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Developmental Biology

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल के लिए ल्युकोसैट आसंजन के आकलन के लिए Microfluidic परख-व्युत्पंन Endothelial कोशिकाओं (hiPSC-ईसीएस)

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58678
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1
1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Applied Stem Cell Technologies, University of Twente

Summary

यह कदम दर कदम प्रोटोकॉल hiPSC-ईसीएस और शारीरिक प्रवाह के तहत ल्युकोसैट आसंजन के विश्लेषण में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के आकलन के लिए प्रयोगात्मक सेटअप और डेटा विश्लेषण का एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है ।

Abstract

Endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) या तो सीमित या प्रभावित ऊतकों में ल्युकोसैट भर्ती को सुविधाजनक बनाने के द्वारा भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के विनियमन के लिए आवश्यक है एक अच्छी तरह से समर्थक चिपकने वाले रिसेप्टर्स जो पर विनियमित रहे हैं की विशेषता झरना के माध्यम से भड़काऊ ट्रिगर पर ल्युकोसैट सेल सतह । भड़काऊ प्रतिक्रियाओं जनसंख्या में व्यक्तियों के बीच अलग और आनुवंशिक पृष्ठभूमि इन मतभेदों के लिए योगदान कर सकते हैं । मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs) को ईसीएस का विश्वसनीय स्रोत (hiPSC-ईसीएस) दिखाया गया है, इस प्रकार कोशिकाओं के एक असीमित स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है जो आनुवंशिक पहचान और किसी आनुवंशिक वेरिएंट या दाता के उत्परिवर्तनों पर कब्जा करते हैं । hiPSC-ईसीएस इसलिए दाता-विशिष्ट कोशिकाओं में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं मॉडलिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । भड़काऊ प्रतिक्रियाओं शारीरिक प्रवाह के तहत hiPSC-ईसीएस के लिए ल्युकोसैट आसंजन का निर्धारण करके मॉडलिंग की जा सकती है । यह कदम दर कदम प्रोटोकॉल hiPSC-ईसीएस और शारीरिक प्रवाह के तहत ल्युकोसैट आसंजन के विश्लेषण में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के आकलन के लिए प्रयोगात्मक सेटअप और डेटा विश्लेषण का एक विस्तृत विवरण प्रदान करता है ।

Introduction

सूजन हृदय और neurodegenerative विकारों, पूति और प्रतिकूल दवा प्रतिक्रियाओं (एडीआर) सहित कई रोग की स्थिति में एक निर्णायक भूमिका निभाता है । Endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) समर्थक चिपकने वाला रिसेप्टर्स की प्रेरण के माध्यम से भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को विनियमित करने में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं, जैसे ई-selectin, सेलुलर आसंजन अणु-1 (िकैम-1) और संवहनी कोशिका आसंजन अणु-1 (VCAM-1) उनकी सतह पर 1 , 2. विभिंन ऊतकों में Microvascular ईसीएस भड़काऊ प्रतिक्रियाओं3,4में विविधता प्रदर्शन करने के लिए जाना जाता है । इसके अलावा, आनुवंशिक पृष्ठभूमि या कुछ आनुवंशिक स्थितियों व्यक्तियों के बीच भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में मतभेद में परिणाम हो सकता है; इसलिए विभिन्न व्यक्तियों से ईसीएस तक पहुंचना जरूरी है । हाल ही में, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSCs)5, कि वस्तुतः किसी भी व्यक्ति से प्राप्त किया जा सकता है, के लिए ईसीएस6,7,8के एक विश्वसनीय और अक्षय स्रोत के रूप में सेवा दिखाया गया, 9. इसलिए, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और hiPSC-ईसीएस में ल्युकोसैट भर्ती का आकलन मूल्यवान है, न केवल कुछ आनुवंशिक विकारों की मॉडलिंग के लिए, लेकिन यह भी अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के संकेत प्रदान करने के लिए और एक उपकरण के रूप में उपयोग के लिए भविष्य में निजीकृत चिकित्सा ।

प्रवाह परख endothelial-ल्युकोसैट बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं । microfluidic उपकरणों में अग्रिम संवहनी बिस्तर विशिष्ट कतरनी तनाव के स्तर की सटीक नियंत्रण के साथ शारीरिक द्रव प्रवाह की स्थिति के प्रजनन सक्षम करें । लाइव इमेजिंग ल्युकोसैट कैप्चर, रोलिंग, रेंगने, आसंजन और स्थानांतरगमन की घटनाओं के झरना की निगरानी की अनुमति देता है । कई प्रवाह परख endothelial-ल्युकोसैट बातचीत का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है, तथापि, वे सभी प्राथमिक ईसीएस10,11,12,13का उपयोग । यहां, हम विस्तार से परख मानव ल्युकोसैट आसंजन के मूल्यांकन के लिए hiPSC-ईसीएस शारीरिक प्रवाह के अंतर्गत वर्णन करेंगे । इस प्रक्रिया में, हम इस तरह के ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα), पृथक्करण, आठ समानांतर चैनलों के साथ एक microfluidic चिप में बोने के रूप में समर्थक भड़काऊ उत्तेजनाओं के साथ hiPSC-ईसी उत्तेजना के अनुकूलित शर्तों का वर्णन । हम microfluidic चिप्स में फ्लोरोसेंट लेबल ल्यूकोसाइट्स के निलंबन के साथ hiPSC-ईसीएस के छिड़काव के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन, लाइव सेल इमेजिंग और अनुयाई ल्यूकोसाइट्स की स्वचालित गिनती ।

इस प्रोटोकॉल दवा स्क्रीनिंग, रोग मॉडलिंग और व्यक्तिगत अपक्षयी दवा में hiPSC-ईसीएस में भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के आकलन के लिए उपयोगी है ।

Protocol

1. समाधान और रिएजेंट की तैयारी

  1. तैयार पूरा मानव Endothelial-sfm मध्यम (ईसी-sfm पूर्ण) प्लेटलेट-गरीब प्लाज्मा जोड़कर सीरम (1%), बुनियादी fibroblast विकास कारक (bFGF, 20 एनजी/एमएल) और संवहनी Endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़, ५० एनजी/एमएल) मानव Endothelial-sfm ( के तालिका देखें सामग्री) । एक ०.२२ µm ताकना फिल्टर के माध्यम से मध्यम फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह के लिए यह दुकान ।
  2. भ्रूण गोजातीय सीरम (10%), 2-mercaptoethanol (०.०५ एनएम), एल-glutamine (1%), पेनिसिलिन-Streptomycin (25 U/एमएल) को RPMI मीडियम (देखें सामग्री की तालिका) को जोड़कर पूरा RPMI मीडियम तैयार करें । 3 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

2. Microfluidic चिप्स की कोटिंग

  1. एक 10 सेमी बाँझ पेट्री पकवान में एक बाँझ की एक चिप रखें.
  2. 2+/Mg2 + ५० µ ग्राम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में स्टॉक समाधान के पुनर्गठन के द्वारा fibronectin काम समाधान तैयार/ अनुमान ८० µ एल के प्रति कार्य समाधान का...
  3. fibronectin काम समाधान के 10 µ एल सुई के प्रत्येक चैनल में । छोटे 10 µ l सुझावों के साथ एक पिपेट का उपयोग करें और चैनल प्रवेश और पिपेट टिप (चित्रा 1C, बाएँ) के बीच एक तंग संपर्क बनाने के लिए सुनिश्चित कर लें.
  4. पेट्री डिश के ढक्कन बंद करें और यह एक humidified चैंबर (चित्रा बी) में जगह है । रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर चैंबर की दुकान । चैंबर humidify करने के लिए, humidified चैंबर के तल पर एक साफ ऊतक कागज जगह और बाँझ एच2ओ के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  5. अगले दिन, परख से पहले, पूर्व-३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन में-गर्म है ।

3. hiPSC-ईसीएस की तैयारी

नोट: यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, hiPSC-ईसीएस विभेदित थे, शुद्ध, cryopreserved और गल के रूप में पहले8वर्णित है ।

  1. गल और प्लेट hiPSC-पूरा चुनाव आयोग में ईसीएस-एक ०.१% जिलेटिन में भरा SFM-लेपित T75 कुप्पी, तीन से चार दिन पहले परख ।
  2. रात को परख से पहले, hiPSC-ईसी जोड़कर TNFα के साथ ईसीएस-SFM पूर्ण 10 एनजी/एमएल TNFα और रात भर की मशीन (~ 12 ज) ३७ ° c, के रूप में पहले 7वर्णित के साथ पूरक ।

4. hiPSC-ईसीएस पृथक्करण और Microfluidic चिप में सीडिंग

  1. परख के दिन, मशीन से hiPSC-ईसीएस की कुप्पी ले लो और माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच । सुनिश्चित करें कि hiPSC-ईसीएस 80-100% धाराप्रवाह है और एक ठेठ चुनाव आयोग की तरह आकृति विज्ञान है ।
  2. सेल संस्कृति हूड में कुप्पी स्थानांतरण ।
  3. hiPSC-ईसीएस की कुप्पी से यम महाप्राण ।
  4. संक्षेप में, सीए2 +/Mg2 +के बिना पंजाब के 10 मिलीलीटर जोड़कर सेल संस्कृति को धो लें । पंजाबियों को महाप्राण ।
  5. 1x पृथक्करण एंजाइम की कुप्पी प्रति 4 मिलीलीटर जोड़ें । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन (आरटी) (आंकड़ा 1b) ।
  6. मानव Endothelial-SFM मध्यम कुप्पी प्रति के 8 मिलीलीटर जोड़कर पृथक्करण प्रतिक्रिया बंद करो । एक 5 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में hiPSC-ईसीएस निलंबन धीरे से अलग और इकट्ठा ।
  7. निलंबन में कक्षों की कुल संख्या को गिनना ।
  8. आरटी में 3 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक ।
  9. महाप्राण supernatant और चुनाव आयोग में सेल गोली resuspend-SFM १.५ x 107 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पूर्ण/
  10. बाहर मशीन से पेट्री डिश के साथ ले लो और सेल संस्कृति हूड को हस्तांतरण ।
  11. microfluidic चिप के सभी चैनलों से fibronectin सॉल्यूशन महाप्राण ।
  12. एक छोटे से 10 µ एल टिप के साथ एक पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक चैनल में सेल निलंबन के 6 µ एल इंजेक्षन (चित्रा 1C, मध्य). सुनिश्चित करें कि सेल सस्पेंशन इंजेक्शन से पहले अच्छी तरह से मिलाया जाता है और कोशिका वर्षा से बचने के ।
  13. माइक्रोस्कोप के तहत और यह सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को समान रूप से वितरित कर रहे हैं, और कोशिका घनत्व उच्च है (चित्रा 2c) ।
  14. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए मशीन ।
  15. चुनाव आयोग के ४० µ एल जोड़ें-एक चैनल के दोनों किनारों से मध्यम जलाशयों में पूर्ण SFM ।
  16. ३७ डिग्री सेल्सियस (चित्रा 1C, ठीक है) में 1 घंटे के लिए एक मशीन ।
  17. चुनाव आयोग के एक और ५० µ एल जोड़ें-एक चैनल के दोनों किनारों से जलाशयों में भरा SFM ।

5. मानव ल्यूकोसाइट्स की तैयारी

नोट: यहां बताए गए प्रोटोकॉल में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध monocytic सेल लाइन (THP-1) का इस्तेमाल किया गया । वैकल्पिक रूप से, परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं या न्यूट्रोफिल इस्तेमाल किया जा सकता है । परिधीय रक्त monocytes और न्यूट्रोफिल का अलगाव मानक प्रक्रिया11का उपयोग किया जा सकता है । किसी कक्ष कल्चर हुड में इस अनुच्छेद में वर्णित सभी चरणों को निष्पादित करें ।

  1. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में ल्यूकोसाइट्स लीजिए ।
  2. सीए2 +/Mg2 +के बिना पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ ल्यूकोसाइट्स धो लो । आरटी में 3 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक (चित्रा 1 डी) ।
  3. महाप्राण supernatant और DiOC6 डाई (λex = ४८५ एनएम, λem = ५०१ एनएम) (1:5000) के साथ पंजाब के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend । आरटी में 10 मिनट के लिए अंधेरे में कोशिकाओं की मशीन ।
  4. सीए2 +/Mg2 +के बिना पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ ल्यूकोसाइट्स धो लो । आरटी पर 3 मिनट के लिए ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक एक और समय धोने कदम दोहराएं ।
  5. निलंबन में कक्षों की कुल संख्या को गिनना ।
  6. महाप्राण supernatant और २.५ x 106 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पूरा RPMI माध्यम में सेल गोली resuspend/

6. Microfluidic पंप की तैयारी

  1. 8 चैनल कई गुना के साथ microfluidic पंप इकट्ठा ।
  2. स्थापित ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर के साथ एक पीसी के लिए पंप से कनेक्ट करें ।
  3. microfluidic सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें और प्रोटोकॉल खोलें क्लिक करके प्रोटोकॉल लोड और microfluidic प्रोटोकॉल का चयन करने के लिए PC पर नेविगेट करें ।
  4. सेटअप फ़ोल्डर और क्लिक करके चलाएं परख कदमका चयन करके सॉफ्टवेयर और पंप कनेक्ट ।
  5. सही प्रवाह दर नियंत्रण के लिए चैनलों की ज्यामिति को परिभाषित करें: ज्यामिति सेटअप फ़ोल्डर में अद्यतन ज्यामिति का चयन करें और चलाएं परख कदम।
    नोट: सुनिश्चित करें कि ज्यामिति विवरण सिरिंज और चैनलों का इस्तेमाल किया जा करने के लिए मैच (ज्यामिति आईडी = 1, चैनलों की संख्या = 8, चैनल चौड़ाई = ८००.० µm, चैनल गहराई = १२०.० µm, सिरिंज की मात्रा = २५० µ एल) और नमूना की चिपचिपाहट (तरल चिपचिपापन = १.०).
  6. ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में प्रवेश केबल (नारंगी) रखकर पंप धो ८०% इथेनॉल युक्त । ५० एमएल शंकु खाली ट्यूब (अपशिष्ट कंटेनर) में आउटलेट केबल (हरा) रखें ।
  7. वॉशआउट/पंप वॉशआउट फ़ोल्डर का चयन करें और चलाएं परख कदम (धो मात्रा = २००० µ एल, धो मात्रा चरण = २५० µ एल, वॉशआउट दिशा = उत्पादन) । एक बार फिर धुलाई कदम दोहराएं ।
  8. दोहराएं पंप धुलाई कदम (कदम 6.6-6.7) सेल संस्कृति ग्रेड पानी के साथ, और मानव Endothelial-SFM संस्कृति माध्यम ।
  9. कई गुना के धुलाई कदम के साथ जारी है ।
  10. मैन्युअल रूप से सिरिंज और कई गुना के बीच सही स्थिति में 3-तरफा एडाप्टर रखने से वाल्व खोलने (संकेतक बंद छोड़ दिया जाता है).
  11. वॉशआउट/कई गुना धोने फ़ोल्डर में वर्तमान चैनल/खुला कदम सेट का चयन करें और कई गुना के सभी वाल्वों को खोलने के लिए परख कदम चलाने के लिए ।
  12. कई गुना मैंयुअल रूप से सिरिंज से ८०% इथेनॉल के 5 मिलीलीटर धक्का द्वारा, सेल संस्कृति ग्रेड पानी की 5 मिलीलीटर के बाद धो लो ।
  13. सिरिंज से मानव Endothelial के 5 मिलीलीटर-SFM संस्कृति माध्यम धक्का द्वारा कई गुना धो लें ।
  14. सभी बड़े हवाई बुलबुले कि कई गुना में फंस रहे हैं निकालें । ऐसा करने के लिए, 8-अच्छी तरह से पिन अनुकूलक माध्यम के साथ 10 सेमी पेट्री डिश में जगह और धक्का/सिरिंज के साथ खींच जब तक सभी बड़े हवाई बुलबुले (छोटे बुलबुले एक समस्या नहीं हैं) चला रहे हैं ।
  15. वॉशआउट/कई गुना धोने फ़ोल्डर में वर्तमान चैनल/बंद कदम सेट का चयन करें और कई गुना के सभी वाल्व बंद करने के लिए परख कदम चलाने के लिए ।
  16. पंप से कई गुना एडाप्टर के लिए हरी आउटलेट केबल कनेक्ट ।
  17. बंद करने की स्थिति के लिए 3 तरह वाल्व स्विच वापस सिरिंज बंद करने के लिए ।
  18. वॉशआउट/केबल वॉशआउट फ़ोल्डर का चयन करें और सभी बुलबुले प्रत्येक केबल से हटा रहे हैं सुनिश्चित करना है कि प्रत्येक बंदरगाह को अलग से RPMI माध्यम से धोने के लिए परख कदम चलाने के लिए, (मात्रा = १०० µ एल) ।
    नोट: कई गुना के प्रत्येक वाल्व खोला है एक-एक करके, 1 से 8, और १०० μL माध्यम के अंय चैनलों को बंद रखते हुए प्रत्येक व्यक्ति चैनल के माध्यम से तिरस्कृत किया जाता है । सुनिश्चित करें कि प्रत्येक पिन से लिक्विड चलता है. अगर कोई तरल बाहर आ रहा है, यह एक हवा बुलबुला या एक रोकना का एक संकेत है ।

7. लाइव इमेजिंग के लिए Microfluidic चिप की तैयारी

  1. सुनिश्चित करें कि microfluidic setups तैयार हैं, और लाइव इमेजिंग चैंबर ३७ डिग्री सेल्सियस करने के लिए पूर्व equilibrated है और2 के स्तर 5% (3ए, बी) तक पहुंचता है ।
  2. मशीन से ले लो और माइक्रोस्कोप चिप धारक में स्थिति यह चिप । माइक्रोस्कोप इमेजिंग स्टेज (चित्रा 3सी) पर चिप धारक माउंट ।
  3. आदेश में कई गुना के माध्यम से पंप को जोड़ने के लिए, 8 पिन अनुकूलक चिप के आउटलेट जलाशयों के पास जगह है और मध्यम में सभी पिन गहरा (लेकिन पूरी तरह से कनेक्ट नहीं है) ।
  4. वॉशआउट का चयन करें | चिप फ़ोल्डर से कनेक्ट करें और चलाएं परख कदम RPMI मध्यम वितरण के लिए पहले चिप को जोड़ने (मात्रा = 30 मिलीलीटर) को बांटना । एक बार मध्यम तिरस्कृत है, तो डालें 8-पिन अनुकूलक के आउटलेट में.
    नोट: इस चरण के दौरान, सभी चैनलों पर (खुला) और मध्यम के 30 µ एल के लिए सेट कर रहे हैं प्रत्येक चैनल के माध्यम से तिरस्कृत और इस चैनल बंद करने के लिए सेट कर रहे हैं के बाद (बंद). यह सुनिश्चित करता है कि कोई हवाई बुलबुले microfluidic चिप के चैनलों में पेश किया जाएगा ।
  5. मैंयुअल रूप से एक पिपेट के साथ महाप्राण के सभी प्रवेश जलाशयों से मध्यम ।
  6. वॉशआउट का चयन करें | चिप वॉशआउट फ़ोल्डर और क्लिक करें चलाने के लिए परख perfuse ४० एमएल के लिए कदम -SFM चैनल के प्रत्येक के माध्यम से पूर्ण माध्यम से एक-एक करके मृत कोशिकाओं से छुटकारा पाने के लिए/मलबे चैनल से (वॉशआउट volume = ४० µ l, अधिकतम वॉशआउट कतरनी = ४०डाइन/

8. प्रवाह आसंजन परख और छवि अधिग्रहण

  1. मैंयुअल रूप से एक पिपेट के साथ ब्याज की चैनल के प्रवेश जलाशय से मध्यम महाप्राण ।
  2. ब्याज की चैनल के प्रवेश जलाशय के लिए ५.६ कदम से ल्यूकोसाइट्स के १०० µ एल जोड़ें ।
    नोट: धीरे एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए कोशिकाओं को मिलाएं ।
  3. सेल परख में । चरण विवरण फ़ोल्डर का चयन करें वर्तमान चैनल सेट/ और, चैनलों की सूची में, केवल वर्तमान हित के चैनल का चयन करें और पर (खुला) सेट और बंद करने के लिए अन्य सभी सात चैनलों सेट (बंद).
  4. चुनें सेल परख । चरण विवरण फ़ोल्डर और क्लिक करें चलाएं परख कदम।
    नोट: सुनिश्चित करें कि चर प्रवाह की दर वितरण लगातार नकारात्मक दबाव को 5 मिनट के लिए चैनल के माध्यम से प्रवेश जलाशय से ल्युकोसैट निलंबन खींच लागू होता है (कतरनी सेट = निरंतर, कतरनी तनाव =-०.५ डाइन/cm2, अवधि = 00:05:00, स्कैन विलंब = 00:00:00) । कतरनी तनाव के नकारात्मक मूल्य प्रवाह की सही दिशा सुनिश्चित करता है ।
  5. महाप्राण के प्रवेश जलाशय से शेष ल्यूकोसाइट्स ।
  6. प्रवेश जलाशय के लिए पूरा RPMI माध्यम के १०० µ एल जोड़ें । चुनें सेल परख/कदम विवरण फ़ोल्डर और चलाने के लिए क्लिक करें परख कदम RPMI माध्यम के साथ 5 मिनट के लिए चैनल perfuse को बाहर धोने के लिए सभी गैर अनुयाई ल्यूकोसाइट्स (कतरनी सेट = निरंतर, कतरनी तनाव =-०.५ डाइन/cm2, अवधि = 00:05:00, स्कैन विलंब = 00:00:00) ।
  7. चैनल की छवि का पालन ल्यूकोसाइट्स (यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रतिनिधि क्षेत्रों पर कब्जा कर रहे हैं) से कम से तीन चार विभिंन पदों पर छवियां प्राप्त करें ।
  8. दोहराएँ चरण 8.1 – 8.7 सभी चैनलों के बाकी के कार्यात्मक मूल्यांकन के लिए.
    नोट: यह एक बार में कई चैनलों को चलाने के लिए संभव है. ऐसा करने के लिए, चरण ८.३ के दौरान ब्याज के सभी चैनल खोलें । और सभी aforementioned कदम ८.४ – ८.७ ब्याज के कई चैनलों के लिए करते हैं ।

9. परख पूरी करने और Microfluidic पंप की सफाई

  1. प्रयोग पूरा करने के बाद, निर्यात और एक कच्चे प्रारूप में सभी छवियों को बचाने के ।
  2. जबकि परिणामों को बचाने, microfluidic पंप और कई गुना सफाई प्रोटोकॉल चलाते हैं ।
  3. microfluidic पंप के लिए, वॉशआउट/पंप वॉशआउट फ़ोल्डर पहले perfusing सेल संस्कृति ग्रेड पानी की 4 मिलीलीटर, ८०% इथेनॉल की 4 मिलीलीटर के रूप में कदम में वर्णित द्वारा पीछा 6.6-6.7 कई मिनट के लिए हवा चलने से पंप सूखी ।
  4. आदेश में कई गुना साफ करने के लिए, सिरिंज के साथ वॉशआउट/कई गुना वॉश कदम चलाते हैं । चरणों का पालन करें सिरिंज और कई गुना वाल्व के रूप में कदम 6.10-6.11 धो पहले ८०% इथेनॉल के साथ और सेल संस्कृति ग्रेड पानी के साथ अगले में वर्णित खोलने के लिए । सिरिंज के माध्यम से हवा धक्का द्वारा कई गुना शुष्क । ६.१० और ६.१५ चरणों में वर्णित के रूप में सिरिंज वाल्व और कई गुना वाल्व बंद करें ।

10. अनुयाई ल्यूकोसाइट्स की गिनती

  1. डाउनलोड करें और http://cellprofiler.org से छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर14 स्थापित करें ।
    नोट: इस अध्ययन में छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर संस्करण 2.1.1 का उपयोग किया गया था । यदि एक नए संस्करण का उपयोग कर, पाइपलाइन मामूली अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है ।
  2. पाइपलाइन Count_leukocytes. cpipeडाउनलोड करें। फ़ाइल क्लिक करें । आयात । फ़ाइल से पाइपलाइन और पाइपलाइन Count_leukocytes. cpipeका चयन करने के लिए PC पर नेविगेट करें ।
  3. खींचें और ड्रॉप अनुयाई ल्यूकोसाइट्स के अधिग्रहीत रॉ छवियों के साथ एक फ़ोल्डर में इनपुट मॉड्यूल फ़ाइल सूची विंडो में । विश्लेषण के लिए छवियां अनुभाग ।
  4. विश्लेषण मॉड्यूल के माध्यम से ल्यूकोसाइट्स के विशिष्ट आकार निर्दिष्ट करें । IdentifyPrimaryObjects। पिक्सल में अनुयाई ल्यूकोसाइट्स के न्यूनतम और अधिक से अधिक व्यास निर्दिष्ट करें ।
  5. विश्लेषण मॉड्यूल के माध्यम से फ़िल्टरिंग मानदंड का चयन करें । FilterObjects। पिक्सेल में ऑब्जेक्ट्स का ंयूनतम स्वीकृत क्षेत्र निर्दिष्ट करें ।
  6. विश्लेषण छवियों का विश्लेषण बटन दबाकर प्रारंभ करें ।
    नोट: सभी कच्चे छवियों को संसाधित किया जाएगा, और परिणाम एक डिफ़ॉल्ट आउटपुट फ़ोल्डर में सहेजा जाएगा । image. txt आउटपुट फ़ाइल में प्रत्येक संसाधित छवि में अनुयाई ल्यूकोसाइट्स की संख्याएं होती है (प्रत्येक संख्या एक छवि से मेल खाती है, यानी, प्रत्येक अधिग्रहीत किए गए फ़ील्ड को देखें) ।

Representative Results

सबसे पहले, hiPSC-ईसीएस समर्थक भड़काऊ एजेंट TNFα के साथ उत्तेजना के लिए की प्रतिक्रिया की जांच की जानी चाहिए, जैसा कि पहले7वर्णित है । 12 घंटे के लिए TNFα उपचार उपचार शुरू करने के बाद 6 ज पर चोटी के साथ ई-selectin के ऊपर के विनियमन चलाता है । इसके अतिरिक्त, िकैम-1 6-12 एच के बाद उपचार के लिए विनियमित है । यद्यपि हम VCAM-1 की उंमीद के ऊपर ध्यान नहीं दिया था, यह आमतौर पर प्राथमिक मानव गर्भनाल endothelial कोशिकाओं (HUVECs) में मनाया जाता है । हम रातोंरात पाया (12 एच) TNFα उपचार ल्युकोसैट आसंजन परख के लिए सबसे सुविधाजनक हो ।

इष्टतम hiPSC-ईसीएस पृथक्करण को एक एकल-कक्ष निलंबन मुक्त कक्ष के झुरमुट में परिणाम चाहिए । चित्र 2c इंजेक्शन के बाद इष्टतम hiPSC-ईसी घनत्व सही दिखाता है । आमतौर पर, इंजेक्शन के बाद 15 मिनट, hiPSC-ईसीएस चैनल के नीचे करने के लिए देते हैं और प्रसार करने के लिए शुरू (चित्रा 2d). इंजेक्शन के बाद 1 ज, hiPSC-ईसीएस फार्म चैनल के साथ एक अच्छी तरह से फैल monolayer और प्रवाह परख (चित्रा 2E) शुरू करने के लिए तैयार हो जाएगा ।

फ्लोरोसेंट अनुरेखक के साथ ल्यूकोसाइट्स के लेबल स्वचालित छवि ठहराव में चरण इसके विपरीत छवियों के लिए फायदेमंद है, क्योंकि यह सेल पहचान कदम आसान बनाता है, विशेष रूप से क्योंकि ल्यूकोसाइट्स ईसीएस के monolayer का पालन करें और यह अक्सर मुश्किल है विभिंन प्रकार के कक्ष भेद करने के लिए सॉफ़्टवेयर ।

मुक्त खुला स्रोत छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर अनुयाई ल्यूकोसाइट्स के स्वचालित ठहराव के लिए बहुत उपयोगी है । यहां प्रोटोकॉल में वर्णित पाइप लाइन प्राथमिक वस्तु की पहचान पर आधारित है ल्यूकोसाइट्स की फ्लोरोसेंट छवियों के अनुकूली थ्रेसहोल्ड का उपयोग (चित्रा 4a) । एक न्यूनतम क्षेत्र के आधार पर की पहचान की वस्तुओं के साथ ही इस तरह के सेल मलबे, autofluorescence या किसी भी अन्य गैर विशिष्ट फ्लोरोसेंट संकेत (चित्रा 4c, घ) के रूप में झूठी पहचान की वस्तुओं, बाहर फिल्टर फ़िल्टर ।

आठ समानांतर चैनलों के साथ एक microfluidic चिप दो स्वतंत्र समूहों की तुलना की अनुमति देता है, उदाहरण के लिए, ईसीएस स्वतंत्र hiPSCs से विभेदित, जैसे स्वस्थ दाताओं या आनुवंशिक विकारों के साथ रोगियों. अतिरिक्त नियंत्रण, जैसे अनुपचारित ईसीएस, या एक िकैम-1 अवरुद्ध एंटीबॉडी के साथ पूर्व उपचार के रूप में अच्छी तरह से10,11शामिल किया जा सकता है । दो से तीन microfluidic चिप्स एक समय में संसाधित किया जा सकता है । निष्कर्ष की मजबूती के लिए, स्वतंत्र दिनों पर निष्पादित तीन स्वतंत्र जैविक प्रयोगों की एक ंयूनतम सिफारिश की है ।

Figure 1
चित्रा 1 : hiPSC-ईसीएस और ल्यूकोसाइट्स के प्रवाह की परख के लिए तैयारी । (क) hiPSC-ईसीएस के समर्थक भड़काऊ उत्तेजना (TNFα) के साथ पूर्व उपचार । (ख) hiPSC-ईसीएस एंजाइमी पृथक्करण, केंद्रापसारक, और पुनर्निलंबन का योजनाबद्ध निरूपण । (ग) चैनल की कोटिंग के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (सी, बाएं), hiPSC के इंजेक्शन-ईसी निलंबन (सी, मध्य) और सेल संस्कृति माध्यम इसके अलावा microfluidic चिप में hiPSC-ईसीएस लगाव के बाद । (घ) ल्युकोसैट धुलाई कदम के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, फ्लोरोसेंट डाई DiOC6 और resuspension के साथ लेबलिंग । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : hiPSC-ईसीएस के साथ Microfluidic चिप । (a) Microfluidic चिप में 10 सेमी पेट्री डिश । (ख) humidified की मशीन के लिए इस्तेमाल किया चैंबर । (सी, डी, ई) hiPSC के प्रतिनिधि छवियां-microfluidic चैनल 0 मिनट में ईसीएस (सी), 15 मिनट (डी), इंजेक्शन के बाद 1 एच (ई) । स्केल बार = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : लाइव सेल इमेजिंग और ल्युकोसैट छिड़काव परख के प्रायोगिक सेटअप । (A, B) फोटो (क) और योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (ख) लाइव सेल इमेजिंग और प्रवाह परख के प्रायोगिक सेटअप के: (1)-घुड़सवार लाइव इमेजिंग चैंबर (5% CO2, ३७ ° c, humidified), (2)-microfluidic पंप, (3)-8-चैनल के साथ औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप कई गुना, (4)-माइक्रोस्कोप नियंत्रण और छवि अधिग्रहण के लिए पीसी, (5)-microfluidic पंप नियंत्रण के लिए पीसी । (ग) 8 चैनल के डाला टयूबिंग के साथ Microfluidic चिप कई गुना एक प्लेट धारक में तय की और माइक्रोस्कोप की मोटर की अवस्था में घुड़सवार । (घ) प्रवाह परख के प्रमुख कदमों का योजनाबद्ध निरूपण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : छवि विश्लेषण और अनुयाई ल्यूकोसाइट्स का स्वचालित पता लगाने । (क) ल्यूकोसाइट्स की पहचान के लिए निर्दिष्ट सेटिंग्स के साथ छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के संवाद खिड़की । (ख) न्यूनतम स्वीकार्य सतह क्षेत्र (SAंयूनतम = ७० पिक्सल) के आधार पर पहचान की वस्तुओं के निर्दिष्ट फ़िल्टरिंग मानदंडों के साथ छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर के संवाद खिड़की । (ग) ल्यूकोसाइट्स की सही पहचान के उदाहरण और छोटे सतह क्षेत्र (एसए) के गैर विशिष्ट वस्तुओं की फ़िल्टरिंग (पिक्सेल (Min, Max) = (9, 15) में ठेठ व्यास; फ़िल्टरिंग मानदंड SAंयूनतम = ७० पिक्सल) । स्वीकार किए जाते है वस्तुओं में चित्रित किया गया है हरे और त्याग वस्तुओं बैंगनी रंग में चित्रित कर रहे हैं । (घ) ठेठ व्यास (पिक्सेल (Min, Max) = (3, 15) में ठेठ व्यास की गलत रेंज के कारण ल्यूकोसाइट्स की गलत पहचान का उदाहरण; फ़िल्टरिंग मानदंड SAंयूनतम = ७० पिक्सल) । स्वीकार किए जाते है वस्तुओं में चित्रित किया गया है हरे और त्याग वस्तुओं बैंगनी रंग में चित्रित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रोटोकॉल इस तरह के TNFα के रूप में समर्थक भड़काऊ उत्तेजनाओं के साथ hiPSC-चुनाव आयोग के उपचार के लक्षण वर्णन, hiPSC को ल्युकोसैट आसंजन के कार्यात्मक आकलन-प्रवाह परख में ईसीएस लाइव इमेजिंग और स्वचालित अनुयाई ल्यूकोसाइट्स की गिनती का उपयोग ।

लंबी उपस्थिति है कि आम तौर पर एक सक्रिय समर्थक भड़काऊ phenotype में ईसीएस इंगित करता है में TNFα परिणामों के साथ hiPSC-ईसीएस की रात उत्तेजना । अनुकूलन चरण के दौरान, ई-selectin की अभिव्यक्ति का स्तर, िकैम-1, VCAM-1 FACs द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए7,8, और प्राथमिक मानव नाल नस ईसीएस (HUVECs) सकारात्मक नियंत्रण के रूप में शामिल किया जा करने के लिए सलाह दी जाती है.

इष्टतम hiPSC-ईसीएस पृथक्करण और बीज घनत्व तक पहुंचने के लिए एक धाराप्रवाह monolayer प्राप्त करने के लिए बनाने के बिना सेल के झुरमुट और चैनल रोकना चाहिए । यह छिड़काव से पहले ल्यूकोसाइट्स सही स्थगित करने के लिए महत्वपूर्ण है क्रम में कोशिका वर्षा से बचने के लिए और एक निरंतर एकाग्रता बनाए रखने जब प्रत्येक चैनल परख । मानव परिधीय रक्त ल्यूकोसाइट्स, जैसे monocytes और न्यूट्रोफिल इस्तेमाल किया जा सकता है, या स्थापित monocytic सेल लाइनों, जैसे THP-1 या एचएल-६० एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

microfluidic सेटअप और प्रवाह परख के दौरान विधानसभा के दौरान, यह microfluidic टयूबिंग और चैनलों में फंस जा रहा है के रूप में वे hiPSC की टुकड़ी में परिणाम कर सकते है से हवा के बुलबुले को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है-ईसीएस और/ तरल पदार्थ से द्रव इंटरफेस या microfluidic सेटअप की तैयारी के दौरान अतिरिक्त धुलाई कदम के शामिल करने के लिए हवाई बुलबुले को रोकने में मदद कर सकता है ।

यह सलाह है कि प्रोटोकॉल दो ऑपरेटरों द्वारा चलाया जाता है जहां एक कोशिकाओं को तैयार करता है और दूसरा microfluidic प्रणाली और प्रवाह परख तैयार । यह सुनिश्चित करता है कि ईसीएस microfluidic चिप्स में एक स्थिर समय के भीतर चढ़ाया-खिड़की प्रसंस्करण से पहले कर रहे है और सटीकता और परिणामों की reproducibility में सुधार । इसके अलावा, यह भी परिणाम में पूर्वाग्रह से बचने के लिए अंधा कर रही है प्रयोगों की स्थापना की अनुमति देता है ।

स्वचालित छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन के साथ सफल सेल पता लगाने के लिए, यह एक उच्च संकेत करने के लिए शोर अनुपात के साथ ध्यान में छवियों को प्राप्त करने के लिए और सेल के झुरमुट जैसे गैर विशिष्ट वस्तुओं के autofluorescence से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । महत्वपूर्ण महत्व की पहचान की जानी चाहिए कि अनुयाई ल्यूकोसाइट्स के ठेठ आकार की ंयूनतम और अधिक से अधिक सीमा का सही विनिर्देश है । एक ImageJ में एक लाइन माप उपकरण का उपयोग कर ल्यूकोसाइट्स के ठेठ आकार का अनुमान लगा सकते हैं । उदाहरण के लिए, हमारे विश्लेषण में, हमने 9 – 15 पिक्सेल की श्रेणी का उपयोग किया जो 10.3 – 17.1 µm (figure 4c) के भौतिक आकार से मेल खाती है. जब एक गलत रेंज का उपयोग कर, उदाहरण के लिए, 3-15 पिक्सल (3.4-17.1 µm), एक एकल ल्युकोसैट एक सेल के रूप में नहीं पहचाना जाता है, बल्कि इसके उपभाग अलग वस्तुओं (चित्रा 4d) के रूप में पहचाने जाते हैं । इससे पहचाने जाने वाले ऑब्जेक्ट्स की संख्या गलत हो जाती है.

ल्यूकोसाइट्स से कम तीव्रता और छोटे सतह क्षेत्र के कई ऑब्जेक्ट्स दिए गए अनुकूली थ्रेशोल्ड विधि का उपयोग कर पाया जा सकता है । यह autofluorescence या किसी अंय गैर विशिष्ट फ्लोरोसेंट संकेतों के कारण जगह ले सकता है । फिर भी, इन गैर विशिष्ट वस्तुओं, अगर उनके क्षेत्र में एक एकल ल्युकोसैट के ठेठ क्षेत्र से कम है, ंयूनतम स्वीकार किए जाते है सतह क्षेत्र (चित्र 4c) को परिभाषित करके फ़िल्टर किया जा सकता है ।

प्रवाह परख यहां वर्णित एक चुनाव आयोग monolayer को ल्युकोसैट आसंजन के प्रत्यक्ष मूल्यांकन की अनुमति देता है, इन दो प्रकार के सेल के संपर्क elucidating, लेकिन खाते में अंय प्रकार की कोशिकाएं, pericytes कि संवहनी दीवार में मौजूद है और यह भी हो सकता है के रूप में नहीं ले करता है ल्युकोसैट extravasation15के विनियमन में भाग लेते हैं । अंय प्रकार के सेल के साथ एक 3 डी संस्कृति microenvironment घालमेल प्रणाली की शारीरिक प्रासंगिकता में सुधार कर सकता है । इन सीमाओं के बावजूद, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के आकलन के लिए प्रवाह परख यहां वर्णित hiPSC-ईसीएस के मूल लक्षण वर्णन और रोग मॉडलिंग अनुप्रयोगों के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक निंनलिखित अनुदान स्वीकार करना चाहते हैं: यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERCAdG ३२३१८२ STEMCARDIOVASC); नीदरलैंड अंग पर चिप पहल, शिक्षा, संस्कृति और नीदरलैंड के सरकार के विज्ञान मंत्रालय (024.003.001) द्वारा वित्त पोषित एक NWO गुरुत्व परियोजना ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vena8 Endothelial+ biochip Cellix Ltd V8EP-800-120-02P10
Mirus Evo Nanopump Cellix Ltd MIRUS-EVO-PUMP 1 x syringe pump;
1 x VenaFluxAssay Software;
1 x tubing kit;
power supply and cables.
8-channel manifold MultiFlow8 Cellix Ltd MIRUS-MULTIFLOW8
Humidified box Cellix Ltd HUMID-BOX
Fluorescence imaging system Leica AF6000 Leica Microsystems
Electron-multiplying charge-coupled device camera Hamamatsu C9100
Biological safety cabinet/laminar flow-hood Cleanair
CO2 cell-culture incubator Panasonic MCO-170AICUV
Centrifuge Hitachi himac-CT6EL
Handheld pipetman (P-10 (10 mL), P-200 (200 µL), P-1000 (1,000 µL) Gilson international 4807 (10µl), 4810 (200µl), 4809 (1000µl)
Sterile plastic pipette Greiner Bio-One 606180 (5ml), 607180 (10ml)
Petri dish VWR/ Duran Group 391-0860
Culture flasks (75 cm2) CELLSTAR 658,170
Centrifuge tube (15 mL) CELLSTAR 188271
Name Company Catalog Number Comments
Gelatin from porcine skin, type A Sigma-Aldrich G1890
Fibronectin (Bovine plasma) Sigma-Aldrich F1141
DPBS, no calcium, no magnesium Life Technologies 14190-169
Human Endothelial-SFM Life Technologies 11111-044
Human VEGF 165 IS, premium grade Miltenyi Biotec 130-109-386
Human FGF-2, premium grade Miltenyi Biotec 130-093-842
Platelet-poor Plasma Derived Serum, bovine Biomedical Technologies BT-214
Recombinant Human TNF-α Tebu-bio 300-01A-A
TrypLE Select Life Technologies 12563029
DiOC6(3) Sigma-Aldrich 318426
RPMI 1640 Medium Life Technologies 21875-034
2-Mercaptoethanol (50 mM) Life Technologies 31350010
FBS Life Technologies 10270-106
L-glutamine Life Technologies 25030-024
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Life Technologies 15070-063
Distilled water Life Technologies 15230-089
Ethanol absolute Merck 1.00983.2500
VCAM-1 R&D systems FAB5649P
E-Selectin R&D systems BBA21
ICAM-1 R&D systems BBA20
Name Company Software version Comments
Cellrofiler CellProfiler 2.1.1
VenaFluxAssay Software Cellix Ltd 2.3.a

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १४१ मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पंन endothelial कोशिकाओं (hiPSC-ईसीएस) भड़काऊ प्रतिक्रियाओं ल्यूकोसाइट्स प्रवाह आसंजन परख microfluidics लाइव इमेजिंग
मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल के लिए ल्युकोसैट आसंजन के आकलन के लिए Microfluidic परख-व्युत्पंन Endothelial कोशिकाओं (hiPSC-ईसीएस)
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Halaidych, O. V., van den Hil, F., Mummery, C. L., Orlova, V. V. Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs). J. Vis. Exp. (141), e58678, doi:10.3791/58678 (2018).

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