Summary
Dieses schrittweise Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Versuchsanordnung und Datenanalyse für die Bewertung von Entzündungsreaktionen in HiPSC-ECs und die Analyse der Leukozyten Adhäsion unter physiologischen Fluss.
Abstract
Endothelzellen (ECs) sind unerlässlich für die Regulierung von Entzündungsreaktionen durch Begrenzung oder Erleichterung der Leukozyten Einstellung in das betroffene Gewebe über eine gut charakterisierte Kaskade von pro-Klebstoff-Rezeptoren, die hochreguliert sind auf die Leukozyten Zelloberfläche auf entzündliche auslösen. Entzündliche Reaktionen unterscheiden sich zwischen den Individuen in der Population und der genetische Hintergrund kann dazu beitragen, diese Unterschiede. Menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs) haben gezeigt, dass eine zuverlässige Quelle von ECs (HiPSC-ECs), stellvertretend für eine unbegrenzte Quelle von Zellen, die die genetische Identität und genetische Varianten zu erfassen oder Mutationen des Spenders. HiPSC-ECs können daher für die Modellierung von Entzündungsreaktionen im Spender-spezifischen Zellen verwendet werden. Entzündungsreaktionen können durch die Bestimmung von Leukozyten Adhäsion an der HiPSC-ECs unter physiologischen Fluss modelliert werden. Dieses schrittweise Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Versuchsanordnung und Datenanalyse für die Bewertung von Entzündungsreaktionen in HiPSC-ECs und die Analyse der Leukozyten Adhäsion unter physiologischen Fluss.
Introduction
Entzündungen spielt eine zentrale Rolle in vielen pathologischen Zuständen, einschließlich Herz-Kreislauf- und Neurodegenerative Erkrankungen, Sepsis und unerwünschte Reaktionen (ADRs). Endothelzellen (ECs) spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der entzündlicher Reaktionen über die Induktion von pro-Klebstoff-Rezeptoren, wie E-Selektin, interzelluläre Adhäsion Molekül-1 (ICAM-1) und vaskuläre Zelle Adhäsion Molekül-1 (VCAM-1) auf ihrer Oberfläche 1 , 2. mikrovaskuläre ECs in verschiedenen Geweben sind dafür bekannt, Heterogenität in Entzündungsreaktionen3,4aufweisen. Darüber hinaus möglicherweise genetischen Hintergrund oder bestimmte genetischen Voraussetzungen die Unterschiede zwischen Individuen in Entzündungsreaktionen resultieren; Es ist daher wichtig, Zugang zu ECs von verschiedenen Individuen haben. Seit kurzem auch menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs)5, die von nahezu jedem Individuum abgeleitet werden können, erwiesen sich als dienen als zuverlässige und erneuerbare Energiequelle von ECs6,7,8, 9. die Bewertung von Entzündungsreaktionen und Rekrutierung von Leukozyten in HiPSC-ECs deshalb wertvoll, nicht nur für die Modellierung von bestimmten genetischen Erkrankungen, sondern auch Hinweise auf interindividuelle Variabilität und nutzen als ein Werkzeug für personalisierte Medizin in der Zukunft.
Flow Assays bieten ein nützliches Werkzeug für das Studium der endothelialen Leukozyten Interaktion. Fortschritte in mikrofluidischen Geräte ermöglichen die Wiedergabe der physiologischen Flüssigkeitsströmung Bedingungen mit präzise Kontrolle der vaskulären Scherbeanspruchung Bett-spezifische Ebenen. Live Bildgebung ermöglicht die Überwachung von der Kaskade von Ereignissen der Leukozyten erfassen, Rollen, krabbeln, Haftung und Seelenwanderung. Mehreren Flow Assays endotheliale Leukozyten Interaktion zu studieren entwickelt wurden, jedoch nutzen sie alle primären ECs10,11,12,13. Hier beschreiben wir ausführlich den Assay für die Beurteilung der humanen Leukozyten Adhäsion an HiPSC-ECs unter physiologischen Fluss. In diesem Verfahren beschreiben wir optimierte Bedingungen der HiPSC-EC Stimulation mit Pro-entzündliche Reize wie Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF), Dissoziation, Aussaat auf einem Mikrofluidik-Chip mit acht parallele Kanäle. Wir beschreiben eine Schritt für Schritt-Protokoll für die Perfusion der HiPSC ECs mit der Aussetzung der Fluoreszent markierten Leukozyten in mikrofluidischen Chips, live Cell Imaging und automatische Zählung der anhaftende Leukozyten.
Dieses Protokoll eignet sich für die Bewertung von Entzündungsreaktionen in HiPSC-ECs in Drogen-Screening, Krankheit Modellierung und personalisierte regenerative Medizin.
Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen
- Bereiten Sie komplette menschliche Endothelial-SFM-Medium (EG-SFM voll) durch Zugabe von Thrombozyten-Armen Plasma gewonnenen Serum (1 %), grundlegende Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF, 20 ng/mL) und vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF, 50 ng/mL), Human Endothelial-SFM (siehe Tabelle des Materialien). Filtern Sie das Medium durch einen 0,22 µm-Poren-Filter und speichern sie bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
- Bereiten Sie komplette RPMI Medium durch Zugabe von fetalen Rinderserum (10 %), 2-Mercaptoethanol (0,05 nM), L-Glutamin (1 %), Penicillin-Streptomycin (25 U/mL) auf RPMI Medium (siehe Tabelle der Materialien). Für bis zu 3 Wochen bei 4 ° C lagern.
2. Beschichtung von mikrofluidischen Chips
- Legen Sie einen sterilen Biochip in eine sterile Petrischale 10 cm.
- Bereiten Sie Fibronektin Arbeitslösung durch Neuaufbau der Stammlösung in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne Ca2 +/Mg2 + , eine Endkonzentration von 50 µg/mL. Schätzen Sie 80 µL Arbeitslösung pro Biochip.
- Injizieren Sie 10 µL Arbeitslösung Fibronektin in jedem Kanal des Biochips. Verwenden Sie eine Pipette mit kleinen 10 µL Tipps und stellen Sie sicher, einen engen Kontakt zwischen dem Kanal Zulauf und die Pipettenspitze (Abbildung 1, links) bilden.
- Schließen Sie den Deckel der Petrischale mit Biochips und legen Sie sie in eine feuchte Kammer (Abbildung 2 b). Speichern Sie die Kammer bei 4 ° C über Nacht. Um die Kammer zu befeuchten, platzieren Sie einem sauberen Papiertuch zu, an der Unterseite der feuchte Kammer und 5 mL sterile H2O.
- Nächsten Tag, bevor der Test Vorwärmen der Biochip bei 37 ° C im Brutschrank.
3. Vorbereitung des HiPSC-ECs
Hinweis: In dem hier beschriebenen Protokoll wurden HiPSC-ECs differenziert, gereinigt, kryokonserviert und wie zuvor beschrieben8aufgetaut.
- Tauwetter und Platte HiPSC-ECs in vollständige EG-SFM voll in eine 0,1 % Gelatine beschichtet T75 Kolben, drei bis vier Tage vor dem Test.
- Die Nacht vor der Assay stimulieren HiPSC-ECs mit TNF durch Zugabe von EG-SFM voll mit 10 ng/mL TNF ergänzt und inkubieren Sie über Nacht (12 h) bei 37 ° C, wie zuvor beschrieben 7.
4. HiPSC-ECs Dissoziation und Aussaat in mikrofluidischen Chip
- Am Tag des Tests den Kolben des HiPSC-ECs aus dem Inkubator nehmen und die Zellen unter dem Mikroskop zu untersuchen. Sicherzustellen Sie, dass HiPSC-ECs 80 – 100 % Zusammenfluss und eine typische EG-ähnliche Morphologie haben.
- Übertragen Sie den Kolben in die Zelle-Kultur-Haube.
- Aspirieren Sie das Medium aus der Flasche des HiPSC-ECs.
- Kurz waschen der Zellkultur durch Zugabe von 10 mL PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Aspirieren Sie die PBS.
- 4 mL pro Flasche 1 X Dissoziation Enzym hinzugeben. 5 min bei Raumtemperatur (RT) (Abbildung 1 b) inkubieren.
- Stoppen Sie die Dissoziation Reaktion durch Zugabe von 8 mL Human Endothelial-SFM Medium pro Flasche. Sanft lösen Sie und sammeln Sie die HiPSC-ECs-Suspension in einem 15 mL konische Röhrchen mit einer 5 mL-Pipette.
- Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Suspension.
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 3 min bei RT
- Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zelle Pellet in vollständige EG-SFM, eine Endkonzentration von 1,5 x 107 Zellen/mL.
- Nehmen Sie die Petrischale mit Biochips aus dem Inkubator und überträgt es auf die Zelle-Kultur-Haube.
- Aspirieren der Fibronektin-Lösung aus allen Kanälen der Mikrofluidik-Chip.
- Injizieren Sie 6 µL Zellsuspension in jeden Kanal mit einer Pipette mit einer kleinen 10 µL-Spitze (Abbildung 1, Mitte). Stellen Sie sicher, dass die Zellsuspension vor der Injektion gut durchmischt ist und vermeiden Sie Zelle Niederschlag.
- Der Biochip unter dem Mikroskop zu untersuchen und dafür sorgen, dass die Zellen sind gleichmäßig verteilt, und die Zelldichte hoch ist (Abbildung 2).
- Inkubieren Sie Biochips für 15 min bei 37 ° c
- 40 µL des EG-SFM voll in die mittlere Behälter von beiden Seiten der einzelnen Kanäle hinzufügen.
- Inkubieren Sie Biochips für 1 h bei 37 ° C (Abbildung 1, rechts).
- Fügen Sie ein weiteres 50 µL vollständige EG-SFM in den Stauseen von beiden Seiten des Kanals.
5. Vorbereitung des menschlichen Leukozyten
Hinweis: In dem hier beschriebenen Protokoll wurde eine handelsübliche monozytären Zelllinie (THP-1) verwendet. Alternativ können die peripheren mononukleären Blutzellen oder Neutrophilen verwendet werden. Isolierung von peripherem Blut Monozyten und Neutrophile kann mit Standardverfahren11durchgeführt werden. Durchführen Sie alle in diesem Absatz in einer Zelle Kultur Kapuze beschriebenen Schritte.
- Sammeln Sie die Leukozyten in einem 50 mL konische Röhrchen.
- Waschen Sie die Leukozyten mit 10 mL PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 3 min bei RT (Abbildung 1).
- Den Überstand abgesaugt und erneut die Zelle Pellet in 1 mL PBS mit DiOC6 Farbstoff (λex = 485 nm, λEm = 501 nm) (1:5 000). Inkubieren Sie die Zellen im Dunkeln für 10 min bei RT
- Waschen Sie die Leukozyten mit 10 mL PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g für 3 min bei RT. Wiederholung der Reinigung Schritt noch einmal.
- Zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen in der Suspension.
- Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zelle Pellet in kompletten RPMI Medium, eine Endkonzentration von 2,5 x 106 Zellen/mL.
6. Vorbereitung der mikrofluidischen Pumpe
- Montieren Sie die mikrofluidischen Pumpe mit dem 8-Kanal-Verteiler.
- Schließen Sie die Pumpe an einen PC mit dem installierten Betriebssoftware.
- Starten Sie die Software von mikrofluidischen und laden Sie das Protokoll, indem Offene Protokoll und Navigieren auf dem PC das mikrofluidischen Protokoll auswählen.
- Schließen Sie die Software und die Pumpe durch den Setup -Ordner auswählen und auf Run Test Schritt.
- Definieren Sie die Geometrie der Kanäle für den richtigen Fluss Tarifsteuerung: Wählen Sie Update Geometrie in der Geometrie Setup -Ordner und klicken Sie auf Run Test Schritt.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Geometrie Details die Spritze und Kanäle verwendet werden (Geometrie-ID = 1, Anzahl der Kanäle = 8, Kanalbreite = 800,0 µm, Kanaltiefe = 120.0 µm, Spritzenvolumen = 250 µL) und die Viskosität der Probe (Viskosität der Flüssigkeit = 1,0). - Waschen Sie die Pumpe durch die Platzierung der Anschlussleitung (Orange) in der 50 mL konische Röhrchen mit 80 % igem Ethanol. Legen Sie die Steckdose Kabel (grün) in 50 mL konische Leerrohr (Abfallbehälter).
- Wählen Sie den Auswaschung/Pumpe Washout -Ordner und klicken Sie auf Ausführen Assay Schritt (Waschen Volumen = 2000 µL, Volumen Waschschritt = 250 µL, Washout Richtung = Ausgang). Wiederholen Sie waschen noch einmal.
- Wiederholen Sie die Pumpe waschen Schritte (6,6-6,7) mit Kultur Grade Zellwasser und menschlichen Endothelial-SFM Kulturmedium.
- Fahren Sie mit der Reinigung Schritt des Verteilers.
- Öffnen Sie das Ventil zwischen der Spritze und die vielfältigen manuell indem man die 3-Wege-Adapter in die richtige Position (Kennzeichen, die auf der linken Seite deaktiviert ist ).
- Wählen Sie Set Current Channel/offene Schritt im Ordner " Auswaschung/Verteiler Wash " und klicken Sie auf Ausführen Assay Schritt um alle Ventile des Verteilers zu öffnen.
- Waschen Sie die vielfältigen manuell durch Drücken 5 mL 80 % Ethanol aus der Spritze, gefolgt von 5 mL Kultur Grade Zellwasser.
- Waschen Sie die vielfältigen 5 mL Kulturmedium Human Endothelial-SFM aus der Spritze drücken.
- Entfernen Sie alle großen Luftblasen eingeschlossen sind im Verteiler. Um dies zu tun, 8-Brunnen-Pin-Adapter in die 10 cm Petrischale mit dem Medium zu platzieren und mit der Spritze durchführen schieben/ziehen, bis alle großen Luftblasen verschwunden sind (kleine Bläschen sind kein Problem).
- Wählen Sie Set Current Channel/Close Schritt im Ordner " Auswaschung/Verteiler Wash " und klicken Sie auf Run Assay Schritt um alle Ventile der Monteurhilfe schließen.
- Das grüne Steckdose Kabel von der Pumpe an den vielfältigen Adapter anschließen.
- Wechseln Sie das 3-Wege-Ventil wieder auf OFF stellen um die Spritze zu schließen.
- Auswaschung/Kabel Washout Ordner auswählen und klicken Sie auf Run Assay Schritt um jeden Port mit RPMI Medium einzeln zu waschen um sicherzustellen, dass jedes Kabel alle Luftblasen entfernt sind (verzichten Volumen = 100 µL).
Hinweis: Jedes Ventil des Verteilers ist eröffnet-by-One, 1 bis 8 und 100 μL des Mediums wird durch jedes einzelnen Kanals verzichtet, während die anderen Kanäle zu halten geschlossen. Stellen Sie sicher, dass die Flüssigkeit aus jeder Stift läuft. Wenn es keine Flüssigkeit herauskommt gibt, ist es ein Hinweis auf eine Luftblase oder eine Verstopfung.
7. Vorbereitung der Mikrofluidik-Chip für Live-Imaging
- Sicherzustellen Sie, dass die mikrofluidischen Setups bereit sind, und die live Image Kammer Pre äquilibriert auf 37 ° C und das Niveau von CO2 5 % (Abbildung 3A, B erreicht).
- Nehmen Sie Biochips aus dem Inkubator und positionieren Sie es in das Mikroskop-Chip-Halter. Befestigen Sie die Chip-Halterung auf dem Mikroskop imaging-Phase (Abbildung 3).
- Um die Pumpe über den Verteiler der Biochip verbinden, legen Sie die 8-Pin-Adapter in der Nähe der Steckdose Stauseen des Chips und vertiefen Sie alle Pins im Medium (aber nicht schließen Sie ganz an).
- Wählen Sie die auswaschen | Verbinden Sie mit Chip Ordner und klicken Sie auf Run Test Schritt RPMI Medium vor dem Anschluss des Chips zu verzichten (Volumen verzichten = 30 mL). Sobald das Medium abgegeben wird, legen Sie die 8-Pin-Adapter in die Steckdose des Biochips.
Hinweis: Bei diesem Schritt alle Kanäle werden sich voraussichtlich auf (offen) und 30 µL des Mediums wird durch jeden Kanal ausgegeben und im Anschluss daran werden die Kanäle auf Off (geschlossen) festgelegt. Dies sorgt dafür, dass keine Luft, die Bläschen in die Kanäle der Mikrofluidik-Chip eingeführt werden. - Aspirieren Sie manuell das Medium von allen Einlass Stauseen des Biochips mit einer Pipette.
- Wählen Sie die auswaschen | Chip-Auswaschung Ordner und klicken Sie auf Run Assay Schritt zu 40 mL vollständige EG-SFM Medium durch jeden der Kanäle nacheinander get rid of die toten Zellen/Trümmer aus dem Kanal perfundieren (Washout Volumen = 40 µL, Maximum Auswaschung Scherung = 40 Dynes/cm2).
(8) Flow Adhäsion Assay und Image-Übernahme
- Aspirieren Sie manuell das Medium aus dem Zulauf Reservoir des Kanals mit einer Pipette.
- Fügen Sie 100 µL Leukozyten aus Schritt 5.6 am Einlass Reservoir des Kanals von Interesse.
Hinweis: Vorsichtig mischen der Zellen, um eine einzelne Zelle Aussetzung zu machen. - In der Zelle Test | Schritt Beschreibung Ordner, wählen Sie Set Current Channel/Schritt Beschreibung und wählen Sie in der Liste der Kanäle, nur den aktuelle Kanal von Interesse und auf (offen) und alle anderen sieben Kanäle Off (geschlossen).
- Wählen Sie die -Zelle-Assay | Schritt Beschreibung Ordner und klicken Sie auf Run Test Schritt.
Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Variable Flow Rate Abgabe gilt konstanten Unterdruck die Leukozyten-Suspension aus dem Reservoir der Einlass durch den Kanal für 5 min ziehen (Scheren Set = konstante Schubspannung =-0,50 dyn/cm2, Dauer = 00:05:00 Scan-Verzögerung = 00:00:00). Der negative Wert der Schubspannung sorgt für die richtige Richtung der Strömung. - Die restlichen Leukozyten aus dem Einlauf-Behälter abzusaugen.
- Die Einlass-Reservoir 100 µL kompletten RPMI Medium hinzufügen. Wählen Sie Zelle Assay/Schritt Beschreibung Ordner und klicken Sie auf Run Assay Schritt , um den Kanal für 5 min mit RPMI Medium durchspülen, um alle nicht-anhaftende Leukozyten auszuwaschen (Scheren Set = konstante Schubspannung =-0,50 dyn/cm2, Dauer = 00: 05:00, Scan Delay = 00:00:00).
- Abrufen von Bildern aus mindestens drei bis vier verschiedenen Positionen des Kanals zum Bild der eingehalten Leukozyten (um sicherzustellen, dass repräsentative Bereiche erfasst werden).
- Wiederholen Sie die Schritte 8.1 – 8,7 für funktionale Bewertung von den Rest der Kanäle.
Hinweis: Es ist möglich, mehrere Kanäle gleichzeitig zu betreiben. Hierzu öffnen Sie alle Kanäle von Interesse während der Schritt 8.3. und führen Sie alle oben genannten Schritte 8.4 –8.7 für mehrere Kanäle von Interesse.
9. Abschluss der Assay und Reinigung der Mikrofluidik-Pumpe
- Exportieren Sie nach Abschluss des Experiments und speichern Sie alle Bilder im RAW-Format.
- Laufen Sie beim Speichern der Ergebnisse die mikrofluidischen Pumpe und die vielfältigen Reinigung Protokoll.
- Für die Pumpe mikrofluidischen Auswaschung/Pumpe Washout -Ordner zuerst von 4 mL Kultur Grade Zellwasser Vorrichtung laufen, gefolgt von 4 mL 80 % Ethanol wie beschrieben 6,6-6,7 trocknen die Pumpe durch die Luft für einige Minuten laufen.
- Um den Verteiler zu reinigen, laufen Sie Auswaschung/Krümmer Waschschritt mit der Spritze. Führen Sie die Schritte um die Spritze und die vielfältigen Ventile wie beschrieben Schritte 6.10-6.11 waschen zunächst mit 80 % Ethanol und nächsten mit Kultur Grade Zellwasser zu öffnen. Trocknen Sie die vielfältigen durch Luft über die Spritze drücken. Das Spritze-Ventil und die vielfältigen Ventile zu schließen, wie in beschrieben Schritte 6.10 und 6.15.
10. zählen der anhaftende Leukozyten
- Downloaden Sie und installieren Sie die Bildverarbeitungs-Software14 aus http://cellprofiler.org.
Hinweis: Bildverarbeitung in dieser Studie erfolgte mittels Software Version 2.1.1. Wenn eine neuere Version verwenden, kann die Pipeline geringfügige Anpassung erfordern. - Laden Sie die Pipeline Count_leukocytes.cpipe. Klicken Sie -Datei | Import | Pipeline aus der Datei und navigieren Sie auf PC, die Pipeline Count_leukocytes.cpipezu wählen.
- Ziehen Sie einen Ordner mit erworbenen RAW-Bilder von anhaftenden Leukozyten zum Fenster Datei Liste in die Eingabe-Module | Bilder Abschnitt für die Analyse.
- Geben Sie die typische Größe von Leukozyten über Analyse-Module | IdentifyPrimaryObjects. Geben Sie den minimalen und maximalen Durchmesser des anhaftenden Leukozyten in Pixel.
- Wählen Sie die Filterkriterien über Analyse-Module | FilterObjects. Die minimal akzeptierte Fläche eines Objekts in Pixel angeben.
- Starten Sie die Analyse durch Drücken der Taste " Analyze Bilder ".
Hinweis: Alle RAW-Bilder verarbeitet werden, und die Ergebnisse werden in einem Standard-Ausgabe-Ordner gespeichert werden. Die Image.txt Ausgabe-Datei enthält die Zahlen von anhaftenden Leukozyten in jedem bearbeiteten Bild (jede Zahl entspricht ein Bild, d. h. jeder erworbenen Sichtfeld).
Representative Results
Erstens beschrieben die Reaktion des HiPSC-ECs auf die Stimulation mit Pro-inflammatorischen Agent TNF geprüft werden sollte, wie oben7. TNF Behandlung für 12 h löst die Hochregulation des E-Selektin mit dem Höhepunkt um 6 h nach Beginn der Behandlung. Darüber hinaus ist die ICAM-1 hochreguliert 6-12 h nach der Behandlung. Obwohl wir nicht die erwarteten Hochregulation von VCAM-1 beobachten, ist es in der Regel in primären menschlichen Nabelader Endothelzellen (Mediumwechsel) beobachtet. Wir fanden (12 h) TNF-Behandlung, die am bequemsten für die Leukozyten Adhäsion Assay werden über Nacht.
Optimale HiPSC-ECs Dissoziation sollte eine einzellige Aufhängung frei von Zelle Klumpen führen. Abbildung 2 zeigt die optimale HiPSC-EG-Dichte direkt nach der Injektion. In der Regel 15 Minuten nach der Injektion, HiPSC-ECs befestigen an der Unterseite des Kanals und starten (Abb. 2D) zu verbreiten. 1 h nach der Injektion, HiPSC-ECs bilden eine gespreitete Monolage entlang des Kanals und wird bereit sein, die Fluss-Assay (Abb. 2E) beginnen.
Kennzeichnung von Leukozyten mit fluoreszierenden Tracer ist vorteilhaft für kontrastreiche Bilder in Bild-Quantifizierung, automatisierte Phase wie den Zelle Identifikation Schritt es einfacher, macht vor allem, weil die Leukozyten der Monolage von ECs einhalten und es oft schwierig ist Software zu verschiedenen Zelltypen unterscheiden.
Kostenlose Open-Source-Bildverarbeitungs-Software ist sehr nützlich für automatisierte Quantifizierung von anhaftenden Leukozyten. Die Pipeline in das Protokoll hier beschriebenen basiert auf Primärobjekt Identifikation mittels adaptiver Schnittstellenüberwachung fluoreszierende Bilder von Leukozyten (Abb. 4A). Filterung der identifizierten Objekte basierend auf einen minimalen Bereich zusätzlich filtert fälschlich identifizierten Objekte, z. B. Zellenrückstand, Autofluoreszenz oder jede andere unspezifische Fluoreszenzsignal (Abbildung 4 C, D).
Einem Mikrofluidik-Chip mit acht parallele Kanäle erlaubt den Vergleich von zwei unabhängigen Gruppen, zum Beispiel ECs von unabhängigen HiPSCs, wie gesunde Spender oder Patienten mit genetischen Störungen unterschieden. Zusätzliche Steuerelemente, z. B. unbehandelte ECs oder Vorbehandlung mit einem blockierenden ICAM-1-Antikörper können als gut10,11aufgenommen. Zwei bis drei mikrofluidischen Chips können gleichzeitig bearbeitet werden. Für die Robustheit der Schlussfolgerungen empfiehlt ein Minimum von drei unabhängigen biologische Experimente an unabhängigen Tagen ausgeführt.
Abbildung 1 : Erstellung von HiPSC-ECs und Leukozyten zum Fluss Test. (A) vor der Behandlung des HiPSC-ECs mit dem Pro-inflammatorischen Reiz (TNF). (B) schematische Darstellung der HiPSC-ECs enzymatische Dissoziation, Zentrifugation und Wiederfreisetzung. (C) schematische Darstellung der Beschichtung der Kanäle (C, links), Injektion von der HiPSC-EG-Suspension (C, Mitte) und Zell-Kulturmedium zusätzlich nach HiPSC-ECs-Anlage in der Mikrofluidik-Chip. (D) schematische Darstellung der Leukozyten Waschschritt, beschriften mit fluoreszierenden Farbstoff DiOC6 und Wiederfreisetzung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Mikrofluidik-Chip mit HiPSC-ECs. (A) Mikrofluidik-chip in einer 10 cm Petrischale. (B) verwendet die feuchte Kammer für Inkubation. (C, D, E) Repräsentative Bilder von HiPSC-ECs in der mikrofluidischen Kanal 0 min. (C), 15 min (D), 1 h (E) nach der Injektion. Maßstabsleiste = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Versuchsaufbau des live Cell Imaging und Leukozyten Perfusion Assays. (A, B) Foto (A) und schematische Darstellung (B) des experimentellen Aufbaus des live Cell Imaging und Flow Assays: (1) - inversen fluoreszierende Mikroskop mit montierten live imaging Kammer (befeuchtet 5 % CO2, 37 ° C), (2) - mikrofluidischen Pumpe, (3) - 8-Kanal Krümmer, (4) - PC für Mikroskop Steuerung und Bild Erwerb, (5) - PC für mikrofluidischen Pumpensteuerung. (C) mikrofluidischen chip mit dem eingefügten Schlauch des 8-Kanal-Verteilers in einer Kennzeichenhalter fixiert und montiert in der motorisierten Phase des Mikroskops. (D) schematische Darstellung der wichtigsten Schritte des Flow Assays. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Image-Analyse und automatische Erkennung von anhaftenden Leukozyten. (A) das Dialogfenster der Bildverarbeitungs-Software mit bestimmten Einstellungen für die Identifizierung von Leukozyten. (B) das Dialogfenster der Bildverarbeitungs-Software mit bestimmten Filtern Kriterien der identifizierten Objekte basierend auf minimal akzeptiert Fläche (SAmin = 70 px). (C) Beispiel für die korrekte Identifizierung der Leukozyten und Filterung von unspezifischen Objekte der kleinen Fläche (SA) (typische Durchmesser in Pixel (Min, Max) = (9, 15); Filterung Kriterien SAmin = 70 px). Anerkannten Objekte sind in grün dargestellt und weggeworfene Gegenstände werden in violett dargestellt. (D) Beispiel für falsche Identifikation der Leukozyten durch die falsche Auswahl an typischen Durchmesser (typische Durchmesser in Pixel (Min, Max) = (3, 15); Filterung Kriterien SAmin = 70 px). Anerkannten Objekte sind in grün dargestellt und weggeworfene Gegenstände werden in violett dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Charakterisierung der HiPSC-EG-Behandlung mit Pro-entzündliche Reize wie TNF, funktionelle Beurteilung der Leukozyten Adhäsion an HiPSC-ECs in der Fluss-Assay mit live Imaging und automatische Zählung der anhaftende Leukozyten.
Über Nacht Stimulation des HiPSC-ECs mit TNF ergibt sich die längliche Optik, die in der Regel eine aktivierte Pro-inflammatorischen Phänotyp bei ECs angibt. Bei der Optimierung Ausdruck, den Ebenen von E-Selektin, ICAM-1, VCAM-1 durch FACs7,8und primären menschlichen Nabelader ECs (Mediumwechsel) überprüft werden sollten sind ratsam, als Positivkontrollen einbezogen werden.
Optimale HiPSC-ECs Dissoziation und Dichte Aussaat sollte erreicht werden, um eine konfluierende monomolekularen Film ohne Zelle Klumpen zu bilden und Kanal Clogs. Es ist wichtig, wieder auszusetzen Leukozyten Recht vor Perfusion zur Vermeidung Zelle Niederschlag und halten eine konstante Konzentration bei jedem Kanal zu prüfen. Menschenblut peripheren Leukozyten, wie z. B. Monozyten und Neutrophile können verwendet werden, oder monozytären Zelllinien etabliert, wie THP-1 oder HL-60 als Alternative verwendet werden könnte.
Bei der Montage von mikrofluidischen Setup und während der Flow-Test ist es wichtig zu verhindern, dass Luftblasen in mikrofluidischen Rohre und Kanäle gefangen, da sie die Ablösung des HiPSC-ECs und/oder anhaftende Leukozyten führen können. Flüssigkeit-Flüssigkeit-Schnittstelle oder Aufnahme von weiteren Waschschritten bei der Vorbereitung von mikrofluidischen Setup könnte helfen, um Luftblasen zu vermeiden.
Es ist ratsam, dass das Protokoll von zwei Betreibern geführt wird, wo man bereitet die Zellen und die zweite bereitet des mikrofluidischen System und Flow Tests. Dies sorgt dafür, dass ECs sind in einem ständigen Zeitfenster vor der Verarbeitung in mikrofluidischen Chips beschichtet und verbessert die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Darüber hinaus ermöglicht dies auch Einrichtung verblindeten Experimenten zu Verzerrungen in den Ergebnissen zu vermeiden.
Für die Erkennung von erfolgreichen Zelle mit der automatisierten Bildverarbeitung Pipeline ist es wichtig, Bilder im Fokus mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis zu erwerben und Autofluoreszenz-spezifische Objekte, z. B. Zelle Klumpen zu vermeiden. Von entscheidender Bedeutung ist die korrekte Angabe der minimalen und maximalen Grenzwerte die typische Größe von anhaftenden Leukozyten, die identifiziert werden müssen. Man kann die typische Größe von Leukozyten mit einem Linienwerkzeug Messung in ImageJ schätzen. Zum Beispiel in unserer Analyse verwendeten wir die Palette von 9 – 15 Pixel entspricht die physikalische Größe der 10.3 – 17.1 µm (Abbildung 4). Bei Verwendung einen falschen Bereich, z. B. 3-15 Pixel (3,4 – 17.1 µm), ein einzelnes Leukozyten nicht als eine Zelle identifiziert wird, jedoch eher die Unterabschnitte als separate Objekte (Abbildung 4) identifiziert werden. Dies führt zu der falschen Anzahl der Objekte identifiziert werden.
Viele Objekte von geringer Intensität und kleineren Fläche als Leukozyten unter Verwendung der mitgelieferten adaptive Schnittstellenüberwachung Methode erkannt werden können. Dies könnte aufgrund der Autofluoreszenz oder andere unspezifische fluoreszierende Signale erfolgen. Dennoch, diese unspezifischen Objekte, wenn ihre Gegend typischen Bereich der einzelnen Leukozyten, unterschreitet können gefiltert werden durch die Definition der minimal akzeptierten Fläche (Abbildung 4).
Der Fluss Test hier beschriebenen ermöglicht die unmittelbare Bewertung von Leukozyten Adhäsion an eine EG-Monolayer, Aufklärung das Zusammenspiel dieser beiden Zelle Typen, aber nicht berücksichtigt andere Zelle Arten, wie z. B. Perizyten, die in der Gefäßwand zu präsentieren und vielleicht auch bei der Regulierung der Leukozyte Extravasation15teilnehmen. Integration einer 3D Culture Mikroumgebung mit anderen Zelltypen könnte die physiologische Relevanz des Systems verbessern. Trotz dieser Einschränkungen bietet Flow Assays für die Bewertung von Entzündungsreaktionen, die hier beschriebenen ein wertvolles Instrument zur grundlegenden Charakterisierung und Krankheit Modellierung Anwendungen des HiPSC-ECs.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die folgenden Zuschüsse zu würdigen: European Research Council (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Niederlande Orgel-on-Chip-Initiative, eine NWO Gravitation-Projekt, gefördert durch das Ministerium für Bildung, Kultur und Wissenschaft der Regierung der Niederlande (024.003.001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vena8 Endothelial+ biochip | Cellix Ltd | V8EP-800-120-02P10 | |
| Mirus Evo Nanopump | Cellix Ltd | MIRUS-EVO-PUMP | 1 x syringe pump; 1 x VenaFluxAssay Software; 1 x tubing kit; power supply and cables. |
| 8-channel manifold MultiFlow8 | Cellix Ltd | MIRUS-MULTIFLOW8 | |
| Humidified box | Cellix Ltd | HUMID-BOX | |
| Fluorescence imaging system Leica AF6000 | Leica Microsystems | ||
| Electron-multiplying charge-coupled device camera | Hamamatsu | C9100 | |
| Biological safety cabinet/laminar flow-hood | Cleanair | ||
| CO2 cell-culture incubator | Panasonic | MCO-170AICUV | |
| Centrifuge | Hitachi | himac-CT6EL | |
| Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) | Gilson international | 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl) | |
| Sterile plastic pipette | Greiner Bio-One | 606180 (5ml), 607180 (10ml) | |
| Petri dish | VWR/ Duran Group | 391-0860 | |
| Culture flasks (75 cm2) | CELLSTAR | 658,170 | |
| Centrifuge tube (15 mL) | CELLSTAR | 188271 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Fibronectin (Bovine plasma) | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Life Technologies | 14190-169 | |
| Human Endothelial-SFM | Life Technologies | 11111-044 | |
| Human VEGF 165 IS, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-109-386 | |
| Human FGF-2, premium grade | Miltenyi Biotec | 130-093-842 | |
| Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine | Biomedical Technologies | BT-214 | |
| Recombinant Human TNF-α | Tebu-bio | 300-01A-A | |
| TrypLE Select | Life Technologies | 12563029 | |
| DiOC6(3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 21875-034 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Life Technologies | 31350010 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| L-glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Life Technologies | 15070-063 | |
| Distilled water | Life Technologies | 15230-089 | |
| Ethanol absolute | Merck | 1.00983.2500 | |
| VCAM-1 | R&D systems | FAB5649P | |
| E-Selectin | R&D systems | BBA21 | |
| ICAM-1 | R&D systems | BBA20 | |
| Name | Company | Software version | Comments |
| Cellrofiler | CellProfiler | 2.1.1 | |
| VenaFluxAssay Software | Cellix Ltd | 2.3.a |
References
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