Summary
Dit stapsgewijze protocol biedt een gedetailleerde beschrijving van de experimentele opstelling en data-analyse voor de beoordeling van inflammatoire reacties in hiPSC-ECs en de analyse van leukocyten hechting onder fysiologische stroom.
Abstract
Endotheliale cellen (ECs) zijn essentieel voor de regulering van de inflammatoire reacties door ofwel beperken of vergemakkelijken van de inlijving van de leukocyten in de aangetaste weefsels via een goed gekarakteriseerd cascade van Pro-lijm receptoren die upregulated op de het celoppervlak van de leukocyten op de inflammatoire trigger. Inflammatoire reacties verschillen tussen individuen in de populatie en de genetische achtergrond kan bijdragen aan deze verschillen. Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) hebben aangetoond dat een betrouwbare bron van ECs (hiPSC-ECs), dus vertegenwoordigen een onbeperkte bron van cellen die de genetische identiteit en van eventuele genetische varianten vangen of mutaties van de donor. hiPSC-ECs kunnen daarom worden gebruikt voor het modelleren van inflammatoire reacties in donor-specifieke cellen. Inflammatoire reacties kunnen worden gemodelleerd door bepaling van de hechting van de leukocyten op de hiPSC-ECs onder fysiologische stroom. Dit stapsgewijze protocol biedt een gedetailleerde beschrijving van de experimentele opstelling en data-analyse voor de beoordeling van inflammatoire reacties in hiPSC-ECs en de analyse van leukocyten hechting onder fysiologische stroom.
Introduction
Ontsteking speelt een centrale rol in vele pathologische voorwaarden, met inbegrip van cardiovasculaire en neurodegeneratieve aandoeningen, sepsis en bijwerkingen van geneesmiddelen Reacties (ADR's). Endotheliale cellen (ECs) spelen een essentiële rol bij het reguleren van de inflammatoire reacties via de inductie van Pro-lijm receptoren, zoals E-selectine, intercellulaire adhesie molecuul-1 (ICAM-1) en vasculaire cel adhesie molecuul-1 (VCAM-1) op hun oppervlak 1 , 2. microvasculaire ECs in verschillende weefsels en zijn bekend om te exposeren heterogeniteit in de inflammatoire reacties3,4. Bovendien, genetische achtergrond of bepaalde genetische voorwaarden kunnen leiden tot de verschillen in inflammatoire reacties tussen individuen; het is daarom belangrijk toegang hebben tot de ECs van verschillende individuen. Meer recentelijk, menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs)5, die kan worden afgeleid uit vrijwel elk individu, werden getoond om te dienen als een betrouwbare en duurzame bron van ECs6,7,8, 9. Daarom, de beoordeling van de inflammatoire reacties en leukocyten werving in hiPSC-ECs is waardevol, niet alleen voor modellering van bepaalde erfelijke aandoeningen, maar ook te geven aanwijzingen van Inter individuele variabiliteit en te gebruiken als een instrument voor gepersonaliseerde geneeskunde in de toekomst.
Stroom testen bieden een nuttig instrument voor de studie van de interactie van het endotheel-leukocyten. Vooruitgang in de microfluidic apparaten inschakelen de reproductie van fysiologische vloeistofstromen voorwaarden met nauwkeurige controle van vasculaire bed-specifieke shear stress niveaus. Levende imaging zorgt voor de opvolging van de opeenvolging van gebeurtenissen van leukocyten vangen, rollen, kruipen, hechting en transmigratie. Verschillende stroom testen om te studeren endotheel-leukocyte interactie hebben ontwikkeld, maar gebruiken zij alle primaire ECs10,11,12,13. Hier beschrijven we in detail de bepaling voor de beoordeling van human leukocyte hechting op hiPSC-ECs onder fysiologische stroom. In deze procedure beschrijven we geoptimaliseerde voorwaarden van hiPSC-EG stimulatie met pro-inflammatoire stimuli, zoals Tumornecrosefactor alfa (TNFα), dissociatie, zaaien in een microfluidic-chip met acht parallelle kanalen. We beschrijven een stapsgewijze protocol voor de perfusie van hiPSC-ECs met de schorsing van fluorescently gelabelde leukocyten in microfluidic chips, levende cel imaging en geautomatiseerde tellen van aanhangend leukocyten.
Dit protocol is nuttig voor de beoordeling van inflammatoire reacties in hiPSC-ECs in drug screening, ziekte modellering en gepersonaliseerde regeneratieve geneeskunde.
Protocol
1. bereiding van de oplossingen en reagentia
- Bereiden van volledige menselijke endotheliale-SFM medium (volledige EG-SFM) door toevoeging van bloedplaatjes-armen plasma bereide serum (1%), fundamentele fibroblast groeifactor (bFGF, 20 ng/mL) en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF, 50 ng/mL) aan menselijke endotheliale-SFM (Zie tabel van Materialen). Filtreer het medium door een 0,22 µm porie filter en sla het bij 4 ° C voor maximaal 2 weken.
- Bereiden van complete RPMI medium door het toevoegen van foetale runderserum (10%), 2-mercaptoethanol (0.05 nM), L-glutamine (1%), penicilline-streptomycine (25 U/mL) op RPMI gemiddeld (Zie Tabel van materialen). Bewaren bij 4 ° C voor maximaal 3 weken.
2. coating van Microfluidic Chips
- Plaats een steriele biochip in een steriele petrischaal van 10 cm.
- Bereiden fibronectine werkoplossing door wederopvoering van de stockoplossing in-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Ca2 +/Mg2 + om een eindconcentratie van 50 µg/mL. 80 µL van de werkoplossing per biochip schatten.
- Injecteren 10 µL van fibronectine werkoplossing in elk kanaal van de biochip. Gebruik een pipet met kleine 10 µL tips en zorg ervoor om te vormen van een strakke contact tussen de inlaat kanaal en het uiteinde van de Pipet (Figuur 1 c, links).
- Sluit het deksel van de petrischaal met de biochip en plaatst u deze in een bevochtigde kamer (figuur 2B). Bewaar de zaal bij 4 ° C's nachts. Humidify van de zaal, plaats een schoon papieren zakdoekje op de bodem van de bevochtigde kamer en voeg 5 mL steriele H2O.
- Volgende dag, voordat de assay, warme vooraf de biochip bij 37 ° C in de incubator.
3. bereiding van hiPSC-ECs
Opmerking: In het protocol hier beschreven, waren hiPSC-ECs gedifferentieerd, gezuiverd, cryopreserved en ontdooid als eerder beschreven8.
- Dooi en plaat hiPSC-ECs in volledige EG-SFM volledige in een 0,1% gelatine beklede T75 maatkolf, drie tot vier dagen vóór de bepaling.
- De nacht vóór de test, hiPSC-ECs met TNFα stimuleren door het toevoegen van volledige EG-SFM aangevuld met 10 ng/mL TNFα en incubeer overnachting (~ 12 h) bij 37 ° C, zoals eerder beschreven 7.
4. hiPSC-ECs dissociatie en Seeding in Microfluidic Chip
- Op de dag van de test, neem de kolf van hiPSC-ECs uit de incubator en de cellen onder de Microscoop onderzoeken. Zorg ervoor dat hiPSC-ECs 80 – 100% heuvels en een typische morfologie van de EG-achtige hebben.
- Breng de kolf in de cel cultuur kap.
- Het medium van de kolf van hiPSC-ECs gecombineerd.
- Kort was de cultuur van de cel door het toevoegen van 10 mL PBS zonder Ca2 +/Mg2 +. De PBS gecombineerd.
- Voeg 4 mL per fles van 1 x dissociatie enzym. Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) (figuur 1B).
- Stop de dissociatie reactie door 8 mL van menselijke endotheliale-SFM medium per kolf toe te voegen. Voorzichtig losmaken en verzamelen van de opschorting van de hiPSC-ECs in een conische tube van 15 mL, met behulp van een precisiepipet 5 mL.
- Het totale aantal cellen in de schorsing te tellen.
- Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 3 min op RT.
- Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel in volledige EG-SFM tot een eindconcentratie van 1.5 x 107 cellen/mL.
- Neem de petrischaal met de biochip uit de incubator en overbrengen naar de cel cultuur kap.
- Gecombineerd de fibronectine oplossing van alle kanalen van de microfluidic-chip.
- 6 µL van de celsuspensie injecteren op elk kanaal met behulp van een precisiepipet met een kleine 10 µL tip (Figuur 1 c, midden). Ervoor te zorgen dat de celsuspensie ruim vóór de injectie wordt gemengd en Vermijd cel neerslag.
- De biochip onder de Microscoop onderzoeken en ervoor zorgen dat de cellen zijn gelijkmatig verdeeld, en de celdichtheid hoge (figuur 2C).
- Incubeer de biochip gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Voeg 40 µL van EG-SFM volledig in de middelgrote reservoirs aan beide zijden van elk kanaal.
- Incubeer de biochip gedurende 1 uur bij 37 ° C (Figuur 1 c, rechts).
- Voeg een andere 50 µL van EG-SFM volledig in de reservoirs aan beide zijden van elk kanaal.
5. bereiding van menselijke leukocyten
Opmerking: In het protocol beschreven hier, werd een commercieel verkrijgbare monocytic cellijn (THP-1) gebruikt. Als alternatief, perifere bloed mononucleaire cellen of neutrofiele granulocyten kunnen worden gebruikt. Isolatie van perifeer bloed monocyten en neutrofielen kan worden uitgevoerd met behulp van de standaardprocedure11. Alle stappen die worden beschreven in deze paragraaf in een cel cultuur kap.
- Het verzamelen van de leukocyten in een conische tube van 50 mL.
- Wassen van de leukocyten met 10 mL PBS zonder Ca2 +/Mg2 +. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 3 min op RT (Figuur 1 d).
- Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL PBS met DiOC6 kleurstof (λex = 485 nm, λem = 501 nm) (1:5, 000). Incubeer de cellen in het donker gedurende 10 minuten op RT.
- Wassen van de leukocyten met 10 mL PBS zonder Ca2 +/Mg2 +. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 3 min op RT. Repeat de wassen stap één meer tijd.
- Het totale aantal cellen in de schorsing te tellen.
- Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel in volledige RPMI middellange tot een eindconcentratie van 2.5 x 106 cellen/mL.
6. bereiding van de Microfluidic pomp
- Monteer de microfluidic pomp met de 8-kanaals variëteit.
- Sluit de pomp aan op een PC met de geïnstalleerde besturingssysteemsoftware.
- Start de software microfluidic en laden van het protocol door te klikken op Open Protocol en ga op de PC om te selecteren van het microfluidic-protocol.
- Sluit de software en de pomp door de installatiemap te selecteren en te klikken op Uitvoeren Assay stap.
- Definiëren van de geometrie van de kanalen voor de juiste datatransportbesturing tarief: Selecteer Update meetkunde in de installatiemap voor de Meetkunde en klik op Run Assay stap.
Opmerking: Ervoor te zorgen dat de geometrie gegevens overeenkomen met de spuit en de kanalen om te worden gebruikt (geometrie ID = 1, aantal kanalen = 8, kanaal breedte = 800.0 µm, kanaal diepte = 120.0 µm, Pompvolume = 250 µL) en de viscositeit van het monster (vloeibare viscositeit = 1.0). - Het wassen van de pomp door het plaatsen van de inlaat-kabel (oranje) in de conische tube van 50 mL, met 80% ethanol. Plaats de stopcontact kabel (groen) in de conische lege tube van 50 mL (afval container).
- Selecteer de Wassen/pomp Washout -map en klik op Run Assay stap (wassen volume = 2000 µL, Wash volume stap = 250 µL, wassen richting = Output). Herhaal de wassen stap nog eens.
- Herhaal de stappen (stappen 6.6 – 6,7) met cel cultuur rang water en menselijke endotheliale-SFM kweekmedium wassen pomp.
- Ga verder met de stap van het wassen van de variëteit.
- Open de klep tussen de spuit en de variëteit handmatig door het plaatsen van de 3-weg-adapter in de juiste positie (indicator OFF aan de linkerkant staat).
- Selecteer Set huidige kanaal/Open stap in het Wassen/variëteit Wash -map en klik op Run Assay stap om te openen alle kleppen van de variëteit.
- De variëteit handmatig wassen door het indrukken van 5 mL ethanol 80% van de spuit, gevolgd door 5 mL cel cultuur rang water.
- De variëteit wassen door 5 mL menselijke endotheliale-SFM kweekmedium duwen van de spuit.
- Verwijder alle grote luchtbellen die zijn gevangen in de variëteit. Om dit te doen, de 8-well pins adapter in de 10 cm petrischaal met het medium plaatsen en het uitvoeren van duwen/trekken met de spuit totdat alle grote luchtbellen verdwenen zijn (kleine bubbels zijn geen probleem).
- Selecteer Set huidige kanaal/Close stap in het Wassen/variëteit Wash -map en klik op Run Assay stap om te sluiten alle kleppen van de variëteit.
- Sluit de kabel van de groene uitlaat van de pomp naar de inlaatspruitstuk adapter.
- De 3-wegkraan terugschakelen naar de uit -stand te sluiten van de spuit.
- Selecteer Wassen/kabel Washout -map en klik op Run Assay stap om te wassen elke poort met RPMI medium individueel, ervoor te zorgen dat alle bubbels zijn verwijderd uit elke kabel (afzien van volume = 100 µL).
Opmerking: Elke klep van de variëteit is geopend één-door-één, 1 tot en met 8 en 100 μl van het medium wordt aangeboden via elk individueel kanaal terwijl het houden van de andere kanalen gesloten. Zorg ervoor dat de vloeistof van elke pin loopt. Als er geen vloeistof uit, is het een indicatie van een luchtbel of een klomp.
7. voorbereiding van de Microfluidic-Chip voor Live Imaging
- Ervoor zorgen dat de microfluidic opstellingen klaar zijn, en de levende imaging kamer vooraf equilibrated tot 37 ° C en het niveau van CO2 5% (figuur 3A, B bereikt).
- Neem de biochip uit de incubator en plaats deze in de Microscoop chip houder. Monteer de houder van de chip op de Microscoop imaging fase (Figuur 3 c).
- Om de biochip verbinden met de pomp via de variëteit, plaats de 8-pins adapter dicht mogelijk bij de uitlaat reservoirs van de chip en verdiepen van alle pinnen in het medium (maar sluit niet volledig).
- Selecteer de wassen | Verbinden met Chip map en klik op Run Assay stap af te zien van RPMI medium voorafgaand aan het aansluiten van de chip (afzien van volume = 30 mL). Zodra het medium wordt aangeboden, plaatst u de 8-pins adapter in het stopcontact van de biochip.
Opmerking: Tijdens deze stap, alle kanalen zijn ingesteld op op (open) en 30 µL van het medium wordt aangeboden via elk kanaal en daarop de kanalen zijn ingesteld op Off (gesloten). Dit zorgt ervoor dat geen lucht bubbels zal worden ingevoerd in de kanalen van de microfluidic-chip. - Handmatig gecombineerd het medium van alle reservoirs van de inlaat van de biochip met een pipet.
- Selecteer de wassen | Chip wassen map en klik op Run Assay stap naar perfuse 40 mL van volledige EG-SFM medium via elk van de kanalen één-door-één om zich te ontdoen van de dode cellen/puin van het kanaal (wassen volume = 40 µL, Maximum wassen schuintrekken = 40 dynes/cm2).
8. flow hechting Assay en overname van het beeld
- Handmatig gecombineerd het medium uit het reservoir van de inlaat van het kanaal van belang met een pipet.
- 100 µL van leukocyten uit stap 5.6 toevoegen aan het reservoir van de inlaat van het kanaal van belang.
Opmerking: Meng voorzichtig de cellen om de schorsing van een eencellige. - In de cel Assay | Stap beschrijving map, selecteer Set huidige kanaal/stap beschrijving , Selecteer in de lijst met kanalen, alleen het huidige kanaal van belang en ingesteld op On (open) en alle andere zeven kanalen ingesteld op Off (gesloten).
- Selecteer de cel Assay | Stap beschrijving map en klik op Run Assay stap.
Opmerking: Ervoor te zorgen dat constante negatieve druk te trekken van de leukocyten schorsing uit het inlaat reservoir via het kanaal voor 5 min Variabele Flow Rate toedieningseenheden geldt (Shear reeks constante, Shear stress = = -0,5 dyne/cm2, duur = 00:05:00, Scan vertraging = 00:00:00). De negatieve waarde van shear stress zorgt voor de juiste richting van de stroom. - De resterende leukocyten uit het reservoir inlaat gecombineerd.
- Voeg 100 µL van volledige RPMI medium naar het reservoir van de inlaat. Selecteer cel Assay/stap beschrijving map en klik op Run Assay stap om de perfuse van het kanaal voor 5 min met RPMI medium om te wassen van alle niet-aanhanger leukocyten (Shear reeks constante, Shear stress = = -0,5 dyne/cm2, duur = 00: 05:00, scanpauze = 00:00:00).
- Verwerven van beelden van ten minste drie tot vier verschillende positie's van het kanaal om het imago van de zelfklevend leukocyten (om ervoor te zorgen dat er representatieve gebieden zijn gevangen).
- Herhaal stap 8.1-8,7 voor functionele beoordeling van al de rest van de kanalen.
Opmerking: Het is mogelijk om meerdere kanalen tegelijk uitvoeren. Om dit te doen, opent u alle kanalen van belang tijdens de stap 8.3. en het uitvoeren van alle bovengenoemde stappen 8.4 –8.7 voor meerdere kanalen van belang.
9. de voltooiing van de test en het schoonmaken van de Microfluidic pomp
- Na het voltooien van het experiment, exporteren en opslaan van alle afbeeldingen in een RAW formaat.
- Uitvoeren tijdens het opslaan van de resultaten, de microfluidic-pomp en de variëteit schoonmaak protocol.
- Voor de microfluidic pomp, voer de map Vervagen/pomp wassen eerst door zoogdierlevercellen 4 mL cel cultuur rang water, gevolgd door 4 mL 80% ethanol zoals beschreven in stappen 6.6 – 6,7 drogen de pomp door het uitvoeren van lucht gedurende enkele minuten.
- Uitvoeren om het reinigen van de variëteit, Wassen/variëteit Wash stap met de spuit. Volg de stappen voor het openen van de spuit en de spruitstuk kleppen als beschreven in stappen 6.10-6.11 wassen eerst met 80% ethanol en volgende met cel cultuur rang water. Droog de variëteit door het duwen van lucht via de spuit. Sluit de klep van de spuit en de kleppen in het inlaatspruitstuk zoals beschreven in stappen 6.10 en 6.15.
10. tellen van aanhangend leukocyten
- Download en installeer de beeldverwerking software14 van http://cellprofiler.org.
Opmerking: Beeldverwerking in deze studie werd uitgevoerd met behulp van software versie 2.1.1. Als een nieuwere versie, zou de pijpleiding voorschrijven dat kleine. - Downloaden van de pijpleiding Count_leukocytes.cpipe. Klik op bestand | Import | Pijpleiding uit het bestand en ga op de PC om te kiezen van de pijpleiding Count_leukocytes.cpipe.
- Slepen en neerzetten een map met verworven RAW-afbeeldingen van aanhangend leukocyten naar het bestand lijstvenster in de Input-modules | Beelden sectie voor analyse.
- Geef de typische grootte van leukocyten via analyse modules | IdentifyPrimaryObjects. De minimale en maximale diameter van aanhangend leukocyten in pixels opgeven.
- Selecteer de filtercriteria via analyse modules | FilterObjects. Geef het minimaal geaccepteerde gebied van objecten in pixels.
- Begin de analyse door op de knop analyseren beelden .
Opmerking: Alle RAW beelden worden verwerkt en de resultaten worden opgeslagen in een standaardmap voor uitvoer. Het Image.txt -uitvoerbestand bevat het aantal aanhangend leukocyten in elke verwerkte beeld (elk nummer correspondeert met een afbeelding, dat wil zeggen, elke verworven gezichtsveld).
Representative Results
Voor het eerst, het antwoord van hiPSC-ECs op de stimulatie met pro-inflammatoire agent TNFα moeten worden onderzocht, zoals eerder beschreven7. TNFα behandeling voor 12u activeert de opregulatie van E-selectine met de piek op 6 uur na het starten van de behandeling. Daarnaast is ICAM-1 upregulated 6-12 uur na de behandeling. Hoewel we niet de verwachte opregulatie van VCAM-1 observeren hebben, wordt het meestal waargenomen in primaire menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs). We vonden de overnachting (12 h) TNFα behandeling het meest geschikt voor de bepaling van de wrijvingscoëfficiënt leukocyten.
Optimale hiPSC-ECs dissociatie moet leiden tot de schorsing van een eencellige gratis cel klontjes. Figuur 2C illustreert de optimale hiPSC-EG-dichtheid direct na de injectie. Typisch, 15 min na injectie, hiPSC-ECs hechten aan de bodem van het kanaal en beginnen te verspreiden (figuur 2D). 1 h na injectie, hiPSC-ECs vormen een goed gespreide enkelgelaagde langs het kanaal en zal klaar om te beginnen de stroom assay (figuur 2E).
Etikettering van leukocyten met fluorescerende tracer is gunstig voor fase contrast beelden in beeld kwantificering geautomatiseerde, zoals het maakt de cel identificatie stap makkelijker, vooral omdat de leukocyten aan de enkelgelaagde van ECs houden en het is vaak moeilijk voor de software te onderscheiden van verschillende celtypes.
Gratis open-source beeld processing software is zeer nuttig voor geautomatiseerde kwantificering van aanhangend leukocyten. De pijpleiding wordt beschreven in het protocol hier is gebaseerd op Hoofdonderwerp identificatie met behulp van adaptive thresholding van fluorescerende beelden van leukocyten (figuur 4A). Filteren van objecten die zijn gebaseerd op een minimale oppervlakte bovendien geïdentificeerd filtert ten onrechte geïdentificeerde objecten, zoals de cel puin, autofluorescence of elke andere niet-specifieke fluorescent signaal (Figuur 4 C, D).
Een microfluidic chip met acht parallelle kanalen staat de vergelijking van twee onafhankelijke groepen, bijvoorbeeld, ECs onderscheiden van onafhankelijke hiPSCs, zoals gezonde donoren of patiënten met erfelijke aandoeningen. Extra besturingselementen, zoals onbehandeld ECs, of vooraf te behandelen met een ICAM-1 blokkerende antilichamen kunnen worden opgenomen als goed10,11. Twee tot drie microfluidic chips kunnen tegelijk worden verwerkt. Voor de robuustheid van de conclusies, wordt een minimum van drie onafhankelijke biologische experimenten uitgevoerd op onafhankelijke dagen aanbevolen.
Figuur 1 : Voorbereiding van hiPSC-ECs en leukocyten voor de stroom assay. (A) voorbehandeling van hiPSC-ECs met de pro-inflammatoire stimulus (TNFα). (B) Schematische weergave van de hiPSC-ECs enzymatische dissociatie, centrifugeren en resuspensie. (C) Schematische weergave van de coating van de kanalen (C, links), injectie van de hiPSC-EG-suspensie (C, midden) en cel kweekmedium toevoeging na hiPSC-ECs bijlage in de microfluidic-chip. (D) Schematische weergave van de leukocyten wassen stap, labelen met fluorescente kleurstof DiOC6 en resuspensie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Microfluidic chip met hiPSC-ECs. (A) Microfluidic chip in een 10 cm petrischaal. (B) de bevochtigde kamer gebruikt voor incubatie. (C, D, E) Representatieve beelden van hiPSC-ECs in het microfluidic kanaal 0 min (C), 15 min (D), 1 h (E) na de injectie. Schaal bar = 200 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Experimentele opzet van de levende cel beeldvorming en leukocyten perfusie assay. (A, B) Foto (A) en schematische vertegenwoordiging (B) van de experimentele opstelling van de levende cel beeldvorming en flow bepaling: (1) - omgekeerde fluorescente microscoop met gemonteerde levende imaging kamer (5% CO2, 37 ° C, bevochtigde), (2) - microfluidic pomp, (3) - 8-kanaals variëteit, (4) - PC voor Microscoop controle en afbeelding verwerving, (5) - PC voor microfluidic pomp controle. (C) Microfluidic chip met de ingevoegde buis van de 8-kanaals variëteit vast in de houder van een plaat en gemonteerd in de gemotoriseerde stadium van de Microscoop. (D) Schematische weergave van de grote stappen van de bepaling van de stroom. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Image analyse en geautomatiseerde detectie van aanhangend leukocyten. (A) het dialoogvenster van het beeld processing software met de opgegeven instellingen voor de identificatie van leukocyten. (B) het dialoogvenster van de beeld processing software met de opgegeven filter criteria van de geïdentificeerde objecten op basis van minimaal aanvaard oppervlakte (SAmin = 70 px). (C) voorbeeld van correcte identificatie van leukocyten en filteren van niet-specifieke objecten van de kleine oppervlakte (SA) (typische diameter in pixel (Min, Max) = (9, 15); Filteren op criteria SAmin = 70 px). Geaccepteerde objecten worden afgebeeld in groen en verwijderde objecten worden afgebeeld in violet. (D) voorbeeld van onjuiste identificatie van leukocyten als gevolg van de onjuiste waaier van typische diameter (typische diameter in pixel (Min, Max) = (3, 15); Filteren op criteria SAmin = 70 px). Geaccepteerde objecten worden afgebeeld in groen en verwijderde objecten worden afgebeeld in violet. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Dit protocol beschrijft de karakterisatie van hiPSC-EG behandeling met pro-inflammatoire stimuli, zoals TNFα, functionele beoordeling van leukocyten hechting op hiPSC-ECs in de bepaling van de stroom met behulp van levende imaging en geautomatiseerde tellen van aanhangend leukocyten.
Overnachting stimulatie van hiPSC-ECs met TNFα resulteert in de verlengde verschijning die doorgaans een geactiveerde pro-inflammatoire fenotype in ECs aangeeft. Tijdens de fase van de optimalisatie, expressie niveaus van E-selectine, ICAM-1 en VCAM-1 dient te worden geverifieerd door FACs7,8, en primaire menselijke navelstreng ader ECs (HUVECs) zijn aan te raden om als positieve controle worden opgenomen.
Optimale hiPSC-ECs dissociatie en zaaien dichtheid moeten worden bereikt voor het bereiken van een confluente enkelgelaagde zonder vorming van cel klontjes en kanaal klompen. Het is cruciaal voor resuspendeer leukocyten vlak voor perfusie teneinde te vermijden cel neerslag en handhaven van een constante concentratie wanneer keuring van elk kanaal. Perifere bloed leukocyten, zoals monocyten en neutrofielen kunnen worden gebruikt, of gevestigde monocytic cellijnen, zoals THP-1 of HL-60 kan worden gebruikt als alternatief.
Tijdens de vergadering van het microfluidic-setup en tijdens de flow bepaling is het van cruciaal belang om te voorkomen dat luchtbellen verstrikt te raken in de microfluidic buizen en kanalen zoals zij in het detachement van hiPSC-ECs en/of aanhangend leukocyten resulteren kunnen. Vloeistof-vloeistof-interface of de opneming van de extra wassen stappen tijdens de voorbereiding van het microfluidic-setup kan bijdragen aan het voorkomen van luchtbellen.
Het is raadzaam dat het protocol wordt gerund door twee operators waar bereidt één de cellen en de tweede bereidt de microfluidic systeem en flow bepaling. Dit zorgt ervoor dat de ECs zijn verguld in microfluidic chips binnen een constante tijd-venster vóór verwerking en verbetert de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de resultaten. Bovendien, hierdoor kunnen ook instellen geblindeerde experimenten voor het vermijden van vertekening in de resultaten.
Voor de succesvolle cel detectie met de geautomatiseerde pijpleiding voor beeldverwerking, is het belangrijk te verwerven van de beelden in focus met een hoge signaal-/ ruisverhouding en om te voorkomen dat autofluorescence van niet-specifieke objecten, zoals cel klontjes. Van cruciaal belang is de juiste specificatie van de minimale en maximale limieten van de typische grootte van aanhangend leukocyten, die moeten worden geïdentificeerd. Men kan de typische grootte van leukocyten met behulp van een lijn-meetgereedschap in ImageJ schatten. Bijvoorbeeld, in onze analyse gebruikten we het bereik van 9-15 pixels die overeenkomt met de fysieke grootte van 10,3 – 17.1 µm (figuur 4C). Bij het gebruik van een verkeerde bereik, bijvoorbeeld 3 – 15 pixels (3.4-17.1 µm), een enkele leukocyten niet als één cel wordt geïdentificeerd, maar eerder de subdelen zijn geïdentificeerd als afzonderlijke objecten (Figuur 4 d). Dit leidt tot het valse aantal objecten kan worden geïdentificeerd.
Vele objecten van een lage intensiteit en kleinere oppervlakte dan leukocyten kunnen worden opgespoord met behulp van de meegeleverde adaptive thresholding methode. Dit kan duren plaats als gevolg van autofluorescence of elke andere niet-specifieke fluorescerende signalen. Echter kunnen deze niet-specifieke objecten, als hun gebied lager dan de typische gebied van een enkele leukocyten is, worden gefilterd door het definiëren van de minimaal geaccepteerde oppervlakte (figuur 4C).
De bepaling van de stroom die hier worden beschreven kunt directe beoordeling van leukocyten hechting op een EG-enkelgelaagde, ophelderen van de interactie tussen deze twee cel typen, maar houdt niet rekening andere cel typen, zoals pericytes die in de vasculaire muur en misschien ook deelnemen aan de regulering van de leukocyten extravasation15. De fysiologische relevantie van het systeem kan worden verbeterd door integratie van een 3D-cultuur-communicatie met andere celtypes. Ondanks deze beperkingen voorziet de bepaling van de stroom voor de beoordeling van inflammatoire reacties hier beschreven een waardevol instrument fundamentele karakterisering en ziekte modellering toepassingen van hiPSC-ECs.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen de volgende subsidies: European Research Council (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Nederland orgel-on-Chip initiatief, een project van de NWO Gravitation gefinancierd door het ministerie van onderwijs, cultuur en wetenschap van de regering van Nederland (024.003.001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
| 8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
| Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
| Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
| Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
| Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
| Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
| Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
| Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
| Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
| TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
| DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
| Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
| Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
| VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
| E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
| ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
| VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |
References
- Vestweber, D. How leukocytes cross the vascular endothelium. Nature Reviews Immunology. 15 (11), 692-704 (2015).
- Hajishengallis, G., Chavakis, T. Endogenous modulators of inflammatory cell recruitment. Trends in Immunology. 34 (1), 1-6 (2013).
- Molema, G. Heterogeneity in endothelial responsiveness to cytokines, molecular causes, and pharmacological consequences. Seminars in thrombosis and hemostasis. 36 (3), 246-264 (2010).
- Aird, W. C. Endothelial Cell Heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), a006429 (2012).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 1-16 (2016).
- Lin, Y., Gil, C. H., Yoder, M. C. Differentiation, Evaluation, and Application of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (11), 2014-2025 (2017).
- Halaidych, O. V., Freund, C., et al. Inflammatory Responses and Barrier Function of Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. , (2018).
- Orlova, V. V., vanden Hil, F. E., Petrus-Reurer, S., Drabsch, Y., ten Dijke, P., Mummery, C. L. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Orlova, V. V., Drabsch, Y., et al. Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (1), 177-186 (2014).
- Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-6 (2014).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods in enzymology. 443, 155-176 (2008).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), 1-5 (2012).
- Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
- Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
