopp en hånd over hodet på dyret.
      3. Plasser svingeren i en avstand på 1-2 cm fra kropps veggen.
      4. Finn hjertet på ventrale midtlinjen nivå til forelimbs og deretter flytte svinger distally og undersøke eggstokkene vev7.
      5. Kategorisere kvinner i henhold til gradering system etablert for slekten4 (figur 6a, B, C).
      6. Oppnå nøyaktige målinger av egg på midten til sen-gravid scenen ved å ta bilder når dyrets kropp er i en vinkel til svingeren (dvs. ikke lineær, men svak bue; Figur 6b). Ellers, overlappende sekker gjør det vanskelig å differensiere individuelle egg størrelse.
  5. Bedøvelse induksjon og utvinning
    1. Anurans
      1. Bedøve i MS222 (0,5 g/L; Tricaine methanesulfonate bufret (0,5 M NaHCO3) som beskrevet tidligere.
      2. Bruk rettende refleks som en primær indikator på i hvilken grad dyret har blitt anesthetized. Fullstendig tap av refleks demonstrerer en tilstand av dyp anestesi.
      3. Fjern dyret fra vann-bad-basert anestesi (MS-222) når rettende refleks er tapt.
      4. Plasser dyret på en våt (med bedøvelse-fri de-klor vann) håndkle.
      5. Sørg for å holde dyret fuktig under hele kirurgisk prosedyre.
      6. Intubere små amfibier med rød gummi katetre, uncuffed rør eller klassiske håndjern endotrakeal rør uten å blåse opp mansjetten.
      7. Gi en lav strøm av oksygen (0,5-0,75 L/min) med 0,5-1% isoflurane.
      8. Stopp isoflurane etter inngrepet, men hold flyten av oksygen i 1 minutt.
      9. Ekstubere dyret og skyll dyret grundig med anestesi fritt dechlorinated vann i 2 minutter.
      10. Sett dyret i en grunne mengde av de-klor vann eller på et vått håndkle.
      11. Evaluer dyrets oppsving ved å dra forsiktig i et bakben til forlenge. Enhver reagerer sammentrekning av lem indikerer abstinens refleks.
      12. Monitor andre indikatorer for utvinning som Gular respirations (hals bevegelse) og rettende refleks.
      13. Tenk amfibier utvinnes når alle reflekser har returnert, og hjerte og åndedrett priser har vendt tilbake til pre-anestesi verdier.
    2. Caudates
      1. Bedøve Necturus og Ambystoma i MS222 (0,5 g/L av Tricaine methanesulfonate, bufret med 0,5 M NaHCO3, (MS222) i en 4 L rektangulær tank.
      2. Plasser en luft stein (1 tomme) og luft pumpe inn i tanken og slå den på en konstant flyt for å gi tilstrekkelig oksygenering.
      3. Når lem funksjon og rettende refleks er tapt, fjerne dyret fra vann-bad-basert anestesi (MS-222) og sette dyret på en våt (med bedøvelse-fri de-klor vann) håndkle.
      4. Oppretthold hud og Gill fuktighet med en klem flaske tank vann.
      5. For å gjenopprette dyret, forsiktig plassere den ventrale side ned i en 4 L plastbeholder fylt med 2 L av tank vann med en luft stein.
        Merk: Recovery starter med Gill blinkende, etterfulgt av muligheten til å flytte halen og drive frem og til slutt funksjonell bevegelse av lemmer.
      6. Tilbake dyret til sin opprinnelige bolig tank og overvåke tett over de neste 24 h.
        Merk: andre metoder for anestesi for amfibier finnes, og disse er beskrevet i Wright og Whitaker8.

2. invaderende eggstokkene overvåke og kontrollere teknikker

Merk: denne prosedyren er tilpasset fra Forzán et al.10.

  1. Hold frosken i den dominerende hånden, og DAB tørke den venepunksjon siden av frosken ansikt med en steril tørk eller gasbind.
  2. Tørk ansiktet for å unngå at blodet sprer over huden for mye.
  3. Sett inn nålen (26 G 1/2 "og 27 G 1/2"), med skråkanten vendt oppover, gjennom huden der den hevede huden rundt øyet og den øvre kjeve ryggen møtes for å danne et punkt i en trekant (gul kontur) (figur 7a) tilgang til vena facialis nær vena orbitalis bakre.
  4. Punktering av ansikts vene under høyre øye og over øvre kjeve ryggen, starter mellom 1-2 mm tilbake fra midtlinjen i øyet (figur 7a).
    Merk: for mindre frosker (under 20 g), Flytt innsettingspunktet nærmere en posisjon rett under midtlinjen av øyet.
  5. Vinkel microhematocrit røret nedover for å muliggjøre tyngdekraften for å hjelpe blod strømme inn i røret. Blod skal flyte umiddelbart etter punktering (figur 7b, C).
  6. Ved første tegn på blodstrøm, plasserer spissen av microhematocrit tube på punktering stedet og samle 1-2 full microhematocrit rør av blod og plassere rør i egnede beholdere for innsamling (figur 7b, C).
  7. Hvis blodet ikke flyter lett, eller volumet er svært lavt, Skift innsetting av nålen litt eller sett nålen inn i den andre siden av ansiktet.
  8. Stopp blødning ved å trykke gasbind fast til punktering stedet i minst 20 s.
  9. La frosken ut av vannet i 10 minutter for å bekrefte punktering området ikke gjenåpne.
  10. Bruk en ny nål og nye microhematocrit rør for hver frosk samplet.

3. hormon induksjon

  1. Hormon forberedelse
    1. Forbered hormon injeksjoner umiddelbart før bruk for å sikre maksimal effekt.
    2. Velg et hormon fra valget oppført i tabell 1.
    3. Bestem konsentrasjonen av hormonet som skal injiseres ved hjelp av en μL eller mL/g av kroppsvekt16.
    4. Fortynne hormonet i ett av følgende: vann, fosfat bufret saltoppløsning (PBS), saltvanns amfibier ringer ' s løsning (SARS) eller saltvann.
    5. Ikke overstige et injeksjonsvolum på 200 μL for frosker som veier 30-70 g og 300 μL for frosker som veier 80-110 g (personlig observasjon)16.
    6. For korrekt beholdning av en dyr i løpet av hormon administrasjon av alle dyr oppstiller fra 10-100 g, bruk noen av det passende metoder for avholde beskrevet inne avdeling 1,1.
  2. Anurans
    1. Beregn konsentrasjonen som kreves per individ ved hjelp av et gram per kroppsvekt beregning (g/kroppsvekt).
    2. Like før administrasjon, Rekonstituer i en steril fortynningsvæske av valget.
    3. Pass på at det ikke blir bobler igjen i sprøyten før injeksjonen.
    4. Hold dyret sikkert i den ikke-dominerende hånden og administrer injeksjonen med dominerende hånd.
    5. Administrere injeksjon i henhold til hormon spesifikasjoner. De vanligste injeksjoner i anurans er sub-hud, intra bukhulen eller intra muskel (Figur 8).
    6. Administrere IP-injeksjoner i nedre del av magen eller i den nedre delen av rygg siden av kroppen nær bak benet (figur 9).
    7. Administrere intra-muskuløse injeksjoner fortrinnsvis inn bakbena.
  3. Caudates (Necturus)
    1. Rekonstituer hormonet av valget i sterilt vann i henhold til gram per kroppsvekt metoden beskrevet ovenfor.
    2. I tilfelle av Necturus, bruk doser på 1,7-2,3 μg GnRH/g kroppsvekt.
    3. Fjern Necturus fra anestesi kammeret og plasser på en 45 ° overflate dekket med kirurgisk gardin.
    4. Plasser dyret med hodet pekende nedover.
    5. Approach bakre kvadrant i buken (caudal av bakre ben) ved en 15-20 ° vinkel. Pass på at du ikke innfører luft i sprøyten.
    6. Injisere (IP) ved hjelp av en insulinsprøyte og 27-30 G nål.
    7. Injiser hormonet ved hjelp av en insulinsprøyte og 27-30 G nål.

4. kirurgi

  1. Generell kirurgisk forberedelse og prosedyre
    1. For å opprettholde aseptisk prosedyrer, bruk klare, sterile plast forheng for å isolere operasjonsstedet. Reduser fordampning ved å holde huden rundt fuktig.
    2. Fukt alle materialer som vil ta kontakt med dyrets hud med sterilt vann. Gjør huden innsnitt med et nummer 15 eller nummer 11 skalpell blad.
      Merk: en kombinasjon av kald stål, Radiosurgery eller Diode Laser. Hemostase i mild hemoragisk prosedyre kan oppnås ved electrocauter eller Diode Laser.
    3. Bruk bomull-tippet spyd eller applikatorer å tillate anvendelse av lokaliserte trykk til små fartøy holde styr på blodtap.
    4. Bruk bomulls spisser eller applikatorer til å håndtere små trange rom i stedet for vanlige gasbind-firkanter.
    5. Bruk mikro-instrumenter, som oftalmologisk instrumenter, med fine, små tips, når du utfører kirurgi på dyr ' veiing mindre enn 1 kg.
    6. Bruk plast, selv beholde sårhaker (f. eks Lone Star retractor) til å passe ulike størrelser av snitt.
    7. Bruk øyelokk sårhaker for trekke coelomic snitt.
    8. Bruk forstørrelses instrumentering der det er nødvendig for å utføre kirurgi på mindre pasienter.
      Merk: analgesi er nødvendig med en kirurgisk prosedyre i amfibier. Unnlatelse av å administrere tilstrekkelig analgesi under operasjonen er forbundet med forsinket retur av normale funksjoner. Videre analgesi potenserer virkningene av anestesimidler (tabell 3)34.
  2. Anurans
    1. Når X. laevis er anesthetized som beskrevet i trinn 1.5.1, plasser dyret i rygg Recumbency (Figur 10A, C).
    2. Forbered operasjonsfeltet aseptisk ved å tørke fuktig sterilt gasbind med fortynnet povidon-jod løsning (1/10) på stedet for 10-15 s eller 0,75% klorheksidin løsning på operasjonsstedet i minst 10 min før operasjonen35.
    3. Lag en 3 mm paramedian hud snitt i midten coelom (mellom skuldrene og cloaca) med et dristig slag forlate et rent snitt ved hjelp av en no. 15 eller no. 11 skalpell.
      Merk: man kan bruke en Diode Laser også for huden snitt.
    4. Heve abdominal membran, lage og snitt og analysere nøye ved hjelp av en no. 15 eller no. 11 skalpell. (Figur 10b, D).
    5. Trekk tilbake coelomic snitt med øyelokk sårhaker (eller passende utstyr).
    6. Avgiftsdirektoratet en del av egg masse uten ligating noen blodkar.
    7. For fullstendig ovarieektomi, cauterize rundt blodkar med elektrokautering eller laser diode (Figur 11).
    8. Ved hjelp av monofilament Sutur, lukke celiotomy snitt med en avbrutt, everting Sutur mønster.
  3. Caudates
    1. En gang A. mexicanum har blitt anesthetized, Legg den i høyre lateral recumbency, med venstre bekken lem bare plassert mot halen base.
    2. Forbered operasjonsfeltet aseptisk ved å plassere fuktig sterilt gasbind med fortynnet povidon-jod løsning (1:10) på stedet for 10-15 s. Alternativt, bruk steril gasbind dynket i 0,75% klorheksidin løsning og plasser på operasjonsstedet i minst 10 min før operasjonen (figur 12a)36,37 .
    3. Tegn en linje mellom skulderen og bakbena for å dele kroppen i tre like deler (figur 12b).
    4. Gjør snittet området mellom andre og tredjedeler.
    5. Grip den underliggende muskelen og heve vekk fra coelomic innvollene.
    6. Forsiktig tvinge små hemostats gjennom coelomic muskulaturen og inn i coelomic hulrom.
    7. Trekk tilbake coelomic snitt med øyelokk sårhaker (eller passende materiale) (figur 12C).
    8. For fullstendig ovarieektomi, cauterize omkringliggende blodkar med elektrokautering eller laser diode (figur 12d).
    9. Ved hjelp av monofilament Sutur, lukke celiotomy snitt med en avbrutt, everting Sutur mønster.

Representative Results

Morphometrics og reproduksjon

Visualisering av kvinnelige reproduktive status i amfibier varierer avhengig av arten. Den mest effektive metoden er ultralyd; noen arter kan imidlertid vise varierende grad av gjennomsiktighet i huden (figur 13a, B, C). Visuell inspeksjon kan ofte tydelig illustrere forskjellene mellom en gravid og ikke-gravid kvinne når huden er halvt gjennomskinnelig som observert i N. alabamensis og n. Maculosus (figur 13a, B); eller gjennomskinnelig som illustrert av glass frosken (figur 13C). Den mørke flekket huden farge på magen av N. beyeri forbyr denne vurderingen skal gjøres. I R. muscosa, huden er ikke gjennomskinnelig, men merkbare forskjeller kan oppdages mellom kvinner som er gravid i forhold til de som nylig har oviposited fordi huden er slapp tilstand, og dyret ser tynnere (gul linje) i forhold til en kvinne som er gravid (blå linje) (figur 13D). Med erfaring behandleren kan gjøre seg kjent med forskjellen mellom en stor kvinne og en gravid en, men bekreftelse på gravid scenen vil kreve ultralyd. Body Mass indekser i amfibier kan beregnes ved hjelp av en rekke formler, men deres anvendelse som et prediktiv verktøy for reproduksjon er diskuteres. I tilfelle på R. muscosa, korrelasjon mellom Fulton ' s index, helse og reproduktive status forblir uklart.

Reproduktiv atferd og ultralyd

Våre resultater viser hvordan man karakteriserer reproduksjons atferd i R. muscosa for prediksjon av oviposition (Figur 4). Flere etapper som varer fra noen få timer til flere uker inkluderer, frieri der en mannlig aktivt jager en kvinne (figur 4a), den mannlige mounts og fast spenner på kvinnens rygg, kalt Amplexus (figur 4b). En gang amplexed, det par kanne være igjen inne amplexus for 1 – 5 ukens og det par ville utfoldelse annet opptreden foruten amplexus. Amplexus er en meget aktiv opptreden det inkluderer det mannlig klemme det kvinner inne en bløt pumpe måte (skikkelsen 4c); den kvinnelige flytte rundt og begynner å vise hånd-stand atferd midlertidig (figur 4d, E); og nærmere den tiden av oviposition, den kvinnelige, i en hånd-stand, vil lene seg opp mot overflater som hun kan stikke egg på mens den mannlige pumper hennes mage kraftig (i dette tilfellet er det mulig å også observere den kvinnelige gni hennes buk nedover fra under armen groper mot cloaca. Dette kan være en mekanisk måte å presse eggene ned oviducts) (figur 4f, G).

Denne studien illustrerer hvordan ultralyd kan gi informasjon som å fastslå reproduktive status i kvinnelige R. muscosa og Necturus. Fire stadier av utviklingen er representert i R. muscosa (figur 5c, D, E, F) og er på samme måte karakterisert ved Necturus4 (figur 6a, B, C). I tillegg kan rester av egg ikke bli utvist fører til egg oppbevaring (figur 5G, figur 15A, B). Stage 1 viser en eggstokk rett etter oviposition der hårsekkene er vanskelig å visualisere (figur 5c). Stage 2 er representert ved utseendet av echogenic prikker (hvit flekker) spres gjennom eggstokken (figur 5D). Stage 2 og 3 er representert med større, avrundede echogenic prikker med mørke sentre som representerer åk medium til store sekker (figur 5e, F). Fra 2013-2017, ble fanget kvinnelige Necturus undersøkt av ultralyd på månedlig basis. Under hver eksamen individer ble tildelt en karakter score i henhold til reproduksjons kriteriene fastsatt for slekten (tabell 2). Prosentandelen av kvinner utvikle nye egg hvert år gjennomsnitt 88,2 ± 3,01% (tabell 5). Mens egg utvikling var høy, var oviposition ikke sikret (Figur 16). Et flertall av kvinner som gjennomgikk oviposition avsatt hele komplement av egg, mens noen individer avsatt bare en brøkdel av eggene som utviklet. De R. muscosa og Necturus hunner med beholdt egg samtidig med væske gevinst i kroppen hulrom ble utad visuelt forstørret med røde flekker på huden i samsvar med burst blodkar (figur 14a, B ) . Graden av væskeretensjon kan bli ytterligere vurdert via ultralyd (figur 15B). I begge arter, gjennomgikk egg holdt atresi eller tok på en mer echogenic utseende (figur 14C, D, figur 15A).

Hormon administrasjon

Avhengig av dybden av typen injeksjon vil vinkelen og dybden på nålen variere. For de fleste injeksjoner dybden av nålen trenger ikke være mer enn 1 -2 mm dypt når du arbeider med arter som R. muscosa men vil variere i vinkelen på penetrasjon. Prostaglandin injeksjoner kreves en intra-muskuløse (IM) nål innsetting vinklet på 90 °, inn bak beinet av R. muscosa mens intra-bukhulen (IP) injeksjoner, med en tilsvarende dybde til intra-muskuløse injeksjoner, ble administrert i området av coelomic hulrom ved en 45 ° (Figur 10). Administrasjon av Amphiplex hadde ingen signifikant effekt i å øke antall egg avsatt av hormon-behandlet kvinner i forhold til kontroller (P = 0,547), heller ikke var det noen forskjeller i antall embryo som kløyvde (P = 0,673) eller overlevde til rumpetroll (P = 0,629) (Tabell 4). Generelt, prosentandelen av kvinner ovipositing redusert fra 80% i 2011 til 28% i 2014. Antallet kvinner ovipositing i 2015 var signifikant høyere enn 2013 (P = 0,0002), 2013 (P = 0,0001) og 2014 (P = 0,0026), men ikke 2011 (P = 0,0885), reaffirming ideen om at kvinner av denne arten ikke kan avle årlig og at hormonelle protokoller krever fyll nement. For R. muscosa kvinner med tegn på egg oppbevaring, intra-muskuløse INJEKSJONER av PGF2α hadde en 60% suksess rate i inducing utvisning av degenereres egg. Men i 1 av de 5 hunner injisert, PGF2α var ikke tilstrekkelig til å forårsake fullstendig utvisning og noen egg forble inne i kvinnelige til følgende avl sesongen. Sytten Necturus HUNNER fikk LHRH/(GnRH) og 13 fikk humbug injeksjon av sterilt vann for å tjene som en kontroll (tabell 5). I alt gikk syv kvinnelige Necturus (n = 4 alabamensis, n = 2 beyeri, n = 1 maculosus) på Oviposit elleve fulle klør som ble tilskrevet både GnRH behandlet (n = 6) og kontroll (n = 5) individer. Tre hunner (n = 2 beyeri, n = 1 maculosus) oviposited fem delvise klør (figur 13). Dette fenomenet synes ikke å være assosiert med eksogene Hormone behandling som Trekontroll kvinner tilsvarende avsatt delvise klør (tabell 5). Oviposition skjedde over en 37-dagers (3/31-5/7) tidsramme i løpet av fem år (tabell 5). Det var ingen forskjell (P = 0,194) i oviposition rater mellom LHRH/GnRH behandlet (41 ± 13,08%, rekkevidde 17-67%) og kontroll (66,75 ± 11,79%, rekkevidde 50-100%) Kvinner. LHRH/GnRH behandlet kvinner avsatt egg et gjennomsnitt på 7,44 ± 1,41 (Range 3-13) dager etter injeksjon. Gitt fullt akvatiske natur arter og manglende evne til å manuelt holde uten anestesi det var nødvendig å sikre et passende nivå av sedasjon før du utfører IP hormon injeksjoner (se avsnitt 3,2 for instruksjoner på anestesi).

Blodoppsamling, anestesi og kirurgi

Blodprøve teknikken i denne artikkelen er Hentet fra Forzan et al. 201310 og har vist en effektiv måte å samle blod fra R. muscosa med minimal invasiveness og stress. Ved bruk av microhematocrit rør kan omtrent 35-45 μL av plasma eller serum samles inn per 70 μL av hele blod (figur 7). Maksimalt samlings volum i R. muscosa var 1 full microhematocrit tube per 10 g frosk, opptil 4 rør per frosk for frosker 40 g og større. Dette var en konservativ samling volum på 0,7 mL per 100 g, 70% av maksimal anbefaling av 1,0 mL per 100 g (tilpasset fra Erlandsson og Fry, 2008)13.

Anestesi og kirurgi i amfibier er sjelden rapportert, men det er viktig å merke seg at doser og effekt vil variere i en art-spesifikk måte. I Bombina orientalis for eksempel, MS222 har en svært lav effekt, selv med høye doser (1 g/l) mens i Boreal padder, Anaxyrus Boreas Boreas, 1 g/L er rask (løpet av minutter) og langvarig (3 + h) (Calatayud, personlig observasjon). I R. muscosa, anestesi krever doser rapportert for A. Boreas Boreas og har lignende effekt og utvinning ganger. Fasting amfibier før anestesi er vanligvis ikke nødvendig som deres strupen forblir tett lukket selv under generell anestesi. Men hvis det anses nødvendig, spesielt hvis bedøvelse prosedyren er å inkludere celomic kirurgi, kan dyr være fastet 24 timer før anestesi.

Under kirurgi, det rettende refleks er det primære indikatoren det det dyr har bli anesthetized. Den rettende refleks er evnen og graden av letthet som et dyr kan gå tilbake til en oppreist stilling etter å ha blitt plassert på ryggen. Tap av refleks antyder et lett stadium av anestesi. Et kirurgisk fly indikeres av tap av tilbaketrekking refleks som inkluderer lett å trekke på lem å rette den og dyret ikke lenger å være i stand til trekke det7. Reproduktiv kirurgi har ingen overveldende hindringer og amfibier pasienter hovedsakelig helbrede godt tolerer blodtap mer enn høyere virveldyr. Kirurgi bør fortsette raskt, varer ca 15 minutter fra begynnelse til slutt. Trinn bør være tidsbestemt omtrent som følger: < 1 minutt for den innledende snitt og < 2 minutt for celiotomy og retractor innsetting, < 2-3 minutter for isolasjon per eggstokk og < 1 minutt for fartøy Sutur eller cauterization og hud Sutur < 4 minutter. Den totale utvinningen tid etter operasjonen med MS222 protokoller er ca 45 minutter, men dette kan være arter-spesifikke. I A. Boreas Boreas og R. muscosa Recovery ganger kan være lengre, opp til 1-2 h. Når du utfører kirurgi, må forsiktighet tas for å unngå punktering lungene, mage-tarmkanalen eller en oppblåst blære, og ikke å skade makroskopisk kjertler, lymfe hjerter og blodkar, spesielt mid-ventrale vene. Avhengig av sesong, kan tilstedeværelsen av store fett legemer gjøre visualisering av andre organer vanskelig. Når synlig våken, et dyrs svar på lem stimulering, slik som motstand mot en mild strekking av en rygg lem eller blinkende når området rundt øyet stimuleres (personlig observasjon), er klassifisert som abstinens svar. Den rettende refleks sammen med andre utvinning indikatorer inkludert, tilbaketrekking reflekser og Gular bevegelser, er viktige indikatorer for utvinning.

Administrasjon
Vanlig navn Arter Hormon Prosedyre Priming sammensatte Priming dose rapportert Antall priming doser Timing (HR før ovulatory dose) Sammensatt (e) administrert for endelig ovulatory/oviposition Doser Referanse
Puerto Rico Crested padde Peltophryne lemur GnRH & hCG Ip Hcg 1,5 IU/g 2 hCG-48 GnRH HCG GnRHa + hCG 0,2 μg; 4 IU-ER; 0,5 μg + 4 IE Calatayud et al. upubliserte
Mountain gul-legged frosk Rana muscosa Amphiplex, lut Ip GnRHa (des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9-GnRH) 0,4 μg/g 1 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g Calatayud et al., 2018
PGF2α Im PGF2α 5 ng/g 1 48 PGF2α 5 ng/g
Southern Rocky Mountain Boreal padde Anaxyrus Boreas Boreas hCG, GnRH Ip Hcg 3,7 IU/g 2 96, 24 hCG + GnRHa 13,5 IU/g + 0,4 μg/g Calatayud et al., 2015
Nord cricket frosk Acris crepitan Amphiplex lagt til vann (10 mL) Ingen Ingen 0 Na GnRH + MET 0,17 μg + 0,42 μg/μL Snyder et al., 2012
Nord-Leopard frosk Lithobates pipiens Amphiplex Ip Ingen Ingen 0 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g Trudeau et al., 2010
Argentinsk horn frosk Ceratophyrs ornata Amphiplex Ip Ingen Ingen 0 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g
Cranwell ' s horn frosk Ceratophrys cranwelli Amphiplex Ip Ingen Ingen 0 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g
Amerikansk bakken frosk Odontophrynus americanus Amphiplex Ip Ingen Ingen 0 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g
Dusky Gopher frosk Rana sevosa hCG, GnRH Ip Hcg 3,7 IU/g 2 96, 24 GnRH + hCG 1 x 0,4 μg/g + 13,5 IU/g Graham et al., 2018
Vanlige coqui Eleutherodactylus coqui Fisk, fugleinfluensa, pattedyr & GnRH (D-ala, des-Gly, ETH LHRH), hCG Sc mLHRH;  aLHR; fLHRH; GnRHa; Hcg Ingen 0 Na mLHRH;  aLHR; fLHRH; GnRHa; Hcg 7μg, 33 μg; 28µg; 7µg, 20µg; 5, 10, 15, 20 μg; 165 IE Michael et al 2004
Gunther ' s toadlet Pseudophryne guentheri GnRH GnRHa 0,4 μg/g 1 26 GnRHa med eller uten Prime 0,4 μg/g Silla 2010
Corroboree frosk Pseudophryne corroboree Lucrin Sc Lucrin 1 μg 1 26 Lucrin 5 μg Byrne & Silla, 2010
Nord-corroboree frosk Pseudophryne pengilleyi GnRHa GnRH (D-ala, des-Gly, ETH LHRH) TA Ingen Ingen 0 Na GnRHa 0,5-2,0 μg/g Silla et al., 2017
Gulf kysten waterdog Necturus beyeri [des-Gly10, D-Ala6]-LhRH-RH ethylamide acetate salt hydrat Ip Ingen Ingen 0 Na LHRH 100 μg/500 μL Stoops et al., 2014
Southern Bell frosk/growling gress frosk Litoria raniformis des-Gly10, D-Ala6-[LHRH] Sc Ingen Ingen 0 Na des-Gly10, D-Ala6-[LHRH] 50 μg Mann et al., 2010
Fowler er padde Anaxyrus fowleri GnRH, hCG, P4 Ip Hcg 3,7 IU/g Browne et al., 2006
Axolotl (meksikansk Salamander) Ambystoma mexicanum Hårsekken-stimulerende hormoner Im Ingen Ingen 0 Na Fsh 400IU Trottier og Armstrong, 1974
Afrikansk klorte frosk Xenopus laevis hCG & P4 tilsatt vann; Ip PMSG, hCG Marcec, 2016
Tiger Salamander Ambystoma tigrinum hCG, LH
Wyoming padde Anaxyrus baxteri hCG, GnRHa, P4 Ip hCG + GnRHa 100 IU + 0,8 μg 1 72 hCG + GnRHa 100 IU + 0,8 μg Browne et al., 2006
Nord-Leopard frosk Lithobates pipiens Hypofysen ekstrakt (PE), P4, testosteron (T), corticosterone [C], Amphiplex, domperidone (D) SC, IP Ingen Ingen 0 Na PE, PE + T, PE + P4, PE + C; Amphiplex, GnRH + D ~ 100 IU (LHRH) i 1 mL; PE + 0.002 μg/μL; PE + 0,01 mg/50 ml; PE + 0,1 mg/50 ml; 0,4 μg/g + 10 μg/g;  0,4 μg/g + D Wright, 1961; Fort, 2000; Trudeau et al., 2013
Ground frosk Lymnodynastes tasmeniensis Hypofysen ekstrakter, hCG, GnRHa, PZ Ip GnRHa 0.9-1.2 μg/g + PZ 10 μg/g 1 20 PE PE + hCG; GnRH + PZ PE Vol; PE Vol + 100 IU hCG; GnRH (0,9-1.2 μg/g) + PZ (10μg/g) Clulow et al., 2018
Grønn og Golden Bell frosk Litoia Aurea GnRH Ip GnRHa 10 μg 1 72 GnRHa + hCG 20 μg + 300 IU Clulow et al., 2018
Stor sperret frosk Mixophyes fasciolatus hCG & PMSG Sc PMSG, hCG 50 IU & 25 IU; 1x100 2 2 PMSG-144 & 96;  hCG-24 Hcg 100IU Clulow et al., 2012
For mer hormon protokoller og arter se Wright og Whitaker, 2001

Tabell 1: amfibier arter og noen av de eksogene hormoner testet på dem som rapportert i litteraturen. Humant gonadotropin (hCG); Gonadotropin lanserer-hormon (GnRH); Lutenizing hormon-lanserer Hormone (LHRH); bokstavene m, a og f representerer "pattedyr", "fugleinfluensa" og "fisk"; gravid Mare serum gonadotropin (PMSG); progesteron (P4); Hårsekken-stimulerende Hormone FSH); hypofysen ekstrakt (PE); testosteron (T); corticosterone (C). Dopamin motstandere oppført inkluderer: domperidone (D); Pimozid (P); metoclopramide (MET). Amphiplex er navnet gitt til en sammensatt består av GnRH og Metoclopramide27. Lucrin er en kommersielt tilgjengelig GnRH Agonistiske med den aktive ingrediensen blir Leuprorelin acetate. 4 andre priser , 7 andre er , 17 i , 18 av år , 19 andre priser , 20 priser og , 26 i , 27 andre priser , 38 for alle , 39 for alle , 40 for alle , 41 for alle , 42 for alle , 43 for alle , 44 for alle , 45 for alle

Klasse Reproduksjons status Beskrivelse
0 Ikke-gravid Ingen egg synlig.
1 Tidlig gravid Egg synlig (1-2mm i størrelse) ingen distinkte echogenic linje forbundet med egg.
2 Midt gravid Egg 2-3mm i størrelse, distinkt echogenic linje (r) knyttet til hvert egg.
3 Sene gravid Egg 4-5mm i størrelse, echogenic linjer fortsatt synlig, markert økning i ekkofritt rom utseende egg.
4 Beholdt egg Varierende grader av echogenic materiale til stede i indre egg struktur, ta på amorphic form. Noen kan bli svært echogenic og assosiert med væskeretensjon i kroppen hulrom.

Tabell 2: gradering system som brukes til å score den reproduktive tilstanden til fange kvinnelige Necturus og Rana muscosa ved ultralyd.

Stoffet Dosering og rute Kommentarer-referanse
Buprenorphin 50 mg/kg (intracelomic) Eksperimentell studie i en østlig rød-flekket Newt (Notophthalmus viridescens). Analgesi bør gis før operasjonen. (Koeller, 2009)
Butorphanol 1 – 10 mg/kg (DIREKTEMELDING eller intracelomic) Det finnes ulike spesifikke respons. Det anbefales å starte på 1 mg/kg.
Butorphanol 0,5 mg/L (badekar) Eksperimentell studie i en østlig rød-flekket Newt (Notophthalmus viridescens). (Koeller, 2009)
Fentanyl 1 mg/kg Analgesi > 4 h, Antagonized av naltrexon (Stevens, 1997)
Meloksikam 0,1 til 0,2 mg/kg (IM) (Minter, 2011)

Tabell 3: protokoller for analgesi i amfibier.

Rana muscosa
År 2014 2015
Nei ♀ 18 18
Egg utvikling 61 prosent 94 prosent
Kontroll ♀ 4 6
Amphiplex ♀ 4 7
Gjennomsnittlig dag post Amphiplex til oviposit 10,5 10,9
Oviposition rate (Amphiplex) 22,20 prosent 33,33 prosent
Oviposition hastighet (kontroll) 22,20 prosent 38,88 prosent

Tabell 4: en sammenligning av reproduktive parametre mellom amphiplex-behandlet i forhold til kontroll fange kvinnelige Rana muscosa i 2014 og 2015.

Necturus Sp.
År 1 2 3 4 5
Nei ♀ 6 7 7 7 7
Egg utvikling 83 prosent 100 prosent 86 prosent 86 prosent 86 prosent
LHRH ♀ 3 5 3 6 0
Kontroll ♀ 2 2 3 0 6
Dag post-LHRH til Oviposit 5 7 5,5 (rekkevidde 3-8) 13 N/a
Oviposition rate (LHRH) 60 prosent 20 67 prosent 17 N/a
Oviposition hastighet (kontroll) 50 prosent 50 prosent 100 prosent N/a 67 prosent
* n = 1 ♀ ingen egg utvikling

Tabell 5: en sammenligning av reproduksjons parametre mellom LHRH (GnRH) -behandlet og kontroll (sterilt vann) fange kvinnelige Necturus fra tre arter over en 5-års periode (2012-2017).

Figure 1
Figur 1: tre metoder for å holde en frosk. (A) prosedyre 1. (B) prosedyre 2. (C) prosedyre 3. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Morphometric vurderinger. (A, B) SVL/SUL (C, D). vekt, i R. muscosa og D. Necturus. (E). størrelses måling med markører. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: seksuell dimorphism er preget av bryllups tommelen pads på voksen R. muscosa hanner sammenlignet med kvinner. (A) kvinnelig (B) mannlig. Den nedre panelet viser lengden på mannlige vs kvinnelig. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: karakteriserer reproduksjons atferd som leder opp til oviposition i R. muscosa (A) frieri. (B) Amplexus. (C) mannlig klemme kvinne mens i amplexus. (D, E) Amplexed kvinne i en hånd-stand. (F, G) Abdominal sammentrekninger og oviposition. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: ultralyd utført på R. muscosa A-B med reproduktiv status i henhold til utviklingstrinn4. (A, B) utføre ultralyd på Rana muscosa. (C) grade 0. (D) grad 1. (E) grad 2. (F) grad 3. (G) grad 4 (ovulated og beholdt egg) Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: ultralydbilder av Necturus. (A) grad 1. (B) grad 2. (C) grade 3 egg. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: blod samling i R. muscosa. (A) blod samling ved punktering vena orbitalis bakre ansikts vene like over kjeven i midten av banen. (B, C) Blod slippes ut på hudens overflate og er samlet med en heparinisert kapillærrør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: injeksjons metoder i amfibier. Avhengig av dybden av typen injeksjon vil vinkelen og dybden på nålen variere. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: hormonell injeksjon i R. muscosa. Induksjon av oviposition av hormonell behandling i Rana muscosa hunner injisert med amphiplex intra-peritoneally. Eggstokkene kan bli funnet i coelomic hulrom Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: forberedelser før operasjonen. (A) Aseptical utarbeidelse av operasjonsområdet ved hjelp av fortynnet povidon-jod løsning (1/10), Trachycephalus resinifictrix. (B) Clean skalpell innsnitt i en Xenopus laevis eller, (C) laser-diode hud snitt, Lithobates catesbeianus. (D) unngå å skade midt ventrale vene, Trachycephalus resinifictrix. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 11
Figur 11: ovarieektomi i Xenopus laevis. (A) utsett og Flytt store fett legemer for å avdekke egg massen. (B) avgiftsdirektoratet en del av egg masse uten ligating noen blodkar. (C) cauterize rundt blodkar ved elektrokautering for fullstendig ovarieektomi. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 12
Figur 12: pre-kirurgisk forberedelse og ovarieektomi i A. mexicanum. (A) steril gasbind fuktet i, 0,75% klorheksidin løsning brukes på operasjonsstedet (B). En linje mellom skulderen og bakbena deler dyret i tre like deler og den blå flekk markerer området på snitt. (C) trekke inn coelomic snitt med øyelokk sårhaker. (D) for fullstendig ovarieektomi, cauterize de omkringliggende blodkarene ved elektrokautering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 13
Figur 13: visuell vurdering av reproduktive stadier. (A, B) Visuelle vurderinger av reproduktive scenen gjennom semi-gjennomskinnelig hud, Necturus. (C) gjennomskinnelig hud, Hyalinobatrachium (glass frosk). (D) visuell vurdering av R. muscosa før (høyre, blå linje) og etter oviposition (venstre-gul linje). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 14
Figur 14: egg oppbevaring. (A, B) Kvinnelig Rana muscosa med alvorlig tilfelle av egg oppbevaring. (C) ultralyd viser gamle degenereres, egg (øverst) og større egg (midten og bunnen panel) ovulated og fanget i coelom. (D) beholdt egg hentet av manuell stripping. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 15
Figur 15: ultralydbilder av beholdt egg i Necturus at (A) ble echogenic i utseende (sirkel) og var assosiert med (B) væskeretensjon i kroppen hulrom (pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 16
Figur 16: prosent av den kvinnelige Necturus som oviposited fulle eller delvise klør (2013-2017) sammenlignet med de som ikke oviposit. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Direkte håndtering, visuell observasjon og morphometric tiltak gir ikke-invasiv teknikk og er de første vurderingskriteriene for fastsettelse av kvinnelig reproduktiv scene. Men, denne studien viser at gravid eggstokkene ikke kan alltid være pålitelig identifisert av palpasjon. Avhengig av arten, gravid eggstokkene kan noen ganger være visuelt oppdages gjennom semi-gjennomskinnelig (figur 13a, B) eller helt gjennomsiktig hud på ventrale siden av dyret (figur 13C). Kvinner som har fullført oviposition kan vise åpenbare endringer i sitt utseende i forhold til gravid kvinner (f. eks, løs hud og tap av opptil 30% av sin kroppsmasse, figur 13D). Under avl, menn og kvinner vil vise visse atferd som gir informasjon om nærhet til eggløsning og oviposition. Når det gjelder R. muscosa indikasjoner på at en kvinne er nær oviposition begynne med den kvinnelige inn handstands.

Anvendelsen av ultralydteknologi til anurans og Caudates tillater diagnostisering av tilstedeværelse eller fravær av egg og om oviposition var forbundet med fullstendig eller delvis frigjøring av utviklede egg. Dermed gir denne metoden en mer komplett og nøyaktig vurdering av reproduktive status uten å være begrenset til å bestemme gravid/ikke-gravid status via en visualisering teknikk som varierer etter abdominal huden åpenhet, eller epidermal konsistens blant forskjellige amfibier arter. Ultralyd kan utføres med relativ letthet og med lite stress til dyrene (figur 5 og figur 13) og kan brukes til å karakterisere reproduktive sykluser og å bestemme reproduktive status4. Det er avgjørende å bli kjent med arten; men denne studien viste at Necturus og R. muscosa dele felles utviklingsmessige tegn i sine reproduktive mønstre slik at tilsvarende klassifisering av reproduktive Stadium (figur 5). Gjennom denne teknologien er det nå bevis for at egg utvikling er høy i fange Necturus og R. muscosa og at begge disse artene følger et sesong mønster. Selv om årsakene til disse fenomener er ukjent og krever ytterligere undersøkelse, uten bruk av ultralyd, flere områder av eggstokkene dysfunksjon, slik som egg oppbevaring og delvis oviposition, ville ha gått uoppdaget. Fremtidige søknader til denne teknikken vil bli brukt til å avgjøre om kvinner bør velges for avl i et gitt år og om oviposition er fullført.

En blod samling protokoll, slik som det som presenteres i R. muscosa, som er både effektiv og forårsaker minimal nød til dyret, er optimal å studere hormon profiler i fangenskap og vill-fanget anurans (Calatayud, upublisert). Hittil finnes det ingen informasjon om den årlige hormonet profiler av fange R. muscosa og derfor ingen kunnskap om hvordan hormoner er å påvirke deres helse og reproduksjon. Videre, med bevis for at kvinner av denne arten ikke kan være årlige oppdrettere, hormonell profilering vil være en annen metode for sporing av eggstokkene sykluser. Sammen med ultralyd, hormon analyse kan føre til bedre prediksjon av hva kvinner vil være klar for oviposition. Videre, i det siste året, har to tilfeller av intersex i fange R. muscosa befolkningen er dokumentert. I tillegg har utviklingen av tommelen pads er notert på noen av de eldre grunnleggerne kvinner. Grunner for dette er for tiden under etterforskning, men første resultatene tyder på det kan forholde seg til endringer i testosteron nivåer (Calatayud, upublisert). Kresne hormonelle sykluser i kvinner i ulike aldre vil hjelpe oss å forstå hvorfor kvinner kan utvikle mannlig assosiert sekundære seksuelle egenskaper og om dette er å forvente i en aldrende befolkning.

Eksogene Hormone terapi har blitt brukt til å overvinne reproduktive dysfunksjoner ofte oppstått i fange amfibier. Imidlertid, for begge to R. muscosa og Necturus befolkninger i denne studere, nei vesentlige forskjellene inne oviposition imellom hormon-behandlet og administrere kvinner var oppdaget over en 2 og 5-år periode av tid, respectively. Dette kan tyde på at hormon administrasjon protokollen, doser, grunning og hormon kombinasjonen brukt var ikke tilstrekkelig for arten. Nærmere analyse av individuelle kvinnelige reproduktive historier antyder R. muscosa kan ikke oppleve årlig avl, som også kan gjøre rede for mangelen på hormonell effekt observert i behandlede kvinner. Fordi en viss prosentandel av kvinner konsekvent hoppet avl hvert år, forstå den naturlige historien av arten kan bidra til å avgjøre om det er behov for eksogene hormoner og når de kan være mest effektive. Prosedyrene som er beskrevet i denne artikkelen kan brukes på en rekke arter, (tabell 1) og er for anurans spenner fra 5 g til 150 g; større dyr kan kreve forskjellige sprøyter og nåle målere. Plasseringen av injeksjon varierer med noen hormoner som krever intra-muskuløse, intra-bukhulen, sub-hud eller intradermal injeksjon (figur 7).

Kirurgi i den hensikt å ovarieektomi er en vanlig metode som brukes i ulike amfibier arter å få oocytter for embryological studier. Ovarieektomi kan også være indisert for befolkningskontroll og medisinske spørsmål som egg oppbevaring. I tilfelle av delvis ovariectomies der, oocyte høsting er utført for forskningsformål, må kirurgi sørge for at dyret forblir reproduktive. Administrasjon av PGF2α har vist noen lover å løse egg oppbevaring i kvinnelige R. muscosa. I flere individer, PGF2α elicited fullstendig deponering av tidligere beholdt egg, men i andre bare delvis deponering skjedde krever manuell stripping å fjerne alle eggene. Mens PGF2α kan tjene som et alternativ til kirurgi for egg oppbevaring i R. muscosa, dens evne til å bøte på lignende patologisk forhold i andre amfibier vil kreve Art-spesifikk validering. Når kirurgisk inngrep er mandat for Anuran eller nucleus caudatus pasienten, er det nødvendig å sikre en tilstrekkelig fly av anestesi før snitt er gjort. Gløgg observasjon ferdigheter er nødvendig for å vurdere og overvåke de normative induksjon og utvinning svar som beskrevet i denne studien for hver av de dyr. Når man er kjent med den spesifikke anatomi, en hensiktsmessig kirurgisk tilnærming, hemostase, milde vev manipulasjon og tilstrekkelig postoperativ ledelse, reproduktive operasjoner utgjør ingen overveldende hindringer.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Natalie Calatayud ønsker å takke Dr. Barbara Durrant for opplæring og assistanse med ultralyd og til Exploradora de Immuebles, S.A. (EISA) for tildeling av økonomisk støtte til min forsknings førsteamanuensis stilling ved SDZG. Takk til Dr. Kylie Cane for kommentarer på manuskriptet så vel som til den offisielle anmeldere (hvem de kan være). Takk til Jonathan Dain vår 2018 Summer Fellow, San Diego Zoo Institute for Conservation Research for å gi bilder (figur 1a, B). Monica Stoops strekker takknemlighet til Association of zoologiske hager og akvarier Conservation legat fondet og Disney Worldwide Conservation Fund for å gi økonomisk støtte til å etablere den fange Necturus befolkningen. I tillegg støtte ble også mottatt gjennom private donasjoner fra amfibier talsmann MS Iris de la Motte. Takk, er gitt til Mr. Christopher DeChant og Dr. Markus Campbell for deres betydelige bidrag til forskningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems GE medical systems GE logiq Book XP Ultrasound
Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex GE medical systems 8C-RS (10 MHz) Ultrasound probe
BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle) Mettler Electronics Corp CA Sonigel Ultrasound gel (water soluble, salt-free)
Hormone
Gonadotropin releasing hormone BACHEM 4012028 synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate
abbreviation: GnRH
Lutenizing hormone releasing hormone BACHEM, Sigma-Aldrich 4033013;     L1898 synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt;
[D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate
abbreviation: LHRH
Human chorionic gonadotropin BACHEM, Sigma-Aldrich 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU)
abbreviation: hCG
Prostaglandin 2α Sigma-Aldrich P40424; synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris;
abbreviation: PGF2α
Follicle-stimulating hormone Sigma-Aldrich F4021, F8174 synonym: porcine, sheep
abbreviation: FSH
Progesterone Sigma-Aldrich 46665;      P7556 synonym: Vetranal; P4 water soluble
abbreviation: P4
Pituitary extract na synonym: Check papers for amphibian species derivation
abbreviation: PE
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec;       Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich HOR-272;    493-10; 9002-70-4 synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin
abbreviation: PMSG
Metaclopromide Sigma-Aldrich M0763 synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide
abbreviation: MET
Lucrin BACHEM; Sigma-Aldrich 4033014;   L0399 synonym: Leuprorelin acetate
abbreviation: Lucrin
Lutalyse Pfizer synonym: PGF2α - Dinoprost tromethamine
abbreviation: Lut
Pimozide Sigma-Aldrich P1793 synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one
abbreviation: PZ
Amphiplex see above synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide
abbreviation: GnRH + MET
Ovopel Ovopel na synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg)
abbreviation: Ovo
Ovaprim Pentair aquatic eco-systems Ova10 synonym: Salmon gonadotropin + domperidone
abbreviation: Ova
Domperidone Sigma-Aldrich D122 synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine
abbreviation: DOM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conde, D. A., Flesness, N., Colchero, F., Jones, O. R., Scheuerlein, A. An emerging role of zoos to conserve biodiversity. Science. 331 (6023), 1390-1391 (2011).
  2. Conde, D. A., et al. Zoos through the Lens of the IUCN Red List: A Global Metapopulation Approach to Support Conservation Breeding Programs. PLoS ONE. 8 (12), e80311 (2013).
  3. Morrison, C., Hero, J. -M. Geographic variation in life-history characteristics of amphibians: a review. Journal of Animal Ecology. 72 (2), 270-279 (2003).
  4. Calatayud, N. E., Stoops, M., Durrant, B. S. Ovarian control and monitoring in amphibians. Theriogenology. , 70-81 (2018).
  5. National Research Council. Institutional Animal Care and Use Committee Guidebook. , (2010).
  6. Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
  7. Graham, K. M., Langhorne, C. J., Vance, C. K., Willard, S. T., Kouba, A. J. Ultrasound imaging improves hormone therapy strategies for induction of ovulation and in vitro fertilization in the endangered dusky gopher frog (Lithobates sevosa). Conservation Physiology. 6 (1), coy020 (2018).
  8. Wright, K. M., Whitaker, B. R. Amphibian Medicine and Captive Husbandry. , Krieger Publishing Company. (2001).
  9. Forzán, M. J., Vanderstichel, R. V., Ogbuah, C. T., Barta, J. R., Smith, T. G. Blood collection from the facial (maxillary)/musculo-cutaneous vein in true frogs (family Ranidae). Journal of Wildlife Diseases. 48 (1), 176-180 (2012).
  10. Allender, M. C., Fry, M. M. Amphibian hematology. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 11 (3), 463-480 (2008).
  11. Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (3), 64-67 (2007).
  12. Jorgensen, C. B. External and internal control of patterns of feeding, growth and gonadal function in a temperate zone anuran, the toad Bufo bufo. Journal of Zoology. 210 (2), 211-241 (1986).
  13. Jørgensen, C. B. Growth and reproduction. Environmental Physiology of the Amphibians. , 439-466 (1992).
  14. Vu, M., Trudeau, V. L. Neuroendocrine control of spawning in amphibians and its practical applications. General and Comparative Endocrinology. 234, 28-39 (2016).
  15. Clulow, J., Trudeau, V. L., Kouba, A. J. Amphibian declines in the twenty-first century: why we need assisted reproductive technologies. Reproductive Sciences in Animal Conservation. , 275-316 (2014).
  16. Kouba, A., et al. Assisted reproductive technologies (ART) for amphibians. Amphibian Husbandry Resource Guide. 2, 60-118 (2012).
  17. Clulow, J., et al. Optimisation of an oviposition protocol employing human chorionic and pregnant mare serum gonadotropins in the Barred Frog Mixophyes fasciolatus (Myobatrachidae). Reproductive Biology and Endocrinology. 10 (1), 60 (2012).
  18. Browne, R. K., Seratt, J., Vance, C., Kouba, A. Hormonal priming, induction of ovulation and in-vitro fertilization of the endangered Wyoming toad (Bufo baxteri). Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 34 (2006).
  19. Calatayud, N. E., et al. A hormone priming regimen and hibernation affect oviposition in the boreal toad (Anaxyrus boreas boreas). Theriogenology. 84 (4), 600-607 (2015).
  20. Stoops, M. A., Campbell, M. K., Dechant, C. J. Successful captive breeding of Necturus beyeri through manipulation of environmental cues and exogenous hormone administration: a model for endangered Necturus. Herpetological Review. 45 (2), 251-256 (2014).
  21. Mc Creery, B. R., Licht, P. Induced ovulation and changes in pituitary responsiveness to continuous infusion of gonadotropin-releasing hormone during the ovarian cycle in the bullfrog, Rana catesbeiana. Biology of Reproduction. 29 (4), 863-871 (1983).
  22. Johnson, C. J., Vance, C. K., Roth, T. L., Kouba, A. J. Oviposition and ultrasound monitoring of American toads (Bufo americanus) treated with exogenous hormones. Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 299, 301 (2002).
  23. Herbert, D. Studies of assisted reproduction in the spotted grass frog Limnodynastes tasmaniensis: ovulation, early development and microinjection (ICSI). , (2004).
  24. Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2, 6 (2004).
  25. Ogawa, A., Dake, J., Iwashina, Y., Tokumoto, T. Induction of ovulation in Xenopus without hCG injection: the effect of adding steroids into the aquatic environment. Reproductive Biology and Endocrinology. 9 (1), 11 (2011).
  26. Silla, A. J. Effects of luteinizing hormone-releasing hormone and arginine-vasotocin on the sperm-release response of Günther’s Toadlet, Pseudophryne guentheri. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 139 (2010).
  27. Trudeau, V. L., et al. Hormonal induction of spawning in 4 species of frogs by coinjection with a gonadotropin-releasing hormone agonist and a dopamine antagonist. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 36 (2010).
  28. Krause, E. T., von Engelhardt, N., Steinfartz, S., Trosien, R., Caspers, B. A. Ultrasonography as a minimally invasive method to assess pregnancy in the fire salamanders (Salamandra salamandra). Salamandra. 49, 211-214 (2013).
  29. Browne, R. K., Li, H., Seratt, J., Kouba, A. Progesterone improves the number and quality of hormone induced Fowler toad (Bufo fowleri) oocytes. Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 3 (2006).
  30. Bramucci, M., et al. Different modulation of steroidogenesis and prostaglandin production in frog ovary in vitro by ACE and ANG II. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 273 (6), R2089-R2096 (1997).
  31. Gobbetti, A., Zerani, M. Possible roles for prostaglandins E2 and F2α in seasonal changes in ovarian steroidogenesis in the frog (Rana esculenta). Journal of Reproduction and Fertility. 98 (1), 27-32 (1993).
  32. Gobbetti, A., Zerani, M., Carnevali, O., Botte, V. Prostaglandin F2α in female water frog, Rana esculenta: Plasma levels during the annual cycle and effects of exogenous PGF2α on circulating sex hormones. General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 175-180 (1990).
  33. Guillette, L. J. Jr, Dubois, D. H., Cree, A. Prostaglandins, oviducal function, and parturient behavior in nonmammalian vertebrates. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 260 (5), R854-R861 (1991).
  34. Clulow, J., Mahony, M., Browne, R., Pomering, M., Clark, A. Applications of assisted reproductive technologies (ART) to endangered anuran amphibians. Declines and Disappearances of Australian Frogs'. Campbell, A. , 219-225 (1999).
  35. Browne, R. K., Wolfram, K., García, G., Bagaturov, M. F., Pereboom, Z. Zoo-based amphibian research and conservation breeding programs. Amphibian and Reptile Conservation. 5 (3), 1-14 (2011).
  36. Chai, N. Surgery in amphibians. Veterinary Clinics: Exotic Animal Practice. 19 (1), 77-95 (2016).
  37. Gentz, E. J. Medicine and surgery of amphibians. Ilar Journal. 48 (3), 255-259 (2007).
  38. Snyder, W. E., Trudeau, V. L., Loskutoff, N. M. 168 a noninvasive, transdermal absorption approach for exogenous hormone induction of spawning in the northern cricket frog, Acris crepitans: a model for small, endangered amphibians. Reproduction, Fertility and Development. 25 (1), 232-233 (2012).
  39. Kouba, A. J., et al. Emerging trends for biobanking amphibian genetic resources: the hope, reality and challenges for the next decade. Biological Conservation. 164, 10-21 (2013).
  40. Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2 (1), 6 (2004).
  41. Fort, D. J. Frog reproduction and development study 2000 rana pipiens reproduction and development study. , Environmental Protection Agency. (2003).
  42. Clulow, J., et al. Differential success in obtaining gametes between male and female Australian temperate frogs by hormonal review: A Review. General and Comparative Endocrinology. 265, 141-148 (2018).
  43. Trottier, T. M., Armstrong, J. B. Diploid gynogenesis in the Mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  44. Marcec, R. M. Development of assisted reproductive technologies for endangered North American salamanders. , Mississippi State University. (2016).
  45. Wright, M. L. Melatonin, diel rhythms, and metamorphosis in anuran amphibians. General and Comparative Endocrinology. 4, (2002).

Tags

Biologi døgn egg oppbevaring celiotomy eksogene hormoner ultralyd og ovarieektomi.
Reproduktive teknikker for eggstokkene overvåking og kontroll i amfibier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Calatayud, N. E., Chai, N., Gardner, … More

Calatayud, N. E., Chai, N., Gardner, N. R., Curtis, M. J., Stoops, M. A. Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians. J. Vis. Exp. (147), e58675, doi:10.3791/58675 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter